一种肌氨肽苷提取物及其组合物

摘要

本发明涉及一种含多肽、氨基酸、核苷及核苷酸等药物组合成份的肌氨肽苷提取物及其组合物，其制备包括如下步骤：取兔子心脏和肌肉，去除脂肪，匀浆，抽真空，通入二氧化碳，再抽真空、充气反复2次；将二氧化碳饱和的兔子心脏和肌肉浆分别加入到液体二氧化碳中，搅拌，降温至-80℃，保持6~10h，升温至40~50℃，按照重量比1：3分别取冻融后的兔子心脏和肌肉，分别加入注射用水中，将心脏组织溶液加入弹性蛋白酶，将肌肉组织溶液加入木瓜蛋白酶；合并酶解后的心脏组织溶液和肌肉组织溶液，离心，取上清液，加入0.3倍重量的活性碳，室温下搅拌30min，微孔滤膜过滤既得。所述提取物制备的组合物中还加入赋形剂制成水针、粉针或冻干粉针。

权利要求

1.一种肌氨肽苷提取物，其特征在于，所述提取物的制备方法包括如下步骤：（1）二氧化碳饱和：取兔子心脏和肌肉，去除脂肪，分别匀浆，然后再分别抽真空至5~10Pa，保持压力20~30min，然后分别通入二氧化碳，至压力为15~20MPa，保持压力

20~30min，再抽真空、充气反复2次；

（2）冻融：在转速700~900rpm下，将二氧化碳饱和的兔子心脏和肌肉浆分别缓慢加入到体积分别为兔子心脏和肌肉重量10~15倍的液体二氧化碳中，加入时间为30~40min，加毕，搅拌2h，降温至-80℃，保持6~10h，然后5~10min将温度升温至40~50℃，将二氧化碳气化；

（3）酶解：按照重量比1：3分别取冻融后的兔子心脏和肌肉，分别加入2倍重量的注射用水中，搅拌均匀，分别得心脏组织溶液和肌肉组织溶液，将心脏组织溶液加入重量0.5~1%的弹性蛋白酶，30~40℃下水解0.5~1h；将肌肉组织溶液加入重量1.2~1.8%的木瓜蛋白酶，

40~45℃下水解0.5~1h；

（4）后处理：合并酶解后的心脏组织溶液和肌肉组织溶液，离心，取上清液，加入0.3倍重量的活性碳，室温下搅拌30min，用0.22~0.30μm微孔滤膜过滤既得。

2.根据权利要求1所述的肌氨肽苷提取物，其特征在于，所述方法包括如下步骤：（1）二氧化碳饱和：取兔子心脏和肌肉，去除脂肪，分别匀浆，然后再分别抽真空至

8Pa，保持压力25min，然后分别通入二氧化碳，至压力为18MPa，保持压力25min，再抽真空、充气反复2次；

（2）冻融：在转速800rpm下，将二氧化碳饱和的兔子心脏和肌肉浆分别缓慢加入到体积分别为兔子心脏和肌肉重量13倍的液体二氧化碳中，加入时间为35min，加毕，搅拌2h，降温至-80℃，保持8h，然后7min将温度升温至45℃，将二氧化碳气化；

（3）酶解：按照重量比1：3分别取冻融后的兔子心脏和肌肉，分别加入2倍重量的注射用水中，搅拌均匀，分别得心脏组织溶液和肌肉组织溶液，将心脏组织溶液加入重量0.8%的弹性蛋白酶，35℃下水解0.8h；将肌肉组织溶液加入重量1.6%的木瓜蛋白酶，43℃下水解0.8h；

（4）后处理：合并酶解后的心脏组织溶液和肌肉组织溶液，离心，取上清液，加入0.3倍重量的活性碳，室温下搅拌30min，用0.22μm微孔滤膜过滤既得。

3.根据权利要求1或2所述的肌氨肽苷提取物，其特征在于，步骤（4）所述离心为转速

3000rpm下离心30min。

4.含有权利要求1~3任意一项所述肌氨肽苷提取物的肌氨肽苷组合物。

5.根据权利要求4所述的肌氨肽苷组合物，其特征在于，所述组合物中还加入赋形剂制成水针、粉针或冻干粉针。

6.根据权利要求5所述的肌氨肽苷组合物，其特征在于，所述赋形剂选自甘露醇、右旋糖酐或葡萄糖。

说明书

一种肌氨肽苷提取物及其组合物

技术领域

[0001] 本发明涉及医药领域，具体的说，涉及一种肌氨肽苷提取物及其组合物。

背景技术

[0002] 肌氨肽苷是以哺乳动物心肌为原料，采用现代生物技术提取制成的含有多种血管活性物质的药物，主要成分有心房肽、降钙素基因相关肽、腺苷等。其含有大量的多肽、氨基酸、核苷及核苷酸等成分。心房肽具有较强的利钠、利尿、舒张血管平滑肌和抑制肾素-血管紧张素-醛固酮系统的作用。而降钙素基因相关肽是目前已知的体内最强的舒血管活性肽，是由降钙素基因表达和产生的一种37个氨基酸组成的生物活性多肽，可强烈地扩张血管，具有增加冠脉血流量、增强心肌收缩力、保护缺血心肌等作用。肌氨肽苷可用于治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病、心绞痛、心力衰竭、脑血管疾病、高血压等，作为一种极具潜力的心脑血管药物，临床应用十分广泛。

[0003] 中国专利CN1522757公开了一种肌氨肽苷制备方法。其包括如下步骤：取家兔心肌和肌肉，在5-15℃下，将心肌和肌肉用纯水冲洗至无血色，绞碎；然后加入注射用水匀浆，在-18~22℃冻结20~30小时，再共冻融4~7次；融化后粗滤，滤液加热至80~85℃保持5~8分钟，迅速降温至室温，离心，上清液用微孔滤膜过滤，滤液用超滤膜超滤，既得肌氨肽苷溶液。

[0004] 中国专利CN1824294的方法为，将兔子心肌和肌肉去除结缔组织后，按0.78-0.82：1与注射用水混合，用告诉组织捣碎机匀浆，放入-20℃冰柜冷冻30~50小时，室温下融化，重复1~3次，最后一次融化的组织液于恒温水浴中55℃保持3~4小时，调pH值为
7，加入按组织液于重量1~3g/升的活性碳，煮沸后低温下3000rpm离心30min；上清液调pH值为5.5~6.0，于室温中加入1.5-2g升壳聚糖寡糖，然后调pH值为7.2，用0.22μm微孔滤膜过滤，1万分子量超滤膜超滤得肌氨肽苷溶液。

[0005] 为了提高多肽、次黄嘌呤等成分的提取率，现有技术无一例外的采用了较高温度。但是这种高温提取无疑会破坏其中的有效成分。使得有效成分含量始终难以有显著的提升。

发明内容

[0006] 本发明第一目的在于提供一种肌氨肽苷提取物，本发明的提取物的制备方法避免了高温对肌氨肽苷有效成分的破坏；

[0007] 本发明第二目的在于提供含有所述肌氨肽苷提取物的肌氨肽苷组合物，本发明提供的肌氨肽苷组合物有效成分含量高。

[0008] 为了实现上述的发明目的，本发明采取了如下的技术方案：

[0009] 首先，本发明提供了一种肌氨肽苷的提取物，所述提取物的制备方法包括如下步骤：

[0010] （1）二氧化碳饱和：取兔子心脏和肌肉，去除脂肪，分别匀浆，然后再分别抽真空至5~10Pa，保持压力20~30min，然后分别通入二氧化碳，至压力为15~20MPa，保持压力20~30min，再抽真充气反复2次；

[0011] （2）冻融：在转速700~900rpm下，将二氧化碳饱和的兔子心脏和肌肉浆分别缓慢加入到体积分别为兔子心脏和肌肉重量10~15倍的液体二氧化碳中，加入时间为30~40min，加毕，搅拌2h，降温至-80℃，保持6~10h，然后5~10min将温度升温至40~50℃，将二氧化碳气化；

[0012] （3）酶解：按照重量比1：3分别取冻融后的兔子心脏和肌肉，分别加入2倍重量的注射用水中，搅拌均匀，分别得心脏组织溶液和肌肉组织溶液，将心脏组织溶液加入重量0.5~1%的弹性蛋白酶，30~40℃下水解0.5~1h；将肌肉组织溶液加入重量1.2~1.8%的木瓜蛋白酶，40~45℃下水解0.5~1h；

[0013] （4）后处理：合并酶解后的心脏组织溶液和肌肉组织溶液，离心，取上清液，加入0.3倍重量的活性碳，室温下搅拌30min，用0.22~0.30μm微孔滤膜过滤既得。

[0014] 常规方法提取无法避免高温的使用，如果采用较高温度，则对活性成分破坏严重；如果采用较低温度，提取效率又很差。本发明利用干冰升华导致的体积迅速膨胀，可以有效破坏细胞结构，使得细胞内有效成分提取率得以显著提升。而干冰的低温又使得有效成分得以最大程度的保留。

[0015] 本发明通过抽真空、通入二氧化碳反复多次，可以使得细胞内二氧化碳达到饱和，并最大限度的排除水分，减少了水分和其他气体对于提取的干扰。

[0016] 本发明经过反复研究，发现兔子心脏和肌肉采用不同方法提取，可以更有效地提取出有效成分。

[0017] 根据本发明所述的肌氨肽苷的提取物，优选所述方法包括如下步骤：

[0018] （1）二氧化碳饱和：取兔子心脏和肌肉，去除脂肪，分别匀浆，然后再分别抽真空至8Pa，保持压力25min，然后分别通入二氧化碳，至压力为18MPa，保持压力25min，再抽真充气反复2次；

[0019] （2）冻融：在转速800rpm下，将二氧化碳饱和的兔子心脏和肌肉浆分别缓慢加入到体积分别为兔子心脏和肌肉重量13倍的液体二氧化碳中，加入时间为35min，加毕，搅拌2h，降温至-80℃，保持8h，然后7min将温度升温至45℃，将二氧化碳气化；

[0020] （3）酶解：按照重量比1：3分别取冻融后的兔子心脏和肌肉，分别加入2倍重量的注射用水中，搅拌均匀，分别得心脏组织溶液和肌肉组织溶液，将心脏组织溶液加入重量0.8%的弹性蛋白酶，35℃下水解0.8h；将肌肉组织溶液加入重量1.6%的木瓜蛋白酶，43℃下水解0.8h；

[0021] （4）后处理：合并酶解后的心脏组织溶液和肌肉组织溶液，离心，取上清液，加入0.3倍重量的活性碳，室温下搅拌30min，用0.22μm微孔滤膜过滤既得。

[0022] 根据本发明所述的肌氨肽苷的提取物，优选步骤（4）所述离心为转速3000rpm下离心30min。

[0023] 其次，本发明还提供了一种含有本发明所述肌氨肽苷提取物的肌氨肽苷组合物。

[0024] 根据本发明所述的肌氨肽苷组合物，所述组合物中还加入赋形剂制成水针、粉针或冻干粉针。

[0025] 所述水针、粉针或冻干粉针的制备可以参考现有技术的方法。

[0026] 譬如，将得到的组合物冻结至-30℃以下，抽真空至真空度15Pa以下，升温至-5~0℃，升华干燥，再升温至30~40℃，干燥3小时，分装得到粉针。

[0027] 或者将得到的组合物加入注射用水稀释，分装后得到水针。

[0028] 或者加入步骤（4）得到的组合物重量2倍的甘露醇，加入组合物重量5倍的注射用水，搅拌均匀，分装后降温至-30~-50℃，保温5小时，抽真空至真空度为10Pa，按照1~2℃/小时升温，至0℃，保温2小时，再按5~10℃/小时升温至30~40℃，保温4小时，压塞既得。

[0029] 根据本发明所述的肌氨肽苷组合物，优选所述赋形剂选自甘露醇、右旋糖酐或葡萄糖。

[0030] 本发明所提供的肌氨肽苷组合物有效成分含量高，故治疗效果优于现有技术产品。

具体实施方式

[0031] 以下用实施例对本发明的技术方案作更详细的解释说明，但其并非是对本发明的限制。

[0032] 实施例1

[0033] 二氧化碳饱和：取兔子心脏和肌肉，去除脂肪，分别匀浆，然后再分别抽真空至8Pa，保持压力25min，然后分别通入二氧化碳，至压力为18MPa，保持压力25min，再抽真空、充气反复2次；

[0034] 冻融：在转速800rpm下，将二氧化碳饱和的兔子心脏和肌肉浆分别缓慢加入到体积分别为兔子心脏和肌肉重量13倍的液体二氧化碳中，加入时间为35min，加毕，搅拌2h，降温至-80℃，保持8h，然后7min将温度升温至45℃，将二氧化碳气化；

[0035] 酶解：按照重量比1：3分别取冻融后的兔子心脏和肌肉，分别加入2倍重量的注射用水中，搅拌均匀，分别得心脏组织溶液和肌肉组织溶液，将心脏组织溶液加入重量0.8%的弹性蛋白酶，35℃下水解0.8h；将肌肉组织溶液加入重量1.6%的木瓜蛋白酶，43℃下水解0.8h；

[0036] 后处理：合并酶解后的心脏组织溶液和肌肉组织溶液，离心，取上清液，加入0.3倍重量的活性碳，室温下搅拌30min，用0.22μm微孔滤膜过滤既得。

[0037] 实施例2

[0038] 二氧化碳饱和：取兔子心脏和肌肉，去除脂肪，分别匀浆，然后再分别抽真空至5Pa，保持压力25min，然后分别通入二氧化碳，至压力为16MPa，保持压力28min，再抽真空、充气反复2次；

[0039] 冻融：在转速800rpm下，将二氧化碳饱和的兔子心脏和肌肉浆分别缓慢加入到体积分别为兔子心脏和肌肉重量11倍的液体二氧化碳中，加入时间为35min，加毕，搅拌2h，降温至-80℃，保持7h，然后7min将温度升温至40℃，将二氧化碳气化；

[0040] 酶解：按照重量比1：3分别取冻融后的兔子心脏和肌肉，分别加入2倍重量的注射用水中，搅拌均匀，分别得心脏组织溶液和肌肉组织溶液，将心脏组织溶液加入重量0.9%的弹性蛋白酶，35℃下水解0.5h；将肌肉组织溶液加入重量1.7%的木瓜蛋白酶，40℃下水解0.8h；

[0041] 后处理：合并酶解后的心脏组织溶液和肌肉组织溶液，离心，取上清液，加入0.3倍重量的活性碳，室温下搅拌30min，用0.22μm微孔滤膜过滤既得。

[0042] 实施例3

[0043] 二氧化碳饱和：取兔子心脏和肌肉，去除脂肪，分别匀浆，然后再分别抽真空至8Pa，保持压力22min，然后分别通入二氧化碳，至压力为15MPa，保持压力30min，再抽真空、充气反复2次；

[0044] 冻融：在转速800rpm下，将二氧化碳饱和的兔子心脏和肌肉浆分别缓慢加入到体积分别为兔子心脏和肌肉重量14倍的液体二氧化碳中，加入时间为30min，加毕，搅拌2h，降温至-80℃，保持6h，然后10min将温度升温至50℃，将二氧化碳气化；

[0045] 酶解：按照重量比1：3分别取冻融后的兔子心脏和肌肉，分别加入2倍重量的注射用水中，搅拌均匀，分别得心脏组织溶液和肌肉组织溶液，将心脏组织溶液加入重量1.0%的弹性蛋白酶，39℃下水解0.9h；将肌肉组织溶液加入重量1.2%的木瓜蛋白酶，44℃下水解1.0h；

[0046] 后处理：合并酶解后的心脏组织溶液和肌肉组织溶液，离心，取上清液，加入0.3倍重量的活性碳，室温下搅拌30min，用0.22μm微孔滤膜过滤既得。

[0047] 实施例4

[0048] 二氧化碳饱和：取兔子心脏和肌肉，去除脂肪，分别匀浆，然后再分别抽真空至10Pa，保持压力20min，然后分别通入二氧化碳，至压力为20MPa，保持压力25min，再抽真空、充气反复2次；

[0049] 冻融：在转速900rpm下，将二氧化碳饱和的兔子心脏和肌肉浆分别缓慢加入到体积分别为兔子心脏和肌肉重量13倍的液体二氧化碳中，加入时间为35min，加毕，搅拌2h，降温至-80℃，保持8h，然后7min将温度升温至45℃，将二氧化碳气化；

[0050] 酶解：按照重量比1：3分别取冻融后的兔子心脏和肌肉，分别加入2倍重量的注射用水中，搅拌均匀，分别得心脏组织溶液和肌肉组织溶液，将心脏组织溶液加入重量0.5%的弹性蛋白酶，32℃下水解1.0h；将肌肉组织溶液加入重量1.3%的木瓜蛋白酶，45℃下水解0.5h；

[0051] 后处理：合并酶解后的心脏组织溶液和肌肉组织溶液，离心，取上清液，加入0.3倍重量的活性碳，室温下搅拌30min，用0.22μm微孔滤膜过滤既得。

[0052] 实施例5

[0053] 二氧化碳饱和：取兔子心脏和肌肉，去除脂肪，分别匀浆，然后再分别抽真空至9Pa，保持压力30min，然后分别通入二氧化碳，至压力为18MPa，保持压力20min，再抽真空、充气反复2次；

[0054] 冻融：在转速700rpm下，将二氧化碳饱和的兔子心脏和肌肉浆分别缓慢加入到体积分别为兔子心脏和肌肉重量15倍的液体二氧化碳中，加入时间为40min，加毕，搅拌2h，降温至-80℃，保持10h，然后5min将温度升温至45℃，将二氧化碳气化；

[0055] 酶解：按照重量比1：3分别取冻融后的兔子心脏和肌肉，分别加入2倍重量的注射用水中，搅拌均匀，分别得心脏组织溶液和肌肉组织溶液，将心脏组织溶液加入重量0.7%的弹性蛋白酶，30℃下水解0.8h；将肌肉组织溶液加入重量1.8%的木瓜蛋白酶，43℃下水解0.6h；

[0056] 后处理：合并酶解后的心脏组织溶液和肌肉组织溶液，离心，取上清液，加入0.3倍重量的活性碳，室温下搅拌30min，用0.30μm微孔滤膜过滤既得。

[0057] 实施例6

[0058] 取实施例1得到的组合物，加入组合物重量2倍的甘露醇，加入组合物重量5倍的注射用水，搅拌均匀，分装后降温至-30~-50℃，保温5小时，抽真空至真空度为10Pa，按照1~2℃/小时升温，至0℃，保温2小时，再按5~10℃/小时升温至30~40℃，保温4小时，压塞既得。

[0059] 实施例7

[0060] 取实施例1得到的组合物，加入组合物重量3倍的右旋糖酐，加入组合物重量5倍的注射用水，搅拌均匀，分装后降温至-30~-50℃，保温5小时，抽真空至真空度为10Pa，按照1~2℃/小时升温，至0℃，保温2小时，再按5~10℃/小时升温至30~40℃，保温4小时，压塞既得。

[0061] 试验例1

[0062] 本试验例比较了本发明方法制备的肌氨肽苷组合物与现有技术常规方法制备的有效成分含量比。

[0063] 其中实施例1~5为按照重量比1：3取家兔心脏和肌肉共1kg制备；为了平行对比，对比1~5也按照重量比1：3取家兔心脏和肌肉共1kg制备，并在最后均用注射用水将产品调整到相同体积。

[0064] 检测条件为：

[0065] 仪器:waters1525高效液相色谱仪（2487双通道可调波长紫外检测器）[0066] 色谱柱:C18（3.9×150mm）

[0067] 试剂:磷酸二氢钾（优级纯）

[0068] 甲醇（色谱纯）

[0069] 流动相:磷酸二氢钾（0.001mol/l pH6.9）-甲醇（100：0.2）

[0070] 色谱条件:检测波长：260nm，

[0071] 柱温:32℃

[0072] 流速:1.0ml/min

[0073] 表1组合物中多肽、次黄嘌呤含量（mg/ml）

[0074]产品 实施例1 实施例2 实施例3 实施例4 实施例5
多肽 39.57 38.95 38.14 38.34 39.10
次黄嘌呤 12.54 11.25 10.12 9.97 10.24
产品 对比1 对比2 对比3 对比4 对比5
多肽 27.52 17.95 7.59 7.03 1.75
次黄嘌呤 4.81 1.24 1.25 1.01 0.25

[0075] 其中对比1制备为：按1：3比例取家兔心脏和肌肉，除去脂肪，洗净，加2倍注射