一种用于动物个体身份识别和/或肉产品溯源的条形码编制方法及其应用

摘要

本发明属于分子生物学领域，公开了一种用于动物个体身份识别和/或肉产品溯源的条形码编制方法及其应用。一种用于动物个体身份识别和/或肉产品溯源的条形码编制方法，选择待识别动物或待溯源肉产品基因组DNA上的高杂合度的SNP位点并组合成SNP条形码，然后用十种阿拉伯数字0～9随机唯一的替代SNP条形码中的10种SNP基因型：A/A、T/T、G/G、C/C、A/T、A/G、A/C、T/G、T/C、G/C，形成相应的数字条形码，实现动物个体身份与条形码的一一对应。本发明通过设计PCR引物，获得高杂合度的SNP位点，编制用于动物个体身份识别和/或肉产品溯源的SNP条形码及/或相应的数字条形码，实现动物个体身份识别或肉产品溯源。

权利要求

1.一种用于动物个体身份识别和/或肉产品溯源的条形码编制方法，其特征在于选择待识别动物或待溯源肉产品的基因组DNA上的高杂合度SNP位点并组合成SNP条形码，然后用十种阿拉伯数字0~9随机唯一的替代SNP条形码中的 10种SNP基因型：A/A、T/T、G/G、C/C、A/T、A/G、A/C、T/G、T/C、G/C，形成相应的数字条形码，实现动物个体身份与条形码的一一对应；所述的高杂合度的SNP位点是根据GenBank登录的猪基因组DNA序列设计引物对1~7，以猪基因组DNA为模板，进行PCR扩增，扩增产物测序，并筛选杂合度大于等于0.1的SNP位点；其中所述的引物对1的正向引物为SEQ ID No.1，反向引物为SEQ ID No.2；

所述的引物对2的正向引物为SEQ ID No.3，反向引物为SEQ ID No.4；所述的引物对3的正向引物为SEQ ID No.5，反向引物为SEQ ID No.6；所述的引物对4的正向引物为SEQ ID No.7，反向引物为SEQ ID No.8；所述的引物对5的正向引物为SEQ ID No.9，反向引物为SEQ ID No.10；所述的引物对6的正向引物为SEQ ID No.11，反向引物为SEQ ID No.12；所述的引物对7的正向引物为SEQ ID No.13，反向引物为SEQ ID No.14。

2.根据权利要求1所述的条形码编制方法，其特征在于根据权利要求1所述的条形码编制方法，其特征在于分别用0、1、2、3、4、5、6、7、8、9依次替代SNP条形码中的 10种SNP基因型：A/A、T/T、G/G、C/C、A/T、A/G、A/C、T/G、T/C、G/C。

3.一种猪个体身份识别或猪肉产品溯源方法，其特征在于包括备份猪样本，待识别猪个体或待溯源的猪肉产品与对应的备份猪样本同时按照权利要求1所述的方法制作SNP条形码和/或相应的数字条形码并进行比对，从而确认猪个体身份或猪肉产品来源。

4.根据权利要求3所述的猪个体身份识别或猪肉产品溯源方法，其特征在于所述的猪样本为猪毛发毛囊或组织样本或血样。

说明书

一种用于动物个体身份识别和/或肉产品溯源的条形码编

制方法及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于分子生物学领域，涉及一种用于动物个体身份识别和/或肉产品溯源的条形码编制方法及其应用。

背景技术

[0002] 猪肉是我国居民消费的最主要肉类产品，我国也是生产和消费猪肉量最大的国家。食品安全近年频发，已成为舆论焦点。建立可靠的猪肉产品溯源系统，实现猪场到餐桌全程双向可追溯，对兽药残留、瘦肉精、重金属滥用等问题猪肉生产的遏制，传染性疾病，特别是人畜共患病传染性疾病的切断及处理，市场消费信心的培育，养猪业的健康发展等，起至关重要的作用。

[0003] 猪肉产品溯源的技术方法很多，由于技术简单、低成本及实际操作简易，目前大都采用耳标等标签溯源技术，但缺点是标签易丢失、受损、易混淆，易在猪活体、胴体和猪肉产品间分离，且缺乏可信度。DNA溯源技术基于基因组DNA的遗传与变异，目前用于肉产品溯源技术主要是AFLP、SSR及SNP三种。其中，SNP（single-nucleotide polymorphism，单核苷酸多态性）标记是第三代溯源技术。SNP是指同一物种不同成员间或同一个体的成对染色体在同一基因组DNA位点上出现的单个核苷酸之间的变异。例如，如果来自不同个体的同一基因组位点DNA片段序列分别为AAGCCTA和AAGCTTA,则此段DNA片段序列就存在一个SNP位点，等位基因为C和T。几乎所有常见的SNP均只有两个等位基因，但就个体而言，其成对染色体可能为不同的等位基因。因此，群体中一个常见的SNP位点通常存在三种基因型。以上述SNP为例，其群体中存在的基因型一般为C/C（个体的两条染色体上的等位基因均为C）、T/T（个体的两条染色体上的等位基因均为T）和T/C（个体的两条染色体上的等位基因分别为C和T）。相对而言，基因编码区比非编码区在进化上存在更大的压力，因此SNP通常出现在非编码区。由于种群的地理隔绝，可导致SNP在不同种群中的频率不同，一个在某个地理种群或种族中常见的SNP等位基因可能极少出现在另一个种群或种族内。再者，SNP是可遗传的变异中最常见的一种，具有分布广、密度高的特点，基因组DNA中平均约每1000bp，甚至高突变区段每200-300bp就存在1个SNP位点，因此，SNP常被开发为DNA指纹，用于动物的个体身份认证，因此研发猪个体身份识别或猪肉产品溯源的SNP条形码及相应的数字条形码意义重大。

发明内容

[0004] 本发明的目的提供一种用于动物个体身份识别和/或肉产品溯源的条形码编制方法。

[0005] 本发明的另一目的在于提供利用该方法编制的条形码。

[0006] 本发明的又一目的是提供该条形码编制方法的应用。

[0007] 本发明的目的可通过如下技术方案实现：

[0008] 一种用于动物个体身份识别和/或肉产品溯源的条形码编制方法，选择待识别动物或待溯源肉产品的基因组DNA上的高杂合度的SNP位点并组合成SNP条形码，然后用十种阿拉伯数字0～9随机唯一的替代SNP条形码中的10种SNP基因型：A/A、T/T、G/G、C/C、A/T、A/G、A/C、T/G、T/C、G/C，形成相应的数字条形码，实现动物个体身份与SNP条形码以及数字条形码的一一对应。

[0009] 所述的高杂合度SNP位点优选杂合度大于等于0.1的SNP位点。

[0010] 所述的高杂合度SNP位点是根据GenBank登录的待识别动物或待溯源肉产品的基因组DNA序列设计引物，以待识别动物或待溯源肉产品基因组DNA为模板，进行PCR扩增，扩增产物测序，并筛选杂合度大于等于0.1的SNP位点。

[0011] 所述的动物优选猪，所述的肉产品优选猪肉。

[0012] 所述的猪或猪肉产品的基因组DNA上的高杂合度的SNP位点优选根据GenBank登录的猪基因组DNA序列设计引物对1～7，以猪基因组DNA为模板，进行PCR扩增，扩增产物测序，并筛选杂合度大于等于0.1的SNP位点；其中所述的引物对1的正向引物为SEQ ID No.1，反向引物为SEQ ID No.2；所述的引物对2的正向引物为SEQ ID No.3，反向引物为SEQ ID No.4；所述的引物对3的正向引物为SEQ ID No.5，反向引物为SEQ ID No.6；所述的引物对4的正向引物为SEQ ID No.7，反向引物为SEQ ID No.8；所述的引物对5的正向引物为SEQID No.9，反向引物为SEQID No.10；所述的引物对6的正向引物为SEQ ID No.11，反向引物为SEQ ID No.12；所述的引物对7的正向引物为SEQ ID No.13，反向引物为SEQ ID No.14。

[0013] 数字条形码与SNP条形码的对应关系可以是用0、1、2、3、4、5、6、7、8、9依次分别替代SNP条形码中的10种SNP基因型：A/A、T/T、G/G、C/C、A/T、A/G、A/C、T/G、T/C、G/C，也可以是其它的随机且唯一的对应编码方式。

[0014] 按照本发明所述的条形码编制方法获得的用于动物个体身份识别和/或肉产品溯源的SNP条形码和/或相应的数字条形码。

[0015] 本发明所述的SNP条形码和/或相应的数字条形码，可应用于但不仅限应用于在家养和/或野生生物个体身份识别和/或家养动物肉产品溯源；优选应用于猪个体身份识别或猪肉产品的溯源。

[0016] 一种猪个体身份识别或猪肉产品溯源方法，包括备份猪样本，待识别猪个体或待溯源的猪肉产品与对应的备份猪样本同时按照本发明所述的方法制作SNP条形码和/或相应的数字条形码并进行比对，从而确认猪个体身份或猪肉产品来源。

[0017] 所述的猪样本优选猪毛发毛囊或组织样或血样。

[0018] 有益效果：

[0019] DNA溯源技术主要包括AFLP、SSR及SNP等多种形式，其中SNP是由基因组DNA单个核苷酸的变异所引起的基因组DNA序列的多态性，动物基因组中平均每1000bp就存在一个SNP，高变区每200-300bp就存在一个SNP，因此编制SNP条形码，是一种有效识别动物个体身份或溯源肉产品的遗传学方法。以猪（共19对染色体）为例，假如一对引物仅只扩增1个SNP位点，那么针对19条染色体的19对引物扩增的19个SNP位点组成的SNP条形码就可以用于识别11亿头猪（319=1162261467）的个体身份或对其肉产品溯源。实际上，针对高突变区的一对引物可扩增出多个SNP位点，虽然这些SNP位点存在连锁，但由于祖代突变的逐步积累，可扩增多个SNP位点的引物可区分多种基因型组合。以我们已获得的7对引物为例（实施例1），7对引物扩增的41个SNP位点形成的SNP条形码可用于近500万头猪的个体身份识别或猪肉产品溯源，即9×11×7×20×3×10×12=4989600头猪（7对引物扩增的且可用于个体身份识别或猪肉产品溯源的SNP位点分别是4、4、3、10、1、6、13个，可以区分的基因型组合分别是9、11、7、20、3、10、12种）。特别提出的是，7对引物中最佳的1对引物的扩增产物可以区分20种基因型组合，如果以此引物计算，生产中只需要4对不同的引物就可以实现8万头猪的个体身份识别或猪肉产品的溯源（204=80000头猪），完全可以满足规模猪场的猪个体身份识别或猪肉产品的溯源。

[0020] 本发明针对猪不同染色体，特别是染色体上的高突变区段，设计并筛选可有效且特异进行PCR扩增的引物对，优化的引物对1～7所扩增的产物直接测序结果易读（测序色谱图背景干净，序列阅读无歧义），筛选并获得高杂合度的SNP位点，构建猪个体身份及猪肉产品溯源的条形码，实现猪个体身份识别及猪肉产品溯源。规模猪场或屠宰场可以采集毛发毛囊或组织样或血样，制作猪肉产品条形码，也可以备份所有出售或待屠宰猪样本（毛发毛囊或组织样或血样），通过对待识别猪个体或待溯源的猪肉产品与备份猪样本分别制作条形码进行比对，可确认猪个体身份或猪肉产品来源。同时，条形码编制方法可以用于种猪的个体身份识别，以用于行政管理部门的种猪（良种）登记档案库建设；也同样可以用于其它家养和野生生物个体身份识别及家养动物肉产品的溯源。

附图说明

[0021] 图1引物对1扩增产物直接测序结果中的+171SNP位点（T/C）

[0022] 图2引物对2扩增产物直接测序结果中的+211SNP位点（A/G）

具体实施方式

[0023] 实施例1江苏省农业科学院六合基地猪场96头猪个体条形码的制作

[0024] 1.1基因组DNA模板制备

[0025] 拨取5月龄左右的猪（共96头猪，为7头种公猪、12头种母猪所生。其中，1-9、10-17、18-24、25-32、33-37、38-46、47-50、51-54、55-66、67-77、78-87、88-96分别为全同胞）猪毛数根5（含毛囊），并剪短至1.5cm，插入装有8.8μl DNA MiniExtract（南京润邦生物技术有限公司）的PCR管中（毛囊端朝下并浸入MiniExtract），PCR管置PCR仪中95℃5min，
16℃5min，加入1.2μl蛋白酶K（10mg/ml），55℃2hr或以上，95℃10min，16℃1min，离心上清作PCR模板。

[0026] 1.2PCR扩增

[0027] 引物设计：分别根据GenBank中登录号为AF327369、AF034974、AF473820、X68247、AJ251197、AF038553、M29939的基因设计引物对1～7，详见表1。

[0028] 反应体系（20μl）：双蒸水13.1μl、25mM Mg2+2.0μl、10×Buffer 2.0μl、5mM dNTP 0.8μl、5μM正反向游引物各1.0μl、Taq酶0.1μl、基因组DNA模板1.0μl。

[0029] 反应条件：95℃先变性2min；95℃变性30s，退火（不同引物退火温度不同，见表1）30s，72℃延伸（不同引物延伸时间不同，见表1），共35个循环；72℃最后延伸10min。各引物对退火温度及72℃延伸时间见表1。

[0030] 各引物退火温度、时间及72℃延伸时间如下：

[0031] 表1用于PCR扩增的各引物序列及相应的退火温度和延伸时间

[0032]

[0033] 1.3PCR产物测序

[0034] 1％琼脂糖凝胶确认扩增产物条带清晰可辨后，PCR产物直接测序。

[0035] 1.4条形码编制

[0036] 根据PCR产物直接测序结果，共获得41个杂合度≥0.1的SNP位点。这些SNP位点以引物1-7的次序依次排列（其中每对引物获得的SNP位点以5’-至3’-顺序依次排列）组合成SNP条形码。条形码中的SNP位点基因型（A/A、T/T、G/G、C/C、A/T、A/G、A/C、T/G、T/C、G/C共10种）依次由0、1、2、3、4、5、6、7、8、9共十种阿拉伯数字代替，形成相应的数字条形码（表2）。数字条形码中的：

[0037] ①第1-4位数字依次由引物对1的扩增产物的+171、+211、+350和+419位点基因型代码组成（以正向引物的第1个碱基所在位置计为+1）；

[0038] ②第5-8位数字依次由引物对2的扩增产物的+104、+329、+345、+475位点基因型代码组成（以正向引物的第1个碱基所在位置计为+1）；

[0039] ③第9-11位数字依次由引物对3的扩增产物的+212、+329、+467位点基因型代码组成（以正向引物的第1个碱基所在位置计为+1）；

[0040] ④第12-21位数字依次由引物对4的扩增产物的+72、+74、+331、+375、+450、+472、+478、+563、+668、+737位点基因型代码组成（以正向引物的第1个碱基所在位置计为+1）；

[0041] ⑤第22位字母或数字依次由引物对5的扩增产物的+115位点基因型代码组成（以正向引物的第1个碱基所在位置计为+1）；

[0042] ⑥第23-28位字母或数字依次由引物对6的扩增产物的+129、+209、+252、+316、+400、+435位点基因型代码组成（以正向引物的第1个碱基所在位置计为+1）；

[0043] ⑦第29-41位字母或数字依次由引物对7的扩增产物的+60、+94、+105、+126、+143、+150、+163、+181、+191、+197、+202、+211、+212位点基因型代码组成（以正向引物的第1个碱基所在位置计为+1）。

[0044] 1.5编制的96头猪个体身份的数字条形码如表2：

[0045] 表2江苏省农业科学院六合基地猪场96头猪个体身份的数字条形码

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