灌流显微镜

摘要

本发明公开了一种灌流显微镜，包括观察装置、温度控制系统和设置有入口和出口的微灌流腔；以及至少两个注入速度分别控制的注入注射器，至少一个抽取注射器，所述注入注射器并联后，与微灌流腔的入口连接，所述抽取注射器与微灌流腔的出口连接。可以精确控制微灌流腔内溶液浓度的变化，实现溶液浓度由一种浓度到多种浓度的变化，从而可以测量细胞在周围溶液浓度变化过程中和变化后的体积响应，还可以同步控制微灌流腔内溶液浓度和温度的变化，实现对溶液非平衡冷冻过程或复温融解过程的模拟。

权利要求

1.一种灌流显微镜，其特征在于：

包括观察装置、温度控制系统和设置有入口和出口的微灌流腔；以及至少两个注入速度分别控制的注入注射器，至少一个抽取注射器，所述注入注射器并联后，与微灌流腔的入口连接，所述抽取注射器与微灌流腔的出口连接。

2.根据权利要求1所述的灌流显微镜，其特征在于：所述注入注射器的注入速度和抽取注射器的抽取速度分别由不同的注射泵进行控制。

3.根据权利要求1所述的灌流显微镜，其特征在于：还包括连接在所述注入注射器和微灌流腔入口之间的微混合腔。

4.根据权利要求1所述的灌流显微镜，其特征在于：所述温度控制系统包括冷却模块、加热模块和温度传感器；

通过所述温度传感器对微灌流腔的温度进行检测反馈，控制冷却模块和/或加热模块工作，进行温度控制。

5.根据权利要求4所述的灌流显微镜，其特征在于：所述温度传感器置于所述微灌流腔的部分腔壁中，所述加热模块置于所述温度传感器的相对侧的微灌流腔之上，所述冷却模块置于所述加热模块之上，所述微灌流腔、加热模块及冷却模块由保温材料包裹。

6.根据权利要求5所述的灌流显微镜，其特征在于：放置所述温度传感器的腔壁部分的材料为硅玻璃或聚二甲基硅氧烷或聚酰亚胺或聚甲基丙烯酸甲脂或聚对二甲苯或聚四氟乙烯，其他腔壁部分的材料为聚二甲基硅氧烷或硅玻璃或聚酰亚胺或聚甲基丙烯酸甲脂或聚对二甲苯或聚四氟乙烯。

7.根据权利要求1所述的灌流显微镜，其特征在于：还包括在微灌流腔的内壁上间隔设置的第一档板和第二档板；

所述第一挡板和第二档板将所述微灌流腔分隔为相互连通的第一缓冲腔、微生物材料腔和第二缓冲腔，微生物材料腔位于第一缓冲腔和第二缓冲腔之间，所述第一挡板和第二挡板阻挡微生物材料在微生物材料腔与所述第一缓冲腔和第二缓冲腔之间流动；

所述入口位于所述第一缓冲腔上，所述出口位于所述第二缓冲腔上；

所述微生物材料腔上设置有加载入口和卸载出口。

8.根据权利要求1-7任一项所述的灌流显微镜，其特征在于：所述观察装置包括摄像头，微型计算机，以及位于微灌流腔一侧的聚光镜，透光孔，位于微灌流腔另一侧与聚光镜相对设置的物镜。

说明书

灌流显微镜

技术领域

[0001] 本发明涉及低温生物医学领域，特别涉及一种灌流显微镜。

背景技术

[0002] 在低温生物医学领域，生命材料低温保存过程中的微生物材料损伤是其低温损伤的重要来源。微生物材料可以是细胞、细菌、病毒等一切微生物材料。在下述实施例中重点以细胞为例加以说明。

[0003] 典型的低温保存过程主要包括：(1)低温保存前，低温保护剂的添加；(2)冷冻过程中，降温速率的程序化控制；(3)复温后、临床使用前，低温保护剂的去除。要减少低温损伤，进行低温保存过程的这三个重要步骤的优化设计，需要测定细胞的重要生物物理学参数：例如细胞等渗体积、细胞非渗透性体积、细胞膜对低温保护剂和水的渗透性参数及其活化能等。

[0004] 通常采用灌流显微镜来观测细胞在不同温度下，当低温保护剂溶液组分或浓度发生变化时的体积响应，借助非线性拟合技术拟合出细胞膜对于低温保护剂和水的渗透性参数及其活化能，以及细胞的等渗体积和非渗透性体积等关键参数。在下述实施例中，如无特殊说明所涉及的溶液可为二元、三元或者多元溶液。

[0005] 通常地，灌流显微镜主要包括载物台上的微灌流腔，用于控制微灌流腔内溶液处于低温状态的低温循环浴。一个为微灌流腔注入溶液的注入注射器和一个从微灌流腔内抽取溶液的抽取注射器。通过注入注射器与抽取注射器的配合使用，能够保持微灌流腔内溶液的动态平衡，从而保证微灌流腔内溶液压力的平衡。同时，灌流显微镜还包括一套用于观察微灌流腔内细胞变化的装置，通常地，该装置主要包括聚光镜、透光孔和物镜，光线在聚光镜的汇聚作用下得到加强，经透光孔射入微灌流腔，微灌流腔内细胞的变化情况经物镜放大后被观察到，即可进行数据记录。

[0006] 然而，这种结构的灌流显微镜存在的问题是：

[0007] 由于只有一个注入注射器和一个抽取注射器，便只能实现溶液从一种浓度到另外一种浓度的切换，也即只能测得细胞在这两种不同浓度溶液下的体积响应。想要测量细胞在另外一种溶液浓度下的体积响应，就需要更换一次注入注射器内溶液的浓度，为连续试验带来了很大的不便。

发明内容

[0008] 本发明提供了一种灌流显微镜，技术方案如下：

[0009] 包括观察装置、温度控制系统和设置有入口和出口的微灌流腔；以及至少两个注入速度分别控制的注入注射器，至少一个抽取注射器，注入注射器并联后，与微灌流腔的入口连接，抽取注射器与微灌流腔的出口连接。

[0010] 优选地，注入注射器的注入速度和抽取注射器的抽取速度分别由不同的注射泵进行控制。

[0011] 进一步地，还包括连接在注入注射器和微灌流腔的入口之间的微混合腔。

[0012] 优选地，温度控制系统包括冷却模块、加热模块和温度传感器；通过温度传感器对微灌流腔的温度进行检测反馈，控制冷却模块和/或加热模块工作，进行温度控制。

[0013] 优选地，温度传感器置于微灌流腔的部分腔壁中，加热模块置于温度传感器的相对侧的微灌流腔之上，冷却模块置于加热模块之上，微灌流腔、加热模块及冷却模块由保温材料包裹。

[0014] 优选地，放置温度传感器的腔壁部分的材料为硅玻璃或聚二甲基硅氧烷或聚酰亚胺或聚甲基丙烯酸甲脂或聚对二甲苯或聚四氟乙烯，其他腔壁部分的材料为聚二甲基硅氧烷或硅玻璃或聚酰亚胺或聚甲基丙烯酸甲脂或聚对二甲苯或聚四氟乙烯。

[0015] 进一步地，还包括在微灌流腔的内壁上间隔设置的第一档板和第二档板；第一挡板和第二档板将微灌流腔分隔为相互连通的第一缓冲腔、微生物材料腔和第二缓冲腔，微生物材料腔位于第一缓冲腔和第二缓冲腔之间，第一挡板和第二挡板阻挡微生物材料在微生物材料腔与第一缓冲腔和第二缓冲腔之间流动；入口位于第一缓冲腔上，出口位于第二缓冲腔上；微生物材料腔上设置有加载入口和卸载出口。

[0016] 优选地，观察装置包括摄像头，微型计算机，以及位于微灌流腔一侧的聚光镜，透光孔，位于微灌流腔另一侧与聚光镜相对设置的物镜。

[0017] 本发明提供的技术方案带来的有益效果是：

[0018] 在本发明的实施例中，在微灌流腔的入口端并联接入了两个注入注射器，其注入速度分别控制，这样，通过分别控制这两个注入注射器的注入速度，可以精确控制微灌流腔内溶液浓度的变化，实现溶液浓度由一种浓度到多种浓度的变化，从而可以测量细胞在周围溶液浓度变化过程中和变化后的体积响应。

[0019] 进一步地，通过连接在注入注射器和微灌流腔入口之间的微混合腔，可以预先对溶液进行混合，使得进入微灌流腔的溶液浓度均匀一致，从而保证灌流过程中细胞周围溶液浓度均匀一致。

[0020] 进一步地，采用具有冷却模块和加热模块的温度控制系统，能够精确控制溶液温度的程序化降低或升高及与之同步的浓度变化，可以模拟细胞在冷冻或者复温过程中周围溶液的热力学状态的变化，从而将其用于研究细胞在非平衡冷冻或者复温融解过程中的体积响应，测定低温下细胞膜的生物物理学参数。

[0021] 进一步地，通过微灌流腔内壁上间隔设置的第一挡板和第二档板将微灌流腔分隔为相互连通的第一缓冲腔、微生物材料腔和第二缓冲腔。一方面，可以使溶液在第一缓冲腔内再次混合，使得进入微生物材料腔的溶液浓度更加均匀；另一方面，分隔出专门的微生物材料腔，可以保证微生物材料始终处于观察区域；第三方面，通过在微生物材料腔上设置加载入口和卸载出口，可以方便地进行微生物材料的更换，有利于进行连续多组试验。

附图说明

[0022] 为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图所示实施例得到其他的实施例及其附图。

[0023] 图1是本发明实施例提供的灌流显微镜的结构示意图；

[0024] 图2是本发明实施例提供的灌流显微镜的冷却模块的结构示意图；

[0025] 图3是本发明实施例提供的灌流显微镜的冷却模块的结构示意图；

[0026] 图4是本发明实施例提供的灌流显微镜的微灌流腔的结构示意图。

具体实施方式

[0027] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的具体实施方式作进一步地详细描述。显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动的前提下所得到的所有实施例都属于本发明的保护范围。

[0028] 为了能够连续测量细胞在多种浓度溶液下的体积响应，本发明提出了一种灌流显微镜，包括：观察装置34、温度控制系统35和设置有入口24和出口25的微灌流腔9；以及至少两个速度分别控制的注入注射器26和27；至少一个抽取注射器28；注入注射器26和27并联后，与微灌流腔9的入口24连接；抽取注射器28与微灌流腔9的出口25连接。

[0029] 其中，观察装置34主要用于观察微灌流腔9内的细胞体积响应情况；温度控制系统35根据需要提供合适的试验温度，以保持细胞的存活状态，同时可进行温度调节，实现微灌流腔9内溶液温度按照特定的速率进行动态变化；微灌流腔9用于细胞灌流；入口24既可用于溶液注入，又可用于细胞加载；出口25既可用于溶液抽取，又可用于细胞卸载；通过注入注射器26、27和抽取注射器28的配合使用，可以保证微灌流腔9内溶液流量的动态平衡。

[0030] 通过在注入注射器26和27中添加不同浓度的溶液，并分别设定注入速度，可以在微灌流腔9内得到一定浓度的溶液，改变注入速度可以得到不同浓度的溶液，通过分别控制注入注射器26和27的注入速度可以得到多种不同浓度的溶液。通过观察装置34可以观察到细胞在多种不同浓度溶液下的体积响应。

[0031] 更优选地，在注入注射器26、27和微灌流腔9的入口24之间连接一个微混合腔3。通过微混合腔3对溶液的预先混合作用，使得进入微灌流腔9内的溶液浓度均匀一致，从而保证灌流过程中细胞周围溶液浓度均匀一致。

[0032] 为了使溶液能够更加充分地混合，也可以在注入注射器26、27和微灌流腔9之间串联多个微混合腔3。

[0033] 更优选地，对微灌流腔9内溶液温度进行控制的温度控制系统35包括冷却模块6、加热模块7和温度传感器31。温度传感器31用于检测微灌流腔9内溶液的温度，并将检测到的温度信息进行反馈，以控制冷却模块6和/或加热模块7工作，使溶液温度根据需要升高或降低，实现溶液温度按照特定的速率进行动态变化，以满足试验中不同的温度需要，从而可以准确测定冷冻过程细胞的渗透性参数。

[0034] 其中，温度控制系统35不限于冷却模块6、加热模块7和温度传感器31，也可以由其他能够实现温度控制、调节功能的装置替代，具体可以根据微灌流腔9及观察装置34的结构来配合设置温度控制系统35。

[0035] 更优选地，在微灌流腔9的内壁上间隔设置的第一档板20和第二档板22将微灌流腔9分隔为相互连通的第一缓冲腔19、微生物材料腔21和第二缓冲腔23，微生物材料腔21位于第一缓冲腔19和第二缓冲腔23之间，第一挡板20和第二挡板22阻挡微生物材料在微生物材料腔21与第一缓冲腔19和第二缓冲腔23之间流动；入口24位于第一缓冲腔
19上，出口25位于第二缓冲腔23上；微生物材料腔21上设置有加载入口29和卸载出口
30。

[0036] 微灌流腔9的这种结构设计，一方面，可以使溶液在第一缓冲腔19内再次混合，使得进入微生物材料腔21的溶液浓度更加均匀；另一方面，分隔出专门的微生物材料腔21，可以保证微生物材料始终处于观察区域；第三方面，通过在微生物材料腔21上设置加载入口29和卸载出口30，与溶液入口24和溶液出口25加以区分，可以方便地进行微生物材料的更换，有利于进行连续多组试验。

[0037] 为了更好地理解本发明的技术方案以及有益效果，下面通过实施例对本发明进行更加详细的介绍，实施例只是本发明的优选实施例，本发明并不限于此。

[0038] 图1是本发明实施例提供的灌流显微镜的结构示意图。如图1所示，本发明实施例公开了一种灌流显微镜，包括观察装置34、温度控制系统35和设置有入口24和出口25的微灌流腔9；以及两个速度分别控制的注入注射器26和27；一个抽取注射器28；注入注射器26和27并联后，与微灌流腔9的入口24连接；抽取注射器28与微灌流腔9的出口25连接；在注入注射器26、27和微灌流腔9的入口24之间连接微混合腔3。

[0039] 在本实施例中，两个注入注射器和一个抽取注射器分别由不同的注射泵进行注入速度或抽取速度的控制。具体而言，注射泵1控制注入注射器26的注入速度，注射泵2控制注入注射器27的注入速度，注射泵8控制抽取注射器28的抽取速度，灌流过程中，通常总注入速度和总抽取速度始终保持一致。其中，注射泵对注射器的速度控制可以通过软件编程实现。通过软件编程控制，一方面，可以精确控制注入注射器26和27各自的注入速度，实现溶液浓度的不同配比；另一方面，精确控制总注入速度和总抽取速度始终保持一致，以保持微灌流腔9内的流量处于动态平衡状态，从而确保微灌流腔9内的压力平衡。

[0040] 其中，在入口24处设置入口导管，在出口25处设置出口导管。采用毛细管实现注入注射器26与27之间，以及注入注射器26、27与微混合腔3之间的连接，连接微混合腔3的毛细管通过入口导管与微灌流腔9的入口24相连，连接抽取注射器28的毛细管通过出口导管与微灌流腔9的出口25相连。由于用于连接的毛细管内径很小，优选为0.2～1mm，其内部流体流动为层流，为了增强溶液的混合效果，必须进行强化混合。

[0041] 在本实施例中，冷却模块6为冷循环模块，加热模块7为电热薄膜，温度传感器31为热电偶；微灌流腔9为由上壁、下壁和侧壁围成的空间，热电偶置于微灌流腔9的下壁中，电热薄膜置于微灌流腔9之上，冷循环模块置于电热薄膜之上。在试验过程中为了保证微灌流腔9与外界隔离，防止与外界进行热交换，实现保温作用，将微灌流腔9、电热薄膜及冷循环模块用保温材料32进行封装。为了保证光线能够透过保温材料32、冷循环模块和电热薄膜到达微灌流腔9，需要在其上设置透光孔5，以便光线射入。

[0042] 在本实施例中，微灌流腔9是由两种材料构成的封闭壳体，具体地，上壁和侧壁由PDMS（聚二甲基硅氧烷，polydimethylsiloxane）18制成，下壁由硅玻璃33制成。作为等效变换方式，也可以仅将下壁的一部分用硅玻璃33制成，将热电偶设置于硅玻璃33中，而将微灌流腔9的其余部分腔壁都用PDMS 18制成。

[0043] 由于硅玻璃33与溶液直接接触，且硅玻璃33具有良好的导热性能，将热电偶设置于其中，可以间接检测溶液的温度。PDMS 18是一种透光性良好的材料，光线可以通过PDMS18照射进微灌流腔9；其中，PDMS 18用于构成微灌流腔9的微流体通道的尺寸优选为长
10～150毫米，宽1～10毫米，深5～100微米。

[0044] 在其他的实施例中，微灌流腔9的下壁或下壁上用于放置热电偶的腔壁部分的材料为具有足够硬度、良好的生物相容性和导热性能的透光材料，例如可以是聚二甲基硅氧烷、聚酰亚胺、聚甲基丙烯酸甲脂、聚对二甲苯或聚四氟乙烯等；微灌流腔9的上壁和侧壁部分的材料为具有足够硬度、良好的生物相容性和任意透光的适合于加工微流控芯片的材料，例如可以是硅玻璃、聚酰亚胺、聚甲基丙烯酸甲脂、聚对二甲苯或聚四氟乙烯等。

[0045] 图2和图3是本发明实施例提供的灌流显微镜的冷却模块6的结构示意图。如图2和图3所示，冷却模块6包括两个冷循环单元。其中，第一冷循环单元上设置一个冷却液入口14和一个冷却液出口15，第二冷循环单元上设置一个冷却液入口16和一个冷却液出口17。冷却液入口和出口分别与外部的低温循环浴槽连接，以实现对微灌流腔9内溶液的冷却降温作用。

[0046] 图4是本发明实施例提供的灌流显微镜的微灌流腔的结构示意图。如图4所示，还包括在微灌流腔9的内壁上间隔设置的第一档板20和第二档板22；第一挡板20和第二档板22将微灌流腔9分隔为相互连通的第一缓冲腔19、微生物材料腔21和第二缓冲腔23，微生物材料腔21位于第一缓冲腔19和第二缓冲腔23之间，第一挡板20和第二挡板22阻挡微生物材料在微生物材料腔21与第一缓冲腔19和第二缓冲腔23之间流动；入口24位于第一缓冲腔19上，出口25位于第二缓冲腔23上；微生物材料腔21上设置有加载入口29和卸载出口30。

[0047] 在本实施例中，微灌流腔9内壁上的第一档板20和第二挡板22平行、间隔设置，第一档板20和第二档板22的上端与微灌流腔9的上壁连接，第一档板20和第二档板22的下端与微灌流腔9的下壁之间留有空隙，形成可以供溶液流过而细胞不能通过的流通部。流通部的尺寸可以根据细胞的体积大小进行设置，在本实施例中，流通部的高度尺寸优选为1-10微米。当然，在其他的实施例中，第一挡板20和第二挡板22也可以采用倾斜、间隔设置。

[0048] 在本实施例中，观察装置34包括摄像头13，微型计算机11，以及位于微灌流腔9一侧的聚光镜4，透光孔5，位于微灌流腔9另一侧与聚光镜4相对设置的物镜12。微灌流腔9放置于载物台10上，在正对微灌流腔9上方的位置设置聚光镜4，光线经过聚光镜4的汇聚、加强作用，通过透光孔5到达微灌流腔9，经物镜12的放大作用，再由摄像头13采集到微生物材料的体积变化信息，传递给微型计算机11进行数据记录。摄像头13优选采用CCD（Charge-coupled Device，电荷耦合元件）摄像头，也可以采用其他任何图像采集速度大于10FPS（Frames Per Second，每秒传输帧数）的摄像头。

[0049] 为了更好地理解本发明，下面以采用本发明的灌流显微镜模拟添加、去除低温保护剂过程，并根据细胞体积响应，测定不同温度下细胞膜的渗透性参数为例加以详细说明。其中，低温保护剂通常是含低温保护剂（CPA）的生理盐水或含低温保护剂（CPA）的磷酸盐缓冲液。

[0050] 模拟添加低温保护剂过程，根据细胞的体积响应，测定不同温度下细胞膜的渗透性参数的具体实施过程如下：

[0051] 打开加载入口29，将细胞注入微生物材料腔21，然后封闭加载入口29。在注入注射器26中装入含低温保护剂的溶液，在注入注射器27中装入不含低温保护剂的溶液。在某一时刻，同步启动注入注射器27和抽取注射器28，且控制两者的流速相等，将整个管路和微灌流腔9内充满不含低温保护剂的溶液。通过冷却模块6和加热模块7的协同工作，并通过温度传感器31的温度检测反馈，精确控制微灌流腔9内的溶液温度。待灌流达到稳定状态后，停止注入注射器27，并同时启动注入注射器26，继续以等流速注入，则微灌流腔9内完成了从不含低温保护剂到含低温保护剂溶液的切换，从而实现对细胞模拟添加低温保护剂的过程。通过CCD摄像头13采集细胞的体积变化，并通过微型计算机11记录相关数据，即可得到在某一温度下，添加特定浓度、特定类型低温保护剂过程中细胞的体积响应，进而通过非线性拟合技术，获得细胞的等渗体积、细胞的非渗透性体积和细胞膜对低温保护剂和水的渗透性参数等。

[0052] 通过冷却模块6和加热模块7改变温度，重复上述测试过程，得到至少三个不同温度下，细胞膜对低温保护剂和水的渗透性参数，然后通过数学模型，得到其相关的活化能。

[0053] 模拟去除低温保护剂过程，根据细胞的体积响应，测定不同温度下细胞膜的渗透性参数的具体实施过程，与模拟添加低温保护剂过程的区别是：对调注入注射器26和27的开启顺序即可。

[0054] 进一步地，为了更好地理解本发明，下面以采用本发明的灌流显微镜模拟非平衡冷冻过程和复温融解过程，根据细胞的体积响应，测定细胞在非平衡冷冻过程和复温融解过程中的渗透性参数及其活化能为例进行详细说明。其中，低温保护剂溶液均为水-食盐-低温保护剂三元溶液，溶液的组分由非平衡冷冻过程多元溶液的相图加以确定。

[0055] 模拟非平衡冷冻过程，根据细胞的体积响应，进而测定细胞在非平衡冷冻过程的渗透性参数及其活化能的实施过程如下：

[0056] 在注入注射器26内装入高浓度的低温保护剂溶液，而在注入注射器27内装入低浓度的低温保护剂溶液。打开加载入口29，将细胞注入微生物材料腔21，然后封闭加载入口29。在某一时刻，同步启动注入注射器27和抽取注射器28，且控制两者的流速相等，将整个管路和微灌流腔9内充满低浓度的低温保护剂溶液。通过冷却模块6和加热模块7协同工作，并通过温度传感器31的温度检测反馈，可以精确控制微灌流腔9内溶液的温度。待灌流达到稳定状态后，通过注射泵1和2内的软件编程控制注入注射器26和27的注入速度，实现溶液浓度的变化，从而实现微灌流腔9内溶液浓度严格按照冷冻过程的变化而变化，同时同步控制微灌流腔9内溶液的温度按照实际冷冻过程的降温速率而降低。通过摄像头13采集细胞的体积变化，并通过微型计算机11记录相关数据，即可得到冷冻过程细胞体积随温度的变化，进而使用相关数学模型，通过非线性拟合，可获得在该降温速率下，冷冻过程细胞膜的渗透性参数及其活化能。

[0057] 模拟复温融解过程，根据细胞的体积响应，进而测定细胞在复温融解过程的渗透性参数及其活化能的实施过程，与模拟非平衡冷冻过程的区别是：对调注入注射器26和27的开启顺序即可。

[0058] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。