一种分泌抗人β-actin蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞及其制备方法

摘要

本发明公开了一种分泌抗人β-actin蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞，通过在大肠杆菌中原核表达人β-actin融合蛋白，以纯化的人β-actin蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠。经过细胞的融合及筛选获得能稳定分泌抗人β-actin蛋白McAb的杂交瘤细胞，命名为2B4。对McAb的特异性、稳定性和适用范围进行了鉴定，融合蛋白的相对分子质量为43kDa，可溶于8M尿素。杂交瘤细胞上清的抗体效价为1×105，腹水的抗体效价为1×107。Westernblot结果显示，单克隆抗体识别人、鼠、兔和鱼的β-actin蛋白，与其发生特异性反应。2B4分泌的单克隆抗体可以广泛的应用于细胞生物学和免疫学试验，具有良好的应用价值。

权利要求

1.一种分泌抗人β-actin蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞，其是保藏号为CGMCC 5908的杂交瘤细胞，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

2.权利要求1所述的杂交瘤细胞在制备抗人β-actin蛋白单克隆抗体中的应用。

说明书

一种分泌抗人β-actin蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞及

其制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，其涉及一种杂交瘤细胞，具体涉及一种分泌抗人β-actin蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞。

背景技术

[0002] Actin即“肌动蛋白”是一种中等大小的蛋白质，外观呈哑铃状，由一个高度保守的基因编码375个氨基酸组成。单体肌动蛋白的相对分子质量为43kDa，有三个结合位点，其中一个是ATP结合位点。肌动蛋白不仅是细胞骨架的主要组成部分，而且还构成了肌细胞中具有收缩功能的组织。肌动蛋白对于细胞活动起到很大的作用，比如细胞的转移和分裂，原生质体的流动，动物胞囊和器官的运动，细胞间信息的传递，以及细胞的形态的建立等（Sellers JR.Fifty years of contractility research post sliding filament hypothesis[J].Journal of muscle research and cell motility,2004,25(6):475-482；Winograd-Katz SE,Brunner MC,Mirlas N,Geiger B.Analysis of the signaling pathways regulating Src-dependent remodeling of the actin cytoskeleton[J].European journal of cell biology,2011,90(2-3):143-156.）。Actin 不 仅 存 在于细胞质中，而且越来越多的证据表明Actin在细胞核中也具有重要的作用（Primal de Lanerolle,Leonid Serebryannyy.Nuclear actin and myosins:Life without filaments[J].Nature cell biology,2011,13(11):1282-1288.）。除了线虫类精子细胞，在所有的真核细胞当中均发现有肌动蛋白存在。在生物分子演化过程中，肌动蛋白是被高度保留下来的蛋白质分子之一，从藻类细胞到人体细胞肌动蛋白只有不到20%的变化（Berepiki A,Lichius A,Read ND.Actin organization and dynamic s in filamentous fungi[J].Nature review microbiology,2011,9(12):876-87.）。Actin可以分为6种，β-actin和γ-non-muscle actin广泛分布于各种组织中，其余4种具有不同肌肉组织特异性。β-actin在肌细胞中占总蛋白的10%,即使在非肌细胞中，肌动蛋白也占细胞总蛋白的1%～5%。β-actin在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白表达水平的变化时常用它来做参照物。

发明内容

[0003] 针对现有技术的不足，本发明人经过反复试验，利用原核重组表达技术，表达出的人β-actin蛋白主要以包涵体的形式存在，可溶于8M尿素。电洗脱纯化后的人β-actin蛋白具有很高的纯度，Western blot实验显示该蛋白具有很强的免疫反应性。纯化后的人β-actin蛋白免疫BALB/c小鼠，通过杂交瘤技术，筛选到10株分泌抗人β-actin蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞，对其中1株性质优良的杂交瘤细胞进行生物学特性鉴定。本发明杂交瘤细胞的优良特性是现有技术中的杂交瘤细胞不可比拟的，对反应的物种具有广谱性，而对β-actin蛋白具有特异性，即对包括人、鼠、兔和鱼的β-actin蛋白均具有优良的反应特异性。

[0004] 本发明所要解决的技术问题是提供一种分泌抗人β-actin蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞，其分泌的单克隆抗体可以广泛的应用于细胞生物学和免疫学试验，具有良好的应用价值。

[0005] 本发明提供的技术方案是：一种分泌抗人β-actin蛋白单克隆抗体（McAb）的杂交瘤细胞，其是保藏号为CGMCC 5908的杂交瘤细胞，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

[0006] 该杂交瘤细胞已于2012年3月13日为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC所保藏（保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），其保藏号为CGMCC5908，经检测存活。该细胞是圆形的半贴壁细胞（用弯管可以将细胞从瓶壁上吹下来，收集细胞不需要胰酶消化，如果有细胞悬浮存在也是正常），细胞分裂倍增的时间是16-18小时。

[0007] 同时，本发明还提供所述杂交瘤细胞的制备方法，其步骤如下：

[0008] （1）将人β-actin蛋白与弗氏完全佐剂充分乳化，采用皮下免疫方法，以每只50μg的剂量免疫6只6～8周龄BALB/c小鼠；

[0009] （2）两周后进行第2次免疫，将人β-actin蛋白与弗氏不完全佐剂充分乳化，采用与步骤（1）中同样的剂量和方法加强免疫BALB/c小鼠；

[0010] （3）2周和4周后分别进行第3次和第4次免疫，免疫剂量与方法同第2次免疫；

[0011] （4）融合前3d用不加佐剂的人β-actin抗原，采用皮下加强免疫，每只剂量为100μg；

[0012] （5）融合前1d用不加佐剂的人β-actin抗原加强免疫，每只剂量50μg；

[0013] （6）小鼠断尾进行尾尖采血，4℃，4000g离心5min，取上清，间接ELISA法检测血清效价，选取血清效价大于1,000,000的小鼠准备进行细胞融合试验；

[0014] （7）选择生长状态良好的SP2/0骨髓瘤细胞与免疫小鼠的脾脏细胞以1:5～1:10混合，1500g离心5min，弃上清；

[0015] （8）轻摇离心管使细胞均匀分散，缓缓加入1mL 37℃预热的PEG 1500并轻轻混匀1.5min，然后加入20mL 1640培养基；

[0016] （9）800g离心5min后弃上清，细胞中加入含有20%血清的HAT-1640培养基并混匀；

[0017] （10）将混匀细胞均匀铺于96孔板中，在37℃，CO2浓度为5%的细胞培养箱中培养5～7d后观察融合效果并换液；

[0018] （11）换液后第4d用间接ELISA方法检测杂交瘤细胞上清液，选择阳性值高且细胞集落数目少的孔，通过有限稀释法进行亚克隆，每孔细胞数目理论值为1～2个；

[0019] （12）经过3～4次亚克隆后，即获得能够稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株。

[0020] 所述的杂交瘤细胞可用于制备抗人β-actin蛋白单克隆抗体。

[0021] 本发明具有以下有益效果：

[0022] 本发明人通过在大肠杆菌中原核表达人β-actin融合蛋白，以纯化的人β-actin蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠。经过细胞的融合及筛选获得能稳定分泌抗人β-actin蛋白McAb的杂交瘤细胞，命名为2B4。采用间接ELISA和Western blot方法对McAb的特异性、稳定性和适用范围进行鉴定。结果显示：融合蛋白的相对分子质量为5 7
43kDa，可溶于8M尿素。杂交瘤细胞上清的抗体效价为1×10，腹水的抗体效价为1×10。
间接ELISA结果表明，杂交瘤细胞在体外传20代或冻存3个月后，分泌的抗体效价不变。
37℃保存24h后，抗体的效价开始下降。Western blot结果显示，单克隆抗体识别人、鼠、兔和鱼的β-actin蛋白，与其发生特异性反应。2B4分泌的单克隆抗体可以广泛的应用于细胞生物学和免疫学试验，具有良好的应用价值。

附图说明

[0023] 图1.人β-actin基因的PCR扩增与表达载体的酶切鉴定，其中，图1A：从cDNA PCR扩增人β-actin基因，lane M:DNA相对分子质量标准，lane 1：空白对照，lane 2：人β-actin PCR产物；图1B：表达载体pTO-T7-β-actin的酶切鉴定，lane M:DNA相对分子质量标准，lane 1：pTO-T7-β-actin的Nde I/EcoR I双酶切电泳。

[0024] 图2.人β-actin融合蛋白的原核表达与鉴定，其中，图2A:表达蛋白的SDS-PAGE图谱，lane M：蛋白质相对分子质量标准，lane 1：阴性对照菌株蛋白，lane 2,3：诱导表达的重组菌株蛋白；图2B:表达蛋白的Western blot图谱。lane M：蛋白质相对分子质量标准，lane 1：阴性对照菌株蛋白，lane 2,3：诱导表达的重组菌株蛋白。

[0025] 图3.人β-actin融合蛋白的纯化，其中，图3A：SDS-PAGE分析重组人β-actin蛋白的表达体形式及其在尿素中的溶解性，lane M：蛋白质相对分子质量标准，lane 1：细胞破碎后悬液，lane 2：细胞破碎离心后上清，lane 3：细胞破碎离心后沉淀，lane 4-6：2mol/L,4mol/L,8mol/L尿素溶解人β-actin包涵体；图3B：SDS-PAGE分析电洗脱纯化后蛋白的纯度，Lane M:蛋白质相对分子质量标准，lane 1:第一次电洗脱蛋白，lane 2:第二次电洗脱蛋白。

[0026] 图4.杂交瘤细胞上清和小鼠腹水抗体纯化后的SDS-PAGE，其中，图4A：细胞上清经过硫酸铵分级沉淀后的SDS-PAGE，lane M：蛋白质相对分子质量标准，lane 1:细胞上清纯化前，lane 2:细胞上清纯化后；图4B：小鼠腹水抗体经过硫酸铵分级沉淀和离子交换后的SDS-PAGE，lane M:蛋白质相对分子质量标准，lane 1:腹水抗体硫胺沉淀纯化后，lane2:腹水抗体离子交换层析纯化后。

[0027] 图5腹水单抗在不同温度下保存的稳定性检测。

[0028] 图6 2B4抗体特异性检测及及对不同动物来源蛋白的免疫反应性，lane ck：空白对照，lane 1，4，6，8和10：抗原分别是HeLa细胞总蛋白，兔脑组织，鼠肾组织，鱼心脏组织和大肠杆菌总蛋白，一抗为15B2单抗，lane 2，5，7，9和11：抗原分别是HeLa细胞总蛋白，兔脑组织，鼠肾组织，鱼心脏组织和大肠杆菌总蛋白，一抗为2B4；lane 3：Hela细胞总蛋白，一抗为Bioworld公司产品。

具体实施方式

[0029] 下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。

[0030] 本实施例所用材料如下：

[0031] 菌种和细胞株：大肠杆菌E.coli Top 10、ER2566菌株由本实验室保存，S/P20小鼠骨髓瘤细胞由厦门大学公共卫生学院夏宁邵教授惠赠。

[0032] 主要试剂：pTO-T7、15B2单克隆抗体、HRP-羊抗鼠由厦门大学夏宁邵教授惠赠；Trizol和反转录试剂盒购自Ferments公司；pMD-18T载体、Taq酶、T4连接酶、EcoR I和Nde I限制性内切酶购自TAKARA公司；DNA胶回收试剂盒与质粒提取试剂盒购自上海生工；
标准β-actin单克隆抗体购自Bioworld公司；蛋白质相对分子质量标准购自Genestar公司；HRP-DAB底物显色试剂盒购自TIANGEN公司；ECL化学发光显色试剂盒购自Thermo公司；PEG1500购自SIGMA公司；1640培养基购自Gibco公司。

[0033] 通过以下方法制备得到分泌抗人β-actin蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞[0034] 1.人β-actin编码序列克隆

[0035] 采用Trizol试剂从HepG2细胞中提取总RNA，取1.0μg质量合格的RNA按Ferments公司反转录试剂盒说明书进行人β-actin cDNA的合成。利用oligo 6.0软件，根据人β-actin基因编码序列设计PCR扩增引物（在上游引物引入Nde I位点，FP：5′CATATGGCTACA TATGGATGATG ATATCGCCG-3′；下游引物引入EcoR I位点，RP：5′-GAATTCACAGA ATTCCTAGAAG CATTTGCGGTG-3′），然后以cDNA为模板扩增人β-actin基因，反应体系为:10×PCR Buffer 2.5μL、dNTPs(10mmol/L)2μL、上下游引物(10μmol/L)各1μL、Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.2μL、cDNA 2μL、去离子水补足25μL。反应条件:94℃ 5min；94℃ 40sec，58℃ 40sec，72℃ 1min 20sec，30个循环；72℃ 10min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定，胶回收PCR产物。回收产物与pMD18-T连接过夜并转化Top10F`感受态细胞，提取重组质粒并送上海生工测序。鉴定序列正确后再亚克隆到表达载体pTO-T7上，通过卡那霉素筛选和EcoR I/Nde I双酶切鉴定重组克隆。

[0036] cDNA经过PCR扩增后，产物用1.5%琼脂糖进行电泳检测，结果在1000bp～2000bp之间发现唯一一条清晰的、大小约为1200bp的DNA条带（图1A），与人β-actin基因理论值大小相符。连接到T载体上后送上海生公测序，结果显示该序列与Genebank中人β-actin基因序列完全一致。然后将人β-actin基因亚克隆到pTO-T7表达质粒中，重组质粒pTO-T7-β-actin经Nde I和EcoR I双酶切和电泳检测后，结果在1200bp位置处观察到DNA条带，说明人β-actin基因已经成功克隆到表达载体上（图1B）。

[0037] 2.目的蛋白诱导表达与产物的Western-blot鉴定

[0038] 挑取筛选的单克隆菌株，接种到5mL LB液体培养基中（含有100μg/mL硫酸卡+那霉素（Kan）37℃培养至OD600值达到0.6，加入终浓度为0.4mmol/L的IPTG进行诱导表达，同时以转化重组表达质粒的菌株不进行诱导作为阴性对照，其它培养条件与实验组一致。37℃诱导培养4h，室温12000g离心10sec离心收集菌体。制备蛋白样品，利用12%的SDS-PAGE分析重组蛋白的表达情况。人β-actin蛋白样品经过电泳后，电转移到PVDF膜上。用含5%的脱脂奶的TBS（100mmol/L Tris·HCl，150mmol/L NaCl，pH7.5）缓冲液封闭
2h。按1:1000的比例用脱脂奶稀释单抗，加入一抗，室温反应2h。用TBST缓冲液（100mmol/L Tris·HCl，150mmol/L NaCl，0.05％Tween-20，pH7.5）洗膜三次，每次10min，加入HRP酶标羊抗鼠，室温反应2h。用TBST洗膜三次，每次10min，用HRP-DAB显色试剂盒显色。

[0039] 将诱导好的重组菌株和对照组菌株制备蛋白样品进行SDS-PAGE检测，结果在人β-actin重组菌株诱导表达的试验组中可以观察到一条相对较粗的蛋白条带，其大小与理论基本一致，而在对照组中没有出现这一条带，说明重组人β-actin蛋白在重组菌株中可能获得了高表达。Western blot结果显示，表达的重组蛋白与Bioworld公司的β-actin鼠源单克隆抗体发生特异性反应，进一步说明人β-actin基因在大肠杆菌中获得了高效表达，而且具有良好的抗原性（图2）。

[0040] 3.目的蛋白大量表达与包涵体蛋白纯化

[0041] 从平板上挑取单菌落接种到50mL LB（Kan+）培养基中培养12h，然后接种1%的重组+菌到2L LB培养基（Kan）中培养。待菌液OD600值达到0.6后加入至终浓度为0.4mmol/L的IPTG进行诱导表达。4h后，室温，12000g离心8min收集菌体。加入100mL裂解液（50mmol/L Tris·HCl，1mmol/L EDTA，100mmol/L NaCl，pH 8.0），10mm探头200W功率超声破碎细胞。
用50mL buffer I（20mmol/L Tris·HCl，5mmol/L EDTA，100mmol/L NaCl）和0.5%TritonX
100-buffer I分别洗涤包涵体2次，然后用50mL buffer I配制的2mol/L、4mol/L、8mol/L的尿素依次溶解包涵体。

[0042] 取包涵体溶解度最大的组分进行大板SDS-PAGE（130mm×180mm×1.5mm），先90V电泳40min，然后120V电泳12h。从胶块中切下目的蛋白条带，置于透析袋后将透析袋与电泳方向垂直放置，100V电洗脱2h后反向电洗脱30sec，重复2次。合并蛋白洗脱液并装入透析袋中，在10倍体积的PBS中每次透析2h，重复透析3次。收集透析蛋白并用SDS-PAGE鉴定蛋白纯度。

[0043] SDS-PAGE检测结果显示目的蛋白主要分布在沉淀中，说明蛋白的表达是以包涵体的形式存在。Bandscan软件分析人β-actin蛋白在沉淀中占到总蛋白的65.8%。洗涤后的包涵体蛋白在2mol/L和4mol/L尿素中只能少量溶解，在8mol/L尿素中溶解量很大，占到8mol/L尿素溶解总蛋白的87.7%（图3A）。人β-actin蛋白经过电洗脱纯化后，在SDS-PAGE电泳图上只观察到一条蛋白条带，说明纯度有了极大的提高，用Bandscan软件分析蛋白的纯度超过了99%。SDS-PAGE结果显示，为了提高蛋白的回收率，需要经过至少两次电泳洗脱，才能得到较高的蛋白回收率（图3B）

[0044] 4.动物免疫与血清效价检测

[0045] 将人β-actin蛋白与弗氏完全佐剂充分乳化，采用皮下免疫方法，以每只50μg的剂量免疫6只6～8周龄BALB/c小鼠。两周后进行第2次免疫，将人β-actin蛋白与弗氏不完全佐剂充分乳化，采用同样的剂量和方法加强免疫BALB/c小鼠。2周和4周后分别进行第3次和第4次免疫，剂量与方法同第2次免疫。在进行第4次免疫后1周检测小鼠血清效价。融合前3d用不加佐剂的人β-actin抗原，采用皮下和四肢加强免疫，每只剂量为100μg。融合前1d用不加佐剂的人β-actin抗原静脉注射加强免疫，每只剂量50μg。

[0046] 小鼠断尾进行尾尖采血，4℃，4000g离心5min，取上清。间接ELISA法检测血清效价，选取血清效价大于1,000,000的小鼠进行细胞融合试验。

[0047] 5.细胞融合、阳性杂交瘤细胞筛选与亚克隆

[0048] 选择生长状态良好的SP2/0骨髓瘤细胞与免疫小鼠的脾脏细胞以1:5～1:10混合，1500g离心5min，弃上清。轻摇离心管使细胞均匀分散，缓缓加入1mL 37℃预热的PEG1500并轻轻混匀，然后加入20mL 1640培养基。800g离心5min后弃上清，细胞沉淀中加入含有20%血清的HAT-1640培养基并混匀。

[0049] 混匀细胞均匀铺于96孔板中，在37℃，CO2浓度为5%的细胞培养箱中培养5～7d后观察融合效果并换液。换液后第4d用间接ELISA方法检测杂交瘤细胞上清液，选择阳性值高且细胞集落数目少的孔，通过有限稀释法进行亚克隆，每孔细胞数目理论值为1～2个。经过3～4次亚克隆后，即获得能够稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株，将此细胞株部分用于单克隆抗体的生产，部分于液氮罐内冻存。

[0050] 融合7d后通过观察和计算得到本次细胞的融合率为82.1%，融合10d后通过间接ELISA法测得阳性克隆率为32.2%。采用间接ELISA和有限稀释法筛选阳性杂交瘤细胞，经过3～4次亚克隆后，获得了10株能够稳定分泌抗人β-actin蛋白单克隆抗体的细胞株，其中一株抗体的产量高，特异性和反应性表现突出，将其命名为2B4。

[0051] 将2B4细胞株培养，6d后分别收集细胞上清和杂交瘤细胞，杂交瘤细胞免疫小鼠腹腔，约8～10d待小鼠腹水达到一定的抗体滴度后，抽取腹水。杂交瘤细胞培养上清经硫酸铵沉淀后就可以达到很高的纯度（图4A），制备的小鼠腹水分别经过硫酸铵沉淀初步纯化和阴离子交换层析纯化后，抗体蛋白的纯度明显增大，可以很清楚的看到50kDa的重链和25kDa的轻链。通过Bradford法测量腹水单抗纯化前后的蛋白浓度，说明腹水纯化的回收率为23.3%（图4B）

[0052] 6.单克隆抗体的产生及纯化

[0053] 采用小鼠体内诱生腹水的方法生产单克隆抗体。取10只8～10周龄BALB/c小鼠，先腹腔注射无菌石蜡油，每只0.5mL。3d后向腹腔内注入杂交瘤细胞，每只小鼠大约注6
射10 个细胞，8～10d后即开始采集腹水。将采集好的腹水先1:1加入饱和硫酸铵沉淀进行初步纯化，4℃，8000g离心5min后弃上清。用PBS缓冲液（20mmol/L NaCl，2.68mmol/L KCl，10mmol/L Na2HPO4，1.76mmol/L KH2PO4，pH7.4）重悬沉淀，放入10倍体积的PBS缓冲液透析2次，每次2h。4℃，8000g离心10min，收集上清。透析抗体直接用DE-52树脂进行阴离子交换层析纯化，上样后，用5倍柱床体积的PBS继续穿透层析柱，再用5倍柱床体积含有50mmol/L NaCl的PBS进行洗脱。收集PBS洗脱峰抗体，SDS-PAGE鉴定纯化的效果。

[0054] 7.单克隆抗体的效价、特异性及适用范围的鉴定

[0055] 用1μg/mL的人β-actin蛋白包被96孔酶标板，用间接ELISA方法检测纯化抗体效价。以阳性值与阴性值的比值大于2.0的最大抗体稀释倍数确定为抗体效价。结果表5 7
明，杂交瘤细胞培养上清液的抗体效价为1×10，腹水的抗体效价为1×10，腹水效价明显高于上清效价。

[0056] 用HeLa细胞、兔脑组织、鼠肾组织、鱼心脏组织和大肠杆菌的总蛋白作为抗原，戊型肝炎病毒的线性单克隆抗体15B2（LI S,TANG X,SEETHARAMAN J,et al.Dimerization of hepatitis E virus capsid protein E2s domain is essential for virus-host interaction[J].PLoS Pathogens,2009,5(8):e1000537.）作为阴性对照，按《分子克隆实验指南》（J萨姆布鲁克,E.F.弗里奇,T曼妮阿斯蒂.分子克隆实验指南[M].北京：科学出版社（J Sam brooke.E.F.Fritz′s.T.Rasmani Christina o.Molecular cloning:A Laboratory Manual[M],Beijing:Science Press),2002.889-897）的方法进行SDS-PAGE和Western blotting检测，一抗15B2、2B4和Bioworld公司抗体孵育的最终浓度为100ng/mL。结果显示2B4和Bioworld公司的鼠源β-actin单抗都只与HeLa细胞中β-actin蛋白发生特异性反应，而且反应条带特别明显，说明2B4具有高度的特异性和优良的灵敏性。

[0057] 8.杂交瘤细胞系与单抗稳定性的鉴定

[0058] 对2B4分别进行体外传20代和液氮冻存3个月后再复苏处理，间接ELISA检测培养上清中抗人β-actin McAb的效价。腹水单抗分别置于37℃和4℃的环境中。每8h取一次样，测定效价，以-20℃保存的样品作为阳性对照，小鼠血清作为阴性对照。

[0059] 本发明筛选获得的杂交瘤细胞体外传20代后，采用间接ELISA检测细胞上清中单5
克隆抗体的效价，其效价基本保持不变，仍然可以达到1×10。将冻存于液氮中的杂交瘤细胞复苏培养来生产单克隆抗体，结果也发现，冻存3个月后其效价也基本没变，可以达到
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1×10，说明获得的杂交瘤细胞系稳定性好。腹水单抗分别置于37℃和4℃温育24h，其效价与-20℃对照组无差别，超过24h后37℃组的抗体效价才开始有下降（图5）。说明单抗的稳定性好，完全符合商用抗体的货架期稳定性要求，具有良好的应用前景。

[0060] β-actin蛋白是一个非常保守的蛋白，在不同物种之间具有极高的同源性。为了研究2B4的适用范围，用HeLa细胞、兔脑组织、鼠肾组织和鱼心脏组织总蛋白进行免疫印迹实验，同时以大肠杆菌蛋白的空白对照，戊型肝炎病毒单克隆抗体15B2作为阴性抗体对照。Western blot结果表明，2B4单抗能与四种不同动物来源的β-actin蛋白发生特异性反应，即在43kDa处出现特异性显色条带，而空白对照和阴性对照组没有任何条带出现（图6）。在进行免疫印迹实验时，使用的二抗是羊抗鼠IgG，因此还可以判断鼠抗2B4的亚型是IgG型。

[0061] 单克隆抗体技术是20世纪80年代医学中的一项重大突破，它从根本上解决了免[10]疫学中长期存在的特异性、敏感性和重复性差等问题。自1982年Fukushi H 首次制备了的AIV亚型Ｈ4单克隆抗体以来，以其特有的高特异性和灵敏性得到了广泛的应用。影响细胞融合的因素有很多，免疫效果尤为重要，利用纯化后的人β-actin蛋白皮下多位点免疫刺激小鼠的免疫系统。四次皮下免疫后，小鼠血清稀释百万倍的效价仍可明显检测为阳性，随后进行腹腔注射免疫和尾静脉注射免疫，这样就使得小鼠体内的B淋巴细胞保持一种高度活跃的状态。本发明通过动物免疫这一关键步骤的把握，保证了较好的阳性克隆率。细胞融合后生长到孔底面积的1/2～1/3时进行克隆，避免了阳性细胞漏检和染色体丢失情况的发生。采用操作简便的有限稀释法，确保了杂交瘤细胞系的稳定性和抗体分泌效价高的特点。经过4次克隆化，获得的杂交瘤细胞阳性率均为100%。在进行细胞亚克隆时最好使用加有饲养细胞或添加细胞生长因子的HT-1640培养基进行培养，以防杂交瘤细胞在培养过程中因状态不好而死亡。

[0062] 目前，单克隆抗体的纯化方法有很多，如辛酸-硫酸铵法[11]、离子交换层析[12]、亲[13]和层析 、凝胶过滤法及高效液相层析法等。本研究采用先用硫酸铵分级沉淀初步纯化再
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用离子交换层析纯化抗体，纯化后的单抗腹水抗体效价达1×10。杂交瘤细胞培养上清经硫酸铵沉淀后就可以达到很高的纯度，完全可以满足实验室使用要求和商品化要求，因为细胞分泌的主要是单克隆抗体。由于细胞培养血清价格比较高，产生的抗体效价又比较低，因此在生产抗体的过程中，可以先培养一定量的杂交瘤细胞，然后利用小鼠诱导腹水生产抗体，这样生产的抗体不但效价高，而其生产成本可以大大降低。利用Blast对比人与中国仓鼠、草鲤鱼和欧洲兔的β-actin序列，同源性分别为93%、88%和88%。2B4分泌的单克隆抗体能特异性识别这4种生物的β-actin蛋白。2B4分泌的McAb具有较好的广谱适用性，可以广泛用作人、鼠、兔和鱼等基因表达调控研究的内参抗体。杂交瘤细胞系及单抗稳定性检测结果说明，单抗的杂交瘤细胞系和单抗的稳定性都是非常好，长期保存不会使抗体效价降低。多项数据表明2B4分泌的McAb能广泛应用于多种生物和组织的细胞生物学和免疫学试验，具有良好应用前景和商业价值。