用MspI鉴定人MTHFR基因多态性rs2274976的试剂盒

摘要

用MspI鉴定人MTHFR基因多态性rs2274976的试剂盒，包含：扩增人MTHFR基因多态性rs2274976位点附近序列的正向引物和反向引物，其中，所述正向引物在其3’末端倒数第一位碱基与rs2274976多态碱基相邻，倒数第二位为错配碱基C，以便在扩增产物中与多态G等位基因形成CCGG结构，所述的正向引物为SEQ ID NO：1或者SEQ NO：11，反向引物为SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：7或SEQ NO：12；所述的试剂盒还包括限制性内切酶MspI或HpaII；并且所述试剂盒还包括用于实施鉴定的说明书。该试剂盒操作简单，成本低，使用范围广。

权利要求

1.一种用于鉴定人MTHFR基因多态性rs2274976的试剂盒，包含：扩增人MTHFR基因多态性rs2274976位点附近序列的正向引物和反向引物，其中，所述正向引物在其3’末端第一位碱基与rs2274976多态碱基相邻，第二位为错配碱基C，以便在扩增产物中与多态G等位基因形成CCGG结构，所述的正向引物为SEQ ID NO:1或者SEQ NO：11，反向引物为SEQ ID NO:2、SEQ ID NO：7或SEQ NO：12；所述的试剂盒还包括限制性内切酶MspI或HpaII；

并且所述试剂盒还包括用于实施鉴定的说明书。

2.根据权利要求1的试剂盒，其中限制性内切酶为MspI。

3.根据权利要求1的试剂盒，其中所述的正向引物为SEQ ID NO:1，反向引物为SEQ ID NO:2。

4.根据权利要求1的试剂盒，其中所述的正向引物为SEQ ID NO:1，反向引物为SEQ ID NO：7。

5.根据权利要求1的试剂盒，其中所述的正向引物为SEQ ID NO:11，反向引物为SEQ ID NO：12。

说明书

用MspI鉴定人MTHFR基因多态性rs2274976的试剂盒

[0001] 本申请是申请号为“200910227637.3”、申请日为2009年12月24日、发明名称为“鉴定人MTHFR基因多态性rs2274976的方法”的发明专利申请的分案申请。

技术领域

[0002] 本发明涉及鉴定单核苷酸多态性的方法。更具体地，本发明涉及鉴定人MTHFR基因多态性rs2274976的方法。

背景技术

[0003] SNP(单核苷酸多态性)是指单个核苷酸的改变引起的DNA序列变异，包括单碱基的置换、插入和缺失等形式。SNP现已广泛用于简单和复杂疾病的遗传连锁分析、关联分析及疾病易感基因的定位，指导易感基因克隆。聚合酶链式反应-限制性片断长度多态(PCR-RFLP)技术是一种快速、简便、准确、低成本检测SNP基因型的经典方法。该方法原理是：限制性内切酶是一类识别DNA特异位点(通常4～6bp)，并在特异位点进行切割的酶类。酶切位点的特异性意味着对特定DNA等位基因的完全消化会产生同样的片段序列。而碱基的替换或插入、缺失可以产生或消除一个特定酶切位点，从而改变酶切割后产生片段的大小和数目。这些酶切片段带型的不同称为限制性片段长度多态性。如果SNP产生和消除了某个限制性内切酶位点，则可以通过对PCR产物进行酶切、电泳加以检测。该方法主要优点在于操作简便，快速，终点判断准确。主要缺点在于酶切位点的选择，并不是所有的SNP位点都可以使用该方法来鉴别，且部分内切酶价格昂贵。

[0004] 5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶(5，10-methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)是一种重要的叶酸代谢酶，体内催化5，10-亚甲基四氢叶酸还原为体内最主要的甲基供体5-甲基四氢叶酸，具有重要的生理功能。目前研究发现编码该蛋白的基因缺陷与动脉硬化性血管阻塞性疾病密切相关，还是胎儿神经管畸形及癌症发生的遗传因素。人MTHFR基因定位于染色体1P36.3，该基因第十二外显子A/G碱基变异可引起第594位氨基酸变异(Gln/Arg)，文献中常记为1793A/G多态，该多态可能影响MTHFR的功能。美国国立卫生研究院国立医学图书馆生物信息技术中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)可查阅MTHFR基因及其多态序列和相关信息，该多态在SNP数据库中编号为rs2274976。因此，通常该多态在人群中存在三种MTHFR基因的基因型：GG型(人体基因组rs2274976多态位点的两个等位基因碱基均为G)，AG型(人体基因组rs2274976多态位点的两个等位基因碱基分别为G和A)和AA型(人体基因组rs2274976多态位点的两个等位基因碱基均为A)。

[0005] 目前人MTHFR基因多态rs2274976的鉴定常采用PCR-RFLP方法。目前鉴定人MTHFR基因多态rs2274976时常使用内切酶BsrBI进行鉴定，该内切酶的价格昂贵(关于部分内切酶的参考价格可以参考后面的表1)，影响了实验的费用，难以在实验室中普及使用。并且由于传统PCR-RFLP方法的固有缺陷，本领域技术人员通常难以选择其他限制性内切酶对人MTHFR基因多态rs2274976进行鉴定。

[0006] 因此，本领域存在对操作简单，成本低，使用范围广的新型检测SNP的方法的需求。

发明内容

[0007] 本发明提供了一种操作简单，成本低，使用范围广的鉴定人MTHFR基因多态性rs2274976的方法，其包括以下步骤：

[0008] a)提供待测人基因组DNA；

[0009] b)使用扩增人MTHFR基因多态性rs2274976位点附近序列的正向引物和反向引物，以所述待测人基因组DNA为模板，进行PCR扩增反应，获得扩增产物；

[0010] c)使用限制性内切酶对所述扩增产物进行酶切，获得酶切产物；以及[0011] d)对所述酶切产物进行电泳，以鉴定人MTHFR基因多态性rs2274976，其中，所述正向引物其3’末端倒数第一位碱基与多态rs2274976碱基相邻，倒数第二位碱基为错配碱基C，以便在扩增产物中与多态G等位基因形成CCGG(第一个碱基C为错配碱基，第三个碱基G为多态等位基因)或ACCGGT(第二个碱基C为错配碱基，第四个碱基G为多态等位基因)结构，或者与多态A等位基因形成CCAGT(第一个碱基C为错配碱基，第三个碱基A为多态等位基因)结构。

[0012] 通过本发明的方法可以通过引物上的错配碱基将SNP附近的序列改变为可被预先确定的限制性内切酶识别的序列，因此，可以克服现有PCR-RFLP方法所存在的需要采用昂贵内切酶的缺陷，进而大大降低了检测SNP的成本。具体而言，由于在该正向引物序列中倒数第二位碱基C为错配碱基(该碱基在人MTHFR基因序列中的相应位置为G)，因此，错配后PCR产物中多态附近序列由AGCGGT或AGCAGT更改为ACCGGT或ACCAGT(其中第二个碱基为错配碱基，第四个碱基为A/G多态位点)，因此扩增产物中G等位基因片段可被识别CCGG序列的限制性内切酶或者识别ACCGGT序列的限制性内切酶识别(即G等位基因片段可被内切酶切开)。同样错配后PCR产物中多态附近序列由GCGGT或GCAGT更改为CCAGT或CCGGT(其中第一个碱基为错配碱基，第四个碱基为A/G多态位点)，因此扩增产物中A等位基因片段可被识别CCAGT序列的限制性内切酶识别(即A等位基因片段可被内切酶切开)。进而，可以根据片段切开情况来判断多态基因型。更具体地，经序列分析可知，基因原始序列中A/G多态可由表1中前四种内切酶识别。如通过碱基错配PCR将多态位点前面第二位碱基G替换为C，则该多态为G等位基因时经PCR扩增后含CCGG序列可被识别CCGG序列的内切酶识别(如MspI、HpaII)，含有ACCGGT序列可被识别ACCGGT序列的内切酶识别(如BsrFI、BsaWI、AgeI)。同样可被上述内切酶的同裂酶(isoschizomer，来源于不同物种但能识别相同DNA序列的限制性内切酶)识别并切开，而A等位基因不能切开。通过碱基错配PCR将多态位点前面第二位碱基G替换为C，则当该多态为A等位基因时该多态经PCR扩增后含CCAGT序列可被识别ACTGG序列(互补序列为CCAGT)的内切酶识别(如BsrI)。同样可被BsrI的同裂酶识别并切开，而G等位基因不能切开。

[0013] 下表1中提供了NEB公司内切酶价格信息(从http://www.neb-china.com获取)作为限制性内切酶识别位点和价格的参考。

[0014] 表1NEB公司几种内切酶识别序列及其价格

[0015]

[0016] 在本发明的一个实施方案中，正向引物由选自下列的核苷酸序列构成：SEQ ID NO：1(ctttgccctg tggattgacc)和SEQ NO：11(tttgccctgtggattgacc)。在本发明的另一个实施方案中，反向引物由选自下列的核苷酸序列构成：SEQ ID NO：2(gcagttgtcc agtgggaagt ca)、SEQ ID NO：7(aatgtgtctt ccaccacctg c) 和SEQ NO：12(tctcgcattc tgggtggg)。正向和反向引物的设计主要考虑引物对PCR扩增的灵敏度、特异度和扩增效率的影响。通常按照碱基互补配对原则设计引物，引物与模板的序列要紧密互补。长度为15-30bp，过短或过长可导致特异性差，过长亦会导致其延伸温度大于74℃而不利于PCR反应。正向引物的确定必须除了上述原则外必须含有倒数第二位末端错配碱基C。正向引物在其3’末端倒数第二位含有错配碱基C，以便在扩增产物中与多态G等位基因形成ACCGGT(第二个碱基C为错配碱基，第四个碱基G为多态等位基因)结构，与多态A等位基因形成CCAGT(第一个碱基C为错配碱基，第三个碱基A为多态等位基因)结构。从而可以被相应的内切酶识别。扩增产物的长度主要是由反向引物所决定的(因为正向引物位于多态位点上游附近，其位置大致已确定)，通常扩增产物长度为100-200bp之间，这样即利于PCR产物扩增，又利于后续的酶切鉴定。否则，如果产物过短则不利于扩增，过长则酶切后片段长度差异较小，不利于分辨。例如，在本发明的一个实施方案中，利用SEQ ID NO：1的核苷酸序列作为正向引物以及SEQ ID NO：2的核苷酸序列作为反向引物的PCR反应可以获得如下扩增产物：

[0017] ctttgccctg tggattgacc rgtggggaaa gctgtatgag gaggagtccc cgtcccgcac 60[0018] catcatccag tacatccacg acaactactt cctggtcaac ctggtggaca atgacttccc 120[0019] actggacaac tgc 133(SEQ ID NO：4)

[0020] 扩增后产物序列中下划线部分分别为正向、反向引物所对应的序列，21bp处r代表A/G多态即SNP位点rs2274976。该扩增产物长度为133bp。经MspI酶切后可出现133bp、114bp(该片段下游序列相比上游序列由于MspI酶切产生粘性末端减少两个单链碱基)、
19bp(该片段下游序列相比上游序列由于MspI酶切产生粘性末端增加两个单链碱基)三种片断(其中19bp电泳图中不能看到)。酶切后基因型判断：GG为114bp，AG有133bp和
114bp两种片段，AA为133bp。

[0021] 对于酶切产物的鉴定，通常使用琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳，基于成本和便利性考虑，使用琼脂糖凝胶电泳更为常见。在本发明中，对于上述133bp的扩增产物，琼脂糖凝胶电泳的条件是将酶切产物在2.5％-4％琼脂糖凝胶中3-8V/cm条件下，电泳40-80分钟，于紫外灯下拍照鉴定。

[0022] 在本发明的另一个优选实施方案中，所述限制性内切酶选自MspI、HpaII、BsrFI、BsrI、BsaWI、AgeI以及它们的同裂酶，更优选所述限制性内切酶为MspI。这主要是基于成本和切割效率的综合考虑。

[0023] 在本发明中，PCR扩增反应的条件并不受到特别的限制，只要能够获得扩增产物即可。PCR的主要参数-退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶序列的长度。如果PCR退火温度过低则易出现非特异产物，过高则影响扩增产物产量，最终需要凭实验确定。PCR延伸时间根据产物长度确定，通常20s-60s即可。为了能够提高PCR扩增效率，进而进一步提高鉴定效率，在本发明的一个优选实施方式中，所采用的PCR扩增条件是：

[0024] 95℃变性3分钟；

[0025] 35个循环：95℃变性50秒，58℃退火50秒，72℃延伸50秒；以及

[0026] 上述35个循环结束后72℃延伸10min。

[0027] 对于待测DNA的选择，本发明并没有特别的限制。既可以是从人体的体液或者组织获得基因组DNA，还可以是经过预先降解处理的基因组。为了方便实施，通常优选从血液提取的基因组DNA。其中所述的组织包括人体中含有全部或至少MTHFR基因的组织，而与是否表达该MTHFR基因无关。从体液和/或组织中提取DNA的方法是本领域技术人员公知的，并且可以参考常用的分子生物学手册，例如《分子克隆》第2版进行。

[0028] 另外，在本发明还提供了用于鉴定人MTHFR基因多态性rs2274976的试剂盒，其包含：扩增人MTHFR基因多态性rs2274976位点附近序列的正向引物和反向引物，其中，所述正向引物在其3’末端倒数第一位碱基与rs2274976多态碱基相邻，倒数第二位为错配碱基C，以便在扩增产物中与多态G等位基因形成CCGG结构，所述的正向引物为SEQ ID NO：1或者SEQ NO：11，反向引物为SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：7或SEQ NO：12；所述的试剂盒还包括限制性内切酶MspI或HpaII；并且所述试剂盒还包括用于实施鉴定的说明书。

[0029] 如前所述，该试剂盒操作简单，成本低，使用范围广。

[0030] 在本发明的一个实施方案中，正向引物由选自下列的核苷酸序列构成：SEQ ID NO：1(ctttgccctg tggattgacc)和SEQ NO：11(tttgccctgtggattgacc)。在本发明的另一个实施方案中，反向引物由选自下列的核苷酸序列构成：SEQ ID NO：2(gcagttgtcc agtgggaagt ca)、SEQ ID NO：7(aatgtgtctt ccaccacctg c) 和SEQ NO：12(tctcgcattc tgggtggg)。在本发明的另一个实施方案中，所述试剂盒中还包括MspI、HpaII、BsrI、BsrFI、BsaWI、AgeI等限制性内切酶以及它们的同裂酶，这样可以方便对扩增产物的检测。进一步，优选所述限制性内切酶是MspI。这主要是基于限制性内切酶的成本和切割效率的综合考虑。当然，本领域技术人员可以理解，在试剂盒中还可以包括其他成分，例如用于实施鉴定的说明书等。

附图说明

[0031] 图1描述了实施例1中人MTHFR基因(rs2274976)多态PCR产物经MspI酶切后电泳照片。其中M是：DNA分子量标志物；泳道1：GG型样品的电泳结果；泳道2：AA型的电泳结果；泳道3：AG型样品的电泳结果。

具体实施方式

[0032] 下面通过本发明的具体实施方式对本发明的技术方案进行详细描述。其中，需要说明的是，本发明并不以任何方式受限于下面所述的具体实施方式和实施例。

[0033] 下面利用SEQ ID NO：1的核苷酸序列作为正向引物以及SEQ ID NO：2的核苷酸序列作为反向引物作为例子，对本发明的概念进行详细地描述。

[0034] 在本发明一个实施方案中，本发明检测人MTHFR基因多态rs2274976的方法，步骤是：

[0035] 1、提取待测人基因组DNA模板，所述人基因组DNA模板为人体任何部分取得的人基因组DNA；

[0036] 2、PCR扩增基因组DNA，对提取的模板基因组DNA进行PCR扩增，获得含多态附近序列的PCR产物；

[0037] 3、对PCR扩增产物使用限制性内切酶进行酶切反应，得酶切产物；以及[0038] 4、对酶切后的产物进行琼脂糖凝胶电泳，鉴定人MTHFR基因多态rs2274976。

[0039] 下面对各个主要步骤进行详细描述

[0040] (1)引物设计与合成

[0041] 在美国国立卫生研究院国立医学图书馆生物信息技术中心http://www.ncbi.nlm.nih.gov(NCBI)网站查找MTHFR基因序列和SNP信息，确定MTHFR多态位点碱基变异数据；

[0042] 含MTHFR多态rs2274976的部分基因序列(SEQ ID NO：3)：

[0043] cttccctggg cgagagatca tccagcccac cgtagtggat cccgtcagct tcatgttctg 60[0044] gaaggtaaag gagccggggg caagcttgcc ccgcccacct ggaaaaccgt ggggagggat 120[0045] tgggaccaag tcccaagcgt gtgctgaagg ccacactgga cccagccttc agggcacacc 180[0046] cagctctgac tcacccatgt cactgctgat gcagggtgtt tatttctggg caggggtggg 240[0047] aagtgatact ggcagtgggc cttgttctat tccgggaaat gtcctgttga gcagagccct 300[0048] tggagagccc tgttaatctt gcctctgtgt gtgtgtgcat gtgtgcgtgt gtgcgggggt 360[0049] atgtgtgtgt aggacgaggc ctttgccctg tggattgagc rgtggggaaa gctgtatgag 420[0050] gaggagtccc cgtcccgcac catcatccag tacatccacg acaactactt cctggtcaac 480[0051] ctggtggaca atgacttccc actggacaac tgcctctggc aggtggtgga agacacattg 540[0052] gagcttctca acaggcccac ccagaatgcg agagaaacgg aggctccatg accctgcgtc 600[0053] ctgacgccct gcgttggagc cactcctgtc ccgccttcct cctccacagt gctgcttctc 660[0054] ttgggaactc cactctcctt cgtgtctctc ccaccccggc ctccactccc ccacctgaca 720[0055] atggcagcta gactggagtg aggcttccag gctcttcctg g 761[0056] 基因序列中401bp处r代表A/G多态即SNP位点rs2274976；

[0057] 根据上述序列设计引入错配碱基的引物，根据序列情况确定正向和反向引物的位置与长度，具体如下：

[0058] 正向引物序列为5’-CTTTGCCCTGTGGATTGACC-3’(SEQ ID NO：1)，[0059] 反向引物序列为5’-GCAGTTGTCCAGTGGGAAGTCA-3’(SEQ ID NO：2)；

[0060] 其中正向引物序列中倒数第二位碱基C为错配碱基(该碱基在原序列中应为G)，错配后PCR产物中多态附近序列由AGCGGT或AGCAGT(其中第四个碱基为A/G多态)更改为ACCGGT或ACCAGT，因此扩增产物中G等位基因片段可被识别CCGG序列的限制性内切酶或者识别ACCGGT序列的限制性内切酶识别(即G等位基因片段可被内切酶切开)。同样错配后当该多态为A等位基因时PCR扩增后含CCAGT(第三个碱基A为多态)序列可被识别ACTGG序列(互补序列为CCAGT)的内切酶识别。根据片段切开情况判断多态基因型；

[0061] 按照正向引物序列和反向引物序列合成引物，合成所述引物可以使用本领域中公知的方法，例如固相合成法，也可以委托生物工程公司合成并检测正向和反向引物。将合成的正向、反向引物稀释为10μmol/L浓度备用；

[0062] (2)制备PCR扩增产物

[0063] PCR扩增使用15-100μl的反应体系为：2×PCR MIX用量为PCR扩增反应体系体积的一半即7.5-50μl、50-2000ng所述待检测人基因组DNA和10μmol/L正向、反向引物各0.1-10μl，用灭菌双蒸水补充至15-100μl，混匀，即得PCR扩增反应体系；

[0064] 其中，所述的2×PCR MIX是2倍浓度的PCR反应用的混合液制成；

[0065] 将PCR扩增反应体系在94-95℃预变性3-5分钟后；进行30-35个如下循环：94-95℃变性20-60s，50-65℃退火20-60s，72℃延伸20-60s；30-35个循环结束后72℃延伸5-10min，即得PCR扩增产物，其位置相对应含MTHFR多态rs2274976的部分基因序列中碱基381bp-513bp处；

[0066] 扩增后产物序列为(SEQ ID NO：4)：

[0067] ctttgccctg tggattgacc rgtggggaaa gctgtatgag gaggagtccc cgtcccgcac 60[0068] catcatccag tacatccacg acaactactt cctggtcaac ctggtggaca atgacttccc 120[0069] a c t g g a c a a c t g c133bp序列扩增后产物序列中下划线部分为正向、反向引物所对应的序列，21bp处r代表A/G多态即SNP位点rs2274976。

[0070] (3)酶切反应

[0071] 将PCR扩增产物在10-30μl酶切体系中进行酶切反应，所述的10-30μl酶切体系为：2-15μl的PCR扩增产物、识别CCGG序列或者识别ACCGGT序列或者识别CCAGT序列的限制性内切酶1-10U和10×酶切缓冲液占总体积的1/10，灭菌双蒸水补充至10-30μl，混匀，得酶切体系，将酶切体系于37℃水浴4-16小时，即得酶切产物；

[0072] 所述识别CCGG序列的限制性内切酶为内切酶MspI、HpaII及其同裂酶；所述识别ACCGGT序列的限制性内切酶为内切酶BsrFI、BsaWI、AgeI及其同裂酶；所述识别CCAGT序列的限制性内切酶为内切酶BsrI及其同裂酶；根据价格因素选择MspI或HpaII进行酶切鉴定；

[0073] 该多态位点含有G等位基因时PCR产物酶切后可形成切开片段114bp(该片段下游序列因酶切形成粘性末端而比上游序列减少两个碱基)序列(SEQ ID NO：5)：

[0074] crgtggggaa agctgtatga ggaggagtcc ccgtcccgca ccatcatcca gtacatccac 60[0075] gacaactact tcctggtcaa cctggtggac aatgacttcc cactggacaa ctgc 114[0076] 酶切后切开片段114bp序列中下划线部分为反向引物所对应的序列，2bp处代表A/G多态即SNP位点rs2274976；

[0077] 该多态位点含有G等位基因时PCR产物酶切后可形成切开片段19bp(该片段下游序列因酶切形成粘性末端而比上游序列增加两个碱基)序列(SEQ ID NO：6)：

[0078] ctttgccctg tggattgac 19。

[0079] (2)琼脂糖凝胶电泳，确定基因多态性：

[0080] 将酶切产物在3％琼脂糖凝胶中3-8V/cm条件下，电泳40-80分钟，于紫外灯下拍照鉴定，其中，对于不同的基因型，MTHFR位点扩增后出现133bp片断，经酶切后电泳会出现133bp、114bp、19bp三种片断，依据133bp和114bp片段的有无判断来判断基因型：GG型为
114bp一个片段，AG型有133bp和114bp两种片段，AA型为133bp一个片段；经测序鉴定，测序结果和使用现有技术检测所得的结果完全相同。

[0081] 下面是实施本发明的若干实施例。

[0082] 实施例1

[0083] 1 材料与方法

[0084] 1.1主要试剂及仪器

[0085] 试剂：2×PCR mix(MBI公司)，限制性内切酶MspI(MBI公司)，琼脂糖(BBI公司)，引物由上海Sangon公司合成。

[0086] 仪器：9600型PCR仪(PE公司)，微型电泳槽(Pharmacia Biotech，EPS1000)，Gel Doc 2000凝胶成像仪(Bio-RAD公司)。

[0087] PCR产物测序由上海生工生物工程有限公司完成。

[0088] 1.2序列查找及引物设计

[0089] 在NCBI网站查找MTHFR基因序列和SNP信息，结合有关文献确定MTHFR多态位点碱基变异信息，设计引物，具体如下：

[0090] 正向引物序列为5’-CTTTGCCCTGTGGATTGACC-3’(SEQ ID NO：1)，[0091] 反向引物序列为5’-GCAGTTGTCCAGTGGGAAGTCA-3’(SEQ ID NO：2)。

[0092] 1.3从全血标本提取DNA作为待测DNA

[0093] EDTA抗凝管采集人外周血全血血样300μl，使用TIANGEN公司RelaxGene Rlood DNA System血液基因组DNA提取系统(主要成分为细胞裂解液CL、蛋白酶K、缓冲液FG、洗脱缓冲液TB)提取全血基因组DNA为待测人基因组DNA模板：300μl外周血转移至离心管，加入750μl细胞裂解液CL，颠倒混匀5次；10,000r/min离心20秒，倒弃上清液；

[0094] 在离心管中加入150μl的缓冲液混合液，缓冲液混合液是由缓冲液FG与蛋白酶K以体积比100∶1混合制成，涡旋混匀器混匀至溶液无团块；

[0095] 然后，在65℃水浴10min，其间颠倒混匀5次；

[0096] 加入质量浓度为99.9％的异丙醇150μl，颠倒充分混匀至出现丝状或簇状基因组DNA；

[0097] 10,000r/min离心3分钟，倒弃上清液，将离心管倒置在干净的吸水纸上，确保DNA沉淀物在管中；

[0098] 加入质量浓度为70％乙醇150μl，涡旋振荡5秒钟，10,000r/min离心3分钟，倒弃上清液后，再加入质量浓度为70％乙醇150μl，涡旋振荡5秒钟，10,000r/min离心3分钟，倒弃上清液；

[0099] 将离心管倒置在干净的吸水纸上停留5分钟，确保DNA沉淀物在管中；

[0100] 将离心管在室温下静置，干燥至所有的液体挥发干净(至少5分钟)；

[0101] 再加入200μl洗脱缓冲液TB，涡旋振荡5秒，65℃加热10分钟至1小时，加热时，轻弹数次助溶，即得全血基因组DNA。

[0102] 1.4PCR扩增及酶切鉴定

[0103] 人基因组DNA100ng(制备方法如上所述)，每个引物0.2μmol/L，1×PCRmix，灭菌双蒸水补足25μl反应体系。PCR反应条件为首先94℃预变性5min，然后94℃变性30s，根据引物Tm值取59℃退火20s，72℃延伸20s，共30个循环后72℃延伸10min。PCR扩增后，取PCR产物10μl，加入5U内切酶和2μl 10×酶切缓冲液和灭菌双蒸水组成20μl反应体系，37℃水浴中酶切8h后，电泳后于凝胶成像仪观察成像，结果示于图1中。

[0104] 2 结果

[0105] 2.1酶切结果

[0106] 上述酶切产物在3％琼脂糖凝胶8V/cm条件下，电泳40分钟，于紫外灯下拍照鉴定，其中，MTHFR位点扩增后出现133bp片断(以上游序列为准，以下同)，经MspI酶切后可出现133bp、114bp(下游序列相比上游序列由于MspI酶切产生粘性末端减少两个单链碱基)、19bp(下游序列相比上游序列由于MspI酶切产生粘性末端增加两个单链碱基)三种片断(其中19bp电泳图中不能看到)。

[0107] 如图1所示。酶切后基因型判断：GG型为114bp，AG型有133bp和114bp两种片段，AA型为133bp。

[0108] 2.2MTHFR基因多态结果鉴定

[0109] 检测结果发现MTHFR出现GG型、AG型和AA型三种基因型。另外，对MTHFR多态各类型PCR产物进行测序鉴定，测序结果与预期结果完全一致。

[0110] 实施例2外周血全血标本测定人MTHFR基因rs2274976多态：

[0111] 与实施例1的步骤基本相同，只是PCR反应所采用的正向引物是SEQ ID NO：1，反向引物是SEQ ID NO：7，退火温度为59℃，并且所采用的限制性内切酶是HpaII(NEB公司)。

[0112] 结果：

[0113] 所获得的扩增产物序列如下(159bp，SEQ ID NO：8)：

[0114] ctttgccctg tggattgacc rgtggggaaa gctgtatgag gaggagtccc cgtcccgcac 60[0115] catcatccag tacatccacg acaactactt cctggtcaac ctggtggaca atgacttccc 120[0116] actggacaac tgcctctggc aggtggtgga agacacatt 159[0117] MTHFR多态含G等位基因时酶切后可形成140bp产物(SEQ ID NO：9)，序列如下：

[0118] crgtggggaa agctgtatga ggaggagtcc ccgtcccgca ccatcatcca gtacatccac 60[0119] gacaactact tcctggtcaa cctggtggac aatgacttcc cactggacaa ctgcctctgg 120[0120] caggtggtgg aagacacatt 140[0121] MTHFR多态含G等位基因时酶切后可形成19bp产物(SEQ ID NO：10，其与SEQ ID NO：6的序列一致)，序列如下：

[0122] ctttgccctg tggattgac 19[0123] 上述酶切产物在3％琼脂糖凝胶6V/cm条件下，电泳50分钟，于紫外灯下拍照鉴定，其中，MTHFR位点扩增后出现159bp片断，经酶切、电泳出现159bp、140bp、19bp三种片断，基因型判断依据159和140bp片段的有无判断：GG型为140bp，AG型有159bp和140bp两种片段，AA型为159bp。

[0124] 实施例3外周血血凝块标本测定人MTHFR基因rs2274976多态：

[0125] 与实施例1的步骤基本相同，只是采用下面的方法从外周血血凝块标本提取DNA作为待测DNA。另外，PCR反应所采用的正向引物是SEQ NO：11(tttgccctgt ggattgacc)，反向引物是SEQ NO：12(tctcgcattc tgggtggg)，退火温度是58℃。限制性内切酶为MspI(NEB公司)。

[0126] 提取DNA：

[0127] 普通采血管采集人外周血400μl，使用TIANGEN公司RelaxGene Rlood DNA System血液基因组DNA提取系统提取外周血血凝块中基因组DNA为待测人基因组DNA模板；

[0128] 待采血管内血清析出后分离血清，然后按下列步骤进行：

[0129] 将上述采血管中凝血块研磨为匀浆状后置于离心管中，加入750μl细胞裂解液CL，颠倒混匀5次；

[0130] 10,000r/min离心20秒，倒弃上清液；

[0131] 加入150μl缓冲液混合液，缓冲液混合液是由缓冲液FG与蛋白酶K以体积比100∶1混合制成，涡旋混匀器混匀至溶液无团块；

[0132] 然后，在65℃水浴10min，其间颠倒混匀6次；

[0133] 加入质量浓度为99.9％的异丙醇150μl，颠倒充分混匀至出现丝状或簇状基因组DNA；

[0134] 10,000r/min离心3分钟，倒弃上清液，将离心管倒置在干净的吸水纸上，确保DNA沉淀物在管中；

[0135] 加入质量浓度为70％的乙醇150μl，涡旋振荡5秒钟，10,000r/min离心3分钟，倒弃上清液后，再加入质量浓度为70％的乙醇150μl，涡旋振荡5秒钟，10,000r/min离心3分钟，倒弃上清液；

[0136] 将离心管倒置在干净的吸水纸上停留至少5分钟，确保DNA沉淀物在管中；

[0137] 将离心管在室温下静置，干燥至所有的液体挥发干净(至少5分钟)；

[0138] 加入200μl洗脱缓冲液TB，涡旋振荡5秒，65℃加热10分钟至1小时，加热时，轻弹数次助溶，即得外周血血凝块中基因组DNA。

[0139] 结果：

[0140] 所获得的扩增产物序列如下(192bp，SEQ ID NO：13)：

[0141] tttgccctgt ggattgaccr gtggggaaag ctgtatgagg aggagtcccc gtcccgcacc 60[0142] atcatccagt acatccacga caactacttc ctggtcaacc tggtggacaa tgacttccca 120[0143] ctggacaact gcctctggca ggtggtggaa gacacattgg agcttctcaa caggcccacc 180[0144] cagaatgcga ga 192[0145] MTHFR多态含G等位基因时酶切后可形成174bp产物(SEQ ID NO：14)，序列如下：

[0146] crgtggggaa agctgtatga ggaggagtcc ccgtcccgca ccatcatcca gtacatccac 60[0147] gacaactact tcctggtcaa cctggtggac aatgacttcc cactggacaa ctgcctctgg 120[0148] caggtggtgg aagacacatt ggagcttctc aacaggccca cccagaatgc gaga 174[0149] MTHFR多态含G等位基因时酶切后可形成18bp产物(SEQ ID NO：15)，序列如下：

[0150] tttgccctgt ggattgac 18[0151] 上述酶切产物在3％琼脂糖凝胶5V/cm条件下，电泳60分钟，于紫外灯下拍照鉴定，其中，MTHFR位点扩增后出现192bp片断，经酶切、电泳出现192bp、174bp、18bp三种片断，基因型判断依据192和174bp片段的有无判断：GG型为174bp，AG型有192bp和174bp两种片段，AA型为192bp。

[0152] 实施例4人肺组织标本测定人MTHFR基因rs2274976多态

[0153] 与实施例1的步骤基本相同，只是采用下面的方法从肺组织标本提取DNA作为待测DNA。

[0154] 使用手术切除肺组织，酚-氯仿法提取肺组织基因组DNA为待测人基因组DNA模板：

[0155] 将肺组织块解冻，用生理盐水洗去血污，剪取0.1g，玻璃匀浆器研磨碎肺组织后放入1.5ml的第一个离心管中；

[0156] 在第一个离心管中加入1ml DNA提取缓冲液(10mmol/Ltris·Cl2，0.1mol/L EDTA，20μg/ml胰RNA酶，0.5％的十二烷基硫酸钠)混匀，再加入50μl质量浓度为10％的十二烷基硫酸钠，浓度为20mg/ml的蛋白酶K5.0μl，充分混匀后，于56℃保温5h，每2h摇1次；

[0157] 放置到室温，加入饱和酚500μl，颠倒混匀，10000r/min离心10min，分离水相和有机相，吸取上层含核酸的水相置于1.5ml的第二个离心管中；

[0158] 在第二个离心管中加入与管内的含核酸的水相等体积的酚∶氯仿∶异戊醇的混合液，其中，酚∶氯仿∶异戊醇的混合液是由酚∶氯仿∶异戊醇以体积比25∶24∶1混合制成，颠倒混匀，10000r/min离心10分钟，取上层液体转移到1.5ml第三个离心管中；

[0159] 第三个离心管中，加入与管内液体等体积的氯仿∶异戊醇以体积比24∶1混合制成的混合液，颠倒混匀，10000r/min离心10分钟，取上层清液到1.5ml第四个离心管中；

[0160] 在第四个离心管中加入管内清液2.5倍体积的-20℃预冷的无水乙醇，沉淀DNA，得DNA沉淀物；

[0161] 将DNA沉淀物，12000r/min离心10分钟，弃乙醇；

[0162] 再加入-20℃的质量浓度为75％的乙醇洗涤，10000r/min离心5分钟，去乙醇，在55℃下干燥，得干燥的DNA沉淀物；

[0163] 加入100μl灭菌双蒸水溶解干燥的DNA沉淀物，-20℃保存，即得肺组织基因组DNA，备用。

[0164] 结果：

[0165] 所得酶切产物在3％琼脂糖凝胶4V/cm条件下，电泳70分钟，于紫外灯下拍照鉴定，其中，MTHFR位点扩增后出现133bp片断，经酶切、电泳出现133bp、114bp、19bp三种片断，基因型判断依据133bp和114bp片段的有无判断：GG型为114bp一个片段，AG型有133bp和114bp两种片段，AA型为133bp一个片段；经测序鉴定，测序结果和使用现有技术检测所得的结果完全相同。

[0166] 从上述实施例可以看出，本发明针对使用PCR-RFLP鉴定MTHFR多态rs2274976的缺点，即必须使用识别原多态附近序列的内切酶，内切酶选择余地小，价格昂贵等因素。本发明通过设计包含酶切位点的错配引物来克服该缺点。该方法可认为是PCR-RFLP的特殊应用，其原理是根据单碱基突变位点的碱基替代情况设计PCR引物，其中一条引物根据突变位点邻近序列设计，人为引入错配碱基，使得引物3′端和单碱基突变的一种突变型在PCR扩增后形成一个酶切位点，其PCR产物可用类似PCR-RFLP的方法进行分析。由于这种方法应用了引物3′端错配技术，PCR产物进行酶切电泳后即可进行基因型的鉴定工作，因此在实际运用中具有很大的灵活性，且检测方法简单易行，成本低，酶切结果易分辨，是一种进行基因型鉴定的较好方法。本发明通过改进实验方法，重新设计新的引物扩增该多态序列，使扩增产物中该基因多态附近序列改变，能够应用其他内切酶进行鉴定，从而可以选择更为廉价的内切酶完成检测。

[0167] 已经对本发明进行了详细地描述，要指出的是，上述仅是本发明的实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，本领域技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述公开的技术内容作出修改获得等同的技术效果，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，进而仍属于本发明技术方案的范围内。