光敏感的功能化固载相及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了光敏感的功能化固载相及其制备方法和应用。本发明首先提供了光敏感的功能化化合物，其结构式为式Ⅰ或式Ⅱ所示。本发明进一步将式Ⅰ或式Ⅱ所示化合物与氨基固相相连得到式Ⅲ或式Ⅳ所示的光敏感的功能化固载相，在寡聚核苷酸的固相合成中，将其作为寡聚核苷酸的ODN的3′端，寡聚核苷酸合成结束后，光照下能够有效地将寡聚核苷酸从固相切除并脱去保护，暴露出对应功能基团连接染料小分子，或通过两端双修饰的产物自身形成环状的寡聚核苷酸。固载率和光切割效率实验结果表明，本发明式Ⅲ或式Ⅳ所示化合物具有较高的固载率和优异的光切割效率，能够应用于寡聚核苷酸的固相合成和功能化。

权利要求

1.光敏感的功能化化合物，其结构式为以下式Ⅰ或式Ⅱ所示：

其中，R1是氢或贰(4-甲氧基苯基)(苯基)甲基；R2是氢；R3是氢；或R2-R3是-OCH2O；

X是氧或氮；Y是碳、氮或硫；Z是CH2或OCH2CH2；m或n为1-6的任意整数；

其中，R1是氢或贰(4-甲氧基苯基)(苯基)甲基；R2是氢；R3是氢；或R2-R3是-OCH2O；

m为1-6的任意整数。

2.光敏感的功能化固载相，其为以下所示的化合物：

R选自DMTr、 其中，DMTr是贰(4-甲氧基苯

基)(苯基)甲基；CPG为多孔玻璃珠。

3.一种合成权利要求1所述式Ⅱ所示化合物中N-{2-[贰(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基]-2-(2-硝基苯基)乙基}4-炔丁酰胺的方法，包括：将N-[2-羟基-2-(2-硝基苯基)乙基]4-炔丁酰胺和贰(4-甲氧基苯基)(苯基)甲基氯溶于吡啶，在室温下反应，即得。

4.一种合成权利要求1所述式Ⅰ所示化合物中1-(2-硝基苯基)-2-(4-炔丁酰胺基)乙基-6-[贰(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基]己基氨基碳酸酯的方法，包括：在无水环境下，1-(2-硝基苯基)-2-(4-炔丁酰胺基)乙基6-羟己基氨基碳酸酯和贰(4-甲氧基苯基)(苯基)甲基氯溶于二氯甲烷，滴加三乙胺，室温下反应，即得。

5.一种合成权利要求1所述式Ⅰ所示化合物中6-[贰(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基]己酸1-(2-硝基苯基)-2-(4-炔丁酰胺基)乙酯的方法，包括：在无水环境下，6-[贰(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基]己酸三乙胺、1，3-二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶溶于二甲基甲酰胺中，在室温下搅拌反应后加入N-[2-羟基-2-(2-硝基苯基)乙基]4-炔丁酰胺，在70℃下继续搅拌反应，即得。

6.一种合成权利要求1所述式Ⅰ所示化合物S-6-[贰(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基]己基-1-(2-硝基苯基)-2-(4-炔丁酰胺基)乙基硫代碳酸酯的方法，包括：在无水环境下，将N-[2-羟基-2-(2-硝基苯基)乙基]4-炔丁酰胺、N,N'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯和4-二甲氨基吡啶溶解于乙腈，在室温下搅拌反应后加入6-巯基己醇，继续搅拌反应，得到S-6-羟己基O-1-(2-硝基苯基)-2-(4-炔丁酰胺基)乙基硫代碳酸酯；在无水环境下，S-6-羟己基O-1-(2-硝基苯基)-2-(4-炔丁酰胺基)乙基硫代碳酸酯和贰(4-甲氧基苯基)(苯基)甲基氯溶于二氯甲烷；滴加三乙胺，室温下反应，即得。

7.一种合成权利要求2所示化合物的方法，包括以下步骤：

(1)将4-溴丁酸甲酯进行叠氮化而后用LiOH的甲醇溶液水解，得到4-叠氮丁酸；

将4-叠氮丁酸与氨基固相LCAA-CPG形成酰胺键，叠氮基被修饰到氨基固相LCAA-CPG上；

(2)用抗坏血酸、硫酸铜、二异丙基乙基胺将氨基固相LCAA-CPG上的叠氮与1-(2-硝基苯基)-2-(4-炔丁酰胺基)乙基-6-[贰(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基]己基氨基碳酸酯、6-[贰(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基]己酸1-(2-硝基苯基)-2-(4-炔丁酰胺基)乙酯或S-6-[贰(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基]己基-1-(2-硝基苯基)-2-(4-炔丁酰胺基)乙基硫代碳酸酯中的炔基进行Huisgen叠氮化物-炔烃环加成反应，封闭氨基固相LCAA-CPG上未修饰的氨基，即得。

8.按照权利要求3-6任何一项所述的方法，其特征在于：所述的室温为20-30℃。

9.按照权利要求8所述的方法，其特征在于：所述的室温为25℃。

10.一种寡聚核苷酸，其特征在于：含有权利要求1所述的光敏感的功能化化合物或权利要求2所述的光敏感的功能化固载相。

11.权利要求1所述的光敏感的功能化化合物或权利要求2所述的光敏感的功能化固载相在寡聚核苷酸固相合成中的应用。

说明书

光敏感的功能化固载相及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及寡聚核苷酸的功能化固载相，尤其涉及光敏感的功能化化合物以及用该化合物制备的光敏感的功能化固载相及其制备方法，本发明还涉及所述光敏感的功能化固载相在寡聚核苷酸固相合成和功能化中的应用，属于寡聚核苷酸的固相合成和功能化领域。

背景技术

[0002] 光活性基团指在光子激发下，能够通过形成自由基或异裂中间体，发生化学变化的分子结构。它使在复杂体系中，尤其是在生理环境下，利用光控制小分子或生物大分子的变化成为可能。普遍认为，与温度、酸碱度等其它的调控手段相比，光调控具有定位准确，调控及时，对体系影响小等诸多优点。通常所指的光活性基团可分为两类，即：光异构化基团和光可切除基团。前者的光化学过程是可逆的，后者则是不可逆的化学过程。光可切除1
基团（caged/caging moieties）的概念最早由J.F.Hoffman于1978年提出 ，这类基团对
340-370nm范围内的光敏感，能够有效地吸收这种能量的光子。最常见的光可切除基团是邻硝基苯基及其衍生物，此外还有对羟基苯乙酰氧基、香豆素类、呫吨酮乙酸类化合物等。由于邻位硝基的存在，在光激发后，邻硝基苯乙醇类化合物形成五元环状中间体，进而得到邻亚硝基苯乙酮类化合物，与化合物中的其它部分断开。由于邻硝基苯乙醇及其衍生物的结构相比其它光可切除基团在合成中或生理环境下较为稳定，因此在大多数生物体系中被广泛采用，如ATP，DNA，RNA，蛋白质，适配体等。

[0003] 寡聚核苷酸可以用来做PCR引物，用于核酸序列检测的探针、等位基因特异的寡聚核苷酸分析（Allele-specific oligonucleotide，ASO）、单碱基多样性分析（Single nucleotide polymorphism，SNP）、反义寡聚核苷酸，其在分子生物学领域有广泛的应用。

[0004] 近几十年来，寡聚核苷酸在分子生物学中发挥着越来越重要的作用，逐渐成为一种非常有效的研究工具。特别是近年来，相关的研究多集中在如何利用寡聚核苷酸从基因水平上研究各种疾病的产生机理及其相关基因的表达网络，并使其通过调节基因的表达量来预防、诊断和治疗相关疾病，作为药物研发的另一种思路。

[0005] 当寡聚物需要双标记或需要对3′内切酶稳定时，便需在3′端进行修饰。对于引入3′氨基的固相，其优点是Fmoc能在固相上选择性地脱除，从而继续在固相进行ODN的功能化缀合。同时，这种固相引入了一个手性碳原子，在HPLC纯化时可能会发现其一对光学异构的寡聚物。其不足是，尽管在寡聚物合成过程中较为稳定，但如果处理失当，某些Fmoc保护基会脱去，这样自由的氨基会与合成循环中封闭一步所用的醋酸酐发生反应，预期寡聚物的产率降低。另一种引入氨基的固相是利用邻苯二甲酰亚胺分子，使用浓氨水即可将寡聚物从固相上切下暴露氨基。这种连接臂对合成循环稳定且不存在手性中心。此外还有在固相上第一个碱基为具氨基侧链的胞嘧啶或胸腺嘧啶的氨基化方法。

[0006] 对于3′巯基的修饰有二硫键保护的巯基修饰的CPG，在合成中为保证二硫键不被氧化，所有氧化步骤需使用0.2M的碘液，合成后用浓氨水从固相上切下（55℃，4小时），HPLC纯化后用TCEP水溶液断开二硫键，不需经HPLC纯化即可使用。Shankar研究组曾报告经其修饰的固相先经高氯酸汞处理，然后在THF和甲醇的混合体系中350nm光照2小时可以高于70%的收率释放固相上连接的Fmoc-氨基丙酸和胆固醇等小分子。而将固相直接暴露在日光下，7天仅释放5%。此方法可降低固相对日光的敏感度，便于操作。Greenberg等人报告称3′端为磷酸基的ODN不会被浓氨水从固相上切下，而固相上脱保护的ODN可作为杂交探针，光照后杂交后的双螺旋寡聚物即从固相切下，有错配碱基的反义链侧不能结合在固相上。

[0007] 3′羟基的固相用Pd0在pH为5.5的环境下脱除碱基和五价磷的保护基，然后用光从固相切割下。这种方法可以在ODN中引入对浓氨水敏感或不能经合成转化而得到的非天然5-羟基胞嘧啶。用3′氨基固相合成ODN，而后光解，在液相中3′端连入芘、甾体、生物素、三肽等小分子，再脱去碱基保护基和5′-DMTr。或在固相合成后，脱DMTr保护基，5′端连入功能分子，在液相中光解后在3′端连入其它分子，最后浓氨水脱碱基保护基和乙腈39
氧基 。这在很大程度上丰富了寡聚核苷酸缀合物的合成方法。3′羧基的功能化也有报道。

[0008] 将邻硝基苄醇结构保护的氨基和羧基与胸腺嘧啶单体的碱基连接，寡聚核苷酸合成后并光照处理后，即可暴露氨基和羧基。在链中加入功能分子还可通过修饰的DNA单体实现，即先将光活性基团连入胸腺嘧啶2′位置进行DNA合成，光脱保护后再连入功能分子。

发明内容

[0009] 本发明目的之一是提供光敏感的功能化小分子；

[0010] 本发明目的之二是提供光敏感的功能化固载相；

[0011] 本发明目的之三是提供合成所述光敏感的功能化小分子以及光敏感的功能化固载相的方法；

[0012] 本发明的目的之四是将所述光敏感的功能化小分子以及光敏感的功能化固载相应用于寡聚核苷酸的固相合成或功能化修饰。

[0013] 本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

[0014] 光敏感的功能化化合物，其结构式为以下式Ⅰ或式Ⅱ所示：

[0015]

[0016] 其中，R1是氢或贰(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基（DMTr）；R2是氢或烷氧基（alkoxy）；R3选自氢或烷氧基（alkoxy）；或R2-R3是-OCH2O；X是氧或氮；Y是碳、氮或硫；Z是CH2或OCH2CH2；m或n为1-6的任意整数；

[0017]

[0018] 其中，R1是氢或DMTr；R2是氢或烷氧基（alkoxy）；R3选自氢或烷氧基（alkoxy）；或R2-R3是-OCH2O；m为1-6的任意整数。

[0019] 本发明的另一个目的是提供了光敏感的功能化固载相，其结构式为下述式Ⅲ或式Ⅳ所示的化合物：

[0020]

[0021] 其中，R1是氢或DMTr；R2是氢或烷氧基（alkoxy）；R 3选自氢或烷氧基（alkoxy）；或R2-R3是-OCH2O；X是氧或氮；Y是碳、氮或硫；Z是CH2或OCH2CH2；m或n为1-6的任意整数；CPG为多孔玻璃珠；

[0022]

[0023] 其中，R1是氢或DMTr；R2是氢或alkoxy；R3选自氢或alkoxy；或R2-R3是-OCH2O；m为1-6的任意整数；CPG为多孔玻璃珠。

[0024] 本发明的另一目的是提供了合成式Ⅰ或式Ⅱ所述光敏感的功能化小分子以及式Ⅲ或式Ⅳ所示光敏感的功能化固载相化合物的方法。

[0025] 一种合成式Ⅱ所示化合物的方法，包括：（1）将2-氨基-1-(2-硝基苯基)乙醇与丁炔酸在二甲基甲酰胺（DMF）中，通过与二氯乙烷（EDC）和1-羟基苯并三唑（HOBt）成酰胺键得到N-[2-羟基-2-(2-硝基苯基)乙基]4-炔丁酰胺(化合物11a)；（2）将N-[2-羟基-2-(2-硝基苯基)乙基]4-炔丁酰胺和DMTr-Cl溶于吡啶，在室温下反应，得到式Ⅱ化合物（化合物11b）。

[0026] 一种合成式Ⅰ所示化合物的方法，包括：在无水环境中，将N-[2-羟基-2-(2-硝基苯基)乙基]4-炔丁酰胺（化合物11a），DSC和4-二甲氨基吡啶（DMAP）溶于乙腈中得到混合体系；将该混合体系在室温下搅拌后滴加6-氨基己醇的二氯甲烷溶液继续在室温下搅拌反应，得到1-(2-硝基苯基)-2-(4-炔丁酰胺基)乙基6-羟己基氨基碳酸酯（化合物12a）；（2）在无水环境下，1-(2-硝基苯基)-2-(4-炔丁酰胺基)乙基6-羟己基氨基碳酸酯（12a）和DMTr-Cl溶于二氯甲烷；滴加三乙胺，室温下反应，即得化合物12b。

[0027] 一种合成式Ⅰ所示化合物的方法，包括：在无水环境下，6-[贰(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基]己酸三乙胺（化合物10）、1，3-二环己基碳二亚胺（DCC）和DMAP 溶于二甲基甲酰胺（DMF）中，在室温下搅拌反应后加入N-[2-羟基-2-(2-硝基苯基)乙基]4-炔丁酰胺（化合物11a），在70℃下继续搅拌反应，得化合物13。

[0028] 一种合成式Ⅰ所示化合物的方法，包括：在无水环境下，将N-[2-羟基-2-(2-硝基苯基)乙基]4-炔丁酰胺（11a）、DSC和DMAP溶解于乙腈，在室温下搅拌反应后加入6-巯基己醇，继续搅拌反应，得到S-6-羟己基O-1-(2-硝基苯基)-2-(4-炔丁酰胺基)乙基硫代碳酸酯（化合物14a）；在无水环境下，S-6-羟己基O-1-(2-硝基苯基)-2-(4-炔丁酰胺基)乙基硫代碳酸酯和DMTr-Cl溶于二氯甲烷；滴加三乙胺，室温下反应，即得化合物14b。

[0029] 一种合成式Ⅲ或式Ⅳ所示化合物的方法，包括以下步骤：

[0030] （1）将4-溴丁酸甲酯进行叠氮化而后用LiOH的甲醇溶液水解，得到4-叠氮丁酸（化合物15）；将4-叠氮丁酸与LCAA-CPG形成酰胺键，叠氮基被修饰到氨基固相上；（2）用10当量的抗坏血酸、硫酸铜、DIPEA将氨基固相上的叠氮与式Ⅰ化合物中的炔基进行Huisgen叠氮化物-炔烃环加成反应，封闭固相上未修饰的氨基，即得。

[0031] 本发明中所述的室温为20-30℃，优选为25℃。

[0032] 本发明式Ⅲ或式Ⅳ所示结构的光敏感的功能化固载相均有邻硝基苯乙醇的母体结构，具有光切割活性，在寡聚核苷酸的固相合成中，可作为光活性保护基将其作为寡聚核苷酸的ODN的3′端，能够保护磷酸基、氨基、羧基或巯基；寡聚核苷酸合成结束后，365nm光照下能够有效地将寡聚核苷酸从固相切除并脱去保护，暴露出对应功能基团；寡聚核苷酸能够借助这些功能基团（如氨基、羧基）连接染料小分子（如芘、罗丹明），亦可通过两端双修饰的产物自身形成环状的寡聚核苷酸，达到寡聚核苷酸功能化的目的。固载率和光切割效率实验结果表明，本发明式Ⅲ或式Ⅳ所示结构的化合物具有较高的固载率和优异的光切割效率，能够应用于寡聚核苷酸的固相合成和功能化。

附图说明

[0033] 图1本发明式Ⅰ或式Ⅱ所示结构的化合物。

[0034] 图2本发明式Ⅲ或式Ⅳ所示的光敏感的功能化固载相。

[0035] 图3本发明式Ⅰ或式Ⅱ化合物的合成路线图。

[0036] 图4本发明式Ⅲ或式Ⅳ所示的光敏感的功能化固载相的合成方法。

具体实施方式

[0037] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

[0038] 试验材料和方法

[0039] 1、二氯甲烷、三乙胺、四氢呋喃、乙腈等溶剂用氢化钙干燥，并在每次使用前蒸馏。所有试剂从阿法埃莎（天津）化学有限公司、西格玛奥德里奇（中国）有限公司、梯希爱（上海）化成工业发展有限公司、韶远化学科技（上海）有限公司等企业购得。

[0040] 2、所有混合溶剂以其体积比例报告。所有反应进程通过薄层层析检测，薄层层析板由Merck公司生产，其上有0.24nm厚的F254硅胶。柱层析所用硅胶（200-300目）由青岛1 13 31
海洋化工厂生产。400MHzH核磁共振、100MHz C核磁共振、162MHz P核磁共振由Bruker AVANCE II 400核磁共振仪在室温下（298K）测定。碳谱和氢谱化学位移（δ,ppm）相对于残留溶剂的公认化学位移而确定，磷谱的化学位移以85%磷酸为外标，耦合常数（J）四舍五入至1Hz。质谱由ESI-Q-TOF测得。所述反应和操作均在暗室中进行。

[0041] 3、寡聚核苷酸固相合成和分离通用方法

[0042] 寡聚核苷酸由Applied Biosystems Incorporated 394自动合成仪合成。氨基固相LCAA-CPG从Millipore Corporation购得。CPG:dG和DNA单体由AuGCT生物科技公司购得。寡聚核苷酸由标准DNA合成循环在CPG:dG或修饰的LCAA-CPG上进行1μmol规模的合成。对于5′末端的反应，反应时间延长为120秒，并重复一次。

[0043] 半制备HPLC在Varian Prostar上用Agilent C18 column(5μm,9.4×250mm)进行，条件：溶液A，0.05M三乙胺-醋酸缓冲液；溶液B，乙腈。起始强度15%B，梯度1%B/min，流速1mL/min，单通道UV检测器，检测波长260nm。流动相在使用前过0.22μm水系/有机系滤膜，缓冲盐溶液超声后使用。

[0044] 分 析 HPLC 在 Waters alliance e2695 上 用 Symmetry C18column(3.5μm,4.6×75mm)进行，起始强度0%B，梯度1%B/min，流速1mL/min，PAD检测器，检测波长210-600nm。

[0045] 质谱由ESI-Q-TOF或MALDI-TOF测得。紫外可见光谱由Beckmann DUSeries 800光谱仪测得。

[0046] 光解：在UVP高强度紫外灯在365nm波长下进行，为使体系温度保持在30℃以下，必要时将冰袋置于石英池下。若石英池内为固相的混悬液，则加入微小的搅拌子，置于磁力搅拌器上进行光照。

[0047] 氨解：向有固相粉末或干燥寡聚核苷酸的EP管内加入浓氨水(500μL)，在室温下混悬24小时，取液体蒸干。

[0048] 醋酸解：为脱去5′端DMTr保护基，向有干燥寡聚核苷酸的EP管内加入80%的醋酸水溶液(500μL)，在室温下混悬30分钟，取液体蒸干。

[0049] 所加入的小分子偶联剂（BOP，HOBt等）在使用前配成其DMF溶液，即1mL无水DMF中溶解20μmol的偶联剂，取100μL加到固相或干燥寡聚核苷酸中。

[0050] 实施例1 2-氨基-1-(2-硝基苯基)乙醇(化合物9)的制备

[0051] 邻硝基苯乙酮(5.00g，30.3mmol)，CuBr2(12.8g，62.0mmol)溶于氯仿(15mL)和乙酸乙酯(10mL)的混合溶剂中，升温至80℃回流，加入2滴Br2继续反应2小时，加乙酸乙酯(50mL)稀释体系，水洗(3×80mL)，无水硫酸钠干燥后浓缩有机相，剩余物溶于丙酮(15mL)，冰浴，缓慢加入NaN3(2.36g，36.4mmol)，加毕，渐升至室温，继续反应1小时后加入乙酸乙酯稀释，过滤并浓缩母液，将残余物溶于甲醇(10mL)和二氧六烷(5mL)的混合溶剂中，冰浴并搅拌，将NaBH4(1.14g，30.0mmol)溶于二氧六烷(5mL)滴加入上述体系，10分钟加毕后即停止反应，丙酮淬灭，浓缩体系并硅胶柱分离，流动相石油醚/乙酸乙酯比为2/1，得2-叠氮-1-(2-硝基苯基)乙醇。将其溶于四氢呋喃（THF）(15mL)中，冰浴并搅拌，将PPh3(6.50g，24.8mmol)缓慢加入该体系中，加毕渐升至室温，继续反应3小时后浓缩，硅胶柱分离，流动相二氯甲烷/MeOH/三乙胺（TEA）比为40/1/1，得化合物9：淡黄色固体1
(2.18g,12.0mmol,40%,共3步产率).H NMR(400MHz,MeOH-d4)δ=7.80(dd,2H,J=8,11Hz),7.62(t,1H,J=7Hz),7.40(t,1H,J=8Hz),5.06(d,1H,J=3,8Hz),2.90(dd,1H,J=2,13Hz),2.
13
64(dd,1H,J=8,13Hz). C NMR(100MHz,MeOH-d4)δ=149.4,139.7,134.3,129.5,129.4,125+ +
.1,49.6.m/z MS(ESI-TOF)实测值[M]205.0586,C8H10N2O3理论值205.0589.

[0052] 实施例2 6-[贰(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基]己酸三乙胺(化合物10)的制备

[0053] 在无水环境中，向DMTr-Cl（贰(4-甲氧基苯基)(苯基)甲基氯；又名：4,4-双甲氧基三苯甲基氯，4,4-dimethoxytrityl chloride）(500mg,1.48mmol)的二氯甲烷(10mL)溶液中加入6-羟基己酸乙酯(200μL,1.23mmol)和三乙胺（TEA）(430μL,3.08mmol)。体系在室温下搅拌1小时后用NaHCO3水溶液萃取(0.1M,2×30mL)，无水硫酸钠干燥。浓缩有机相，残留物溶于NaOH水溶液(6M,25mL)和乙醇(4mL)，在室温下搅拌，直至TLC（薄层层析）监测酯类消失。用氯仿(50mL)稀释体系，水洗(3×50mL)。浓缩有机相，硅胶柱分离，流动相甲醇/二氯甲烷/TEA比为3/7/1，得化合物10：白色固体(550mg,1.08mmol,87%产1
率)；H NMR(400MHz,CDCl3)δ=7.42-7.18(m,10H),6.80(d,4H,J=9Hz),3.78(s,6H),3.47(s,1H),3.01(t,2H,J=7Hz),2.84(q,6H,J=7Hz),2.21(t,2H,J=8Hz),1.60(m,4H,J=8Hz),1.38
13
(dd,2H,J=7,12Hz),1.16(t,3H,J=7Hz). C NMR(100MHz,CDCl3)δ=179.2,158.3,145.5,136.8,130.2,128.2,127.6,126.5,113.0,85.6,63.6,55.2,45.1,36.5,30.1,26.4,26.0,9.5.[0054] 实施例3 N-[2-羟基-2-(2-硝基苯基)乙基]4-炔丁酰胺(化合物11a)的制备[0055] 4-炔丁酸(640mg,6.51mmol)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐（EDC-HCl）(1.24g,6.47mmol)和1-羟基苯并三唑（HOBt）(996mg,6.50mmol)溶解于二甲基甲酰胺（DMF）(5mL)，在室温下搅拌1小时后向其滴加化合物9(988mg,5.40mmol)的DMF(3mL)溶液。体系在室温下继续搅拌3小时，用乙酸乙酯(50mL)稀释，水洗(3×50mL)无水硫酸钠干燥。浓缩有机相，硅胶柱分离，流动相石油醚/乙酸乙酯比为1/1，得化合物11a：
1
淡黄色油状液体(1.13g,4.31mmol,80%产率).H NMR(400MHz,CDCl3)δ=7.95(m,2H),7.6
7(m,1H,J=8Hz),7.45(m,1H,J=1,8Hz),6.22(s,1H),5.38(t,1H,J=4Hz),3.70(dd,2H,J=5,6
13
Hz).2.55(m,2H,J=2Hz),2.46(m,2H,J=2Hz),2.02(m,1H,J=3Hz). C NMR (100MHz,CDCl3)δ=173.8,147.7,137.5,133.6,128.8,128.5,124.5,82.6,70.8,69.7,47.8,35.1,14.9.m/z + +
MS(ESI-TOF)实测值[M]285.0812,C13H14N2O4理论值285.0852.

[0056] 实施例4 N-{2-[贰(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基]-2-(2-硝基苯基)乙基}4-炔丁酰胺(化合物11b)的制备

[0057] 在无水环境中，化合物11a(92mg,351μmol)和DMTr-Cl(150mg,443μmol)溶于吡啶(5mL)在室温下搅拌过夜。浓缩体系，硅胶柱分离，流动相石油醚/乙酸乙酯比为1/1加1
1%TEA，得化合物11b：无色油状液体(154mg,273μmol,78%产率).H NMR(400MHz,CDCl3)δ=7.77(d,1H,J=8Hz),7.66(d,1H,J=8Hz),7.49-7.18(m,11H),6.68(dd,4H,J=9,22Hz),
13
5.38(t,1H,J=5Hz),3.78(d,6H,J=8Hz),2.43(m,2H),2.32(m,2H),1.96(t,1H,J=2Hz). C NMR(100MHz,CDCl3)δ=170.5,158.6,158.5,146.8,145.1,138.1,135.6,135.3,132.7,130.2,130.1,130.0,127.9,127.8,127.3,126.9,123.7,113.2,113.0,87.6,82.9,69.8,69.2,+ +
46.2,45.1,35.3,14.6.m/z MS(ESI-TOF)实测值[M]587.2598,C34H32N2O6理论值587.2158.[0058] 实施例5 1-(2-硝基苯基)-2-(4-炔丁酰胺基)乙基6-羟己基氨基碳酸酯(12a)的制备

[0059] 在无水环境中，化合物11a(131mg,500μmol),N,N′-二琥珀酰亚胺基碳酸酯（DSC）(154mg,601μmol),和4-二甲氨基吡啶（DMAP）(74mg,606μmol)溶于乙腈(7mL)，该体系在室温下搅拌30分钟后滴加6-氨基己醇(70mg,597μmol)的二氯甲烷(5mL)溶液，继续在室温下搅拌10分钟。浓缩该体系，硅胶柱分离残余物，流动相为二氯甲烷/TEA1
比为10/1，得化合物12a：黄色固体(150mg,370μmol,74%产率).H NMR(400MHz,CDCl3)δ=
7.93(d,1H,J=8Hz),7.63(m,2H),7.42(m,1H),6.65(br,1H),6.19(m,1H),5.50(br,1H),3.8
5(m,1H,J=7Hz),3.55(m,3H),3.05(dd,2H,J=6,12Hz),2.49(s,1H),2.43(m,2H,J=2Hz),2.3
13
5(d,2H,J=14Hz),1.96(s,1H),1.51-1.41(m,4H),1.31-1.28(m,4H). C NMR(100MHz,CDCl3)δ=171.4,155.4,134.4,133.5,128.8,128.0,124.6,82.6,71.0,69.2,62.3,43.8,40.8,35+ +
.1,32.3,29.5,26.2,25.2,14.7.m/zMS(ESI-TOF)实测值[M]428.1340,C20H27N3O6理论值
428.1798.

[0060] 实施例6 1-(2-硝基苯基)-2-(4-炔丁酰胺基)乙基-6-[贰(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基]己基氨基碳酸酯(化合物12b)的制备

[0061] 在无水环境下，化合物12a(97mg,240μmol)和DMTr-Cl(100mg,261μmol)溶于二氯甲烷(5mL)得一紫红色溶液。向该体系滴加TEA(82μL,590μmol)后，室温下搅拌30分钟后用二氯甲烷(50mL)稀释，饱和NaHCO3水溶液(2×50mL)洗，无水硫酸钠干燥。浓缩有机相，硅胶柱分离，流动相石油醚/乙酸乙酯比为1/1加1%TEA，得化合物12b：无色1
泡沫(127mg,187μmol,78%产 率).H NMR(400MHz,CDCl3)δ=7.97-7.17(m,13H),6.81(d,4H,J=9Hz),6.26(br,1H),6.16(m,1H),4.92(br,1H),3.89(m,1H,J=7Hz),3.78(s,6H),3.
70(m,1H),3.09(m,2H,J=6Hz),3.02(m,2H,J=6Hz),2.47(t,2H,J=6Hz),2.37(t,2H,J=7Hz),1.96(d,1H,J=2Hz),1.72(s,1H),1.57(t,2H,J=7Hz),1.44(t,2H,J=7Hz),1.35(t,2H,J
13
=7Hz),1.25(t,3H,J=7Hz). C NMR(100MHz,CDCl3)δ=171.0,158.3,155.2,145.4,136.7,
133.6,130.0,129.0,128.2,128.0,127.7,126.6,124.7,113.0,85.6,82.8,71.1,69.3,6+
3.2,55.2,44.0,41.1,35.3,29.9,29.7,26.6,25.9,14.8,14.2.m/z MS(ESI-TOF)实测 值+
[M]730.2100,C41H45N3O8理论值730.3105.

[0062] 实施例7 6-[贰(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基]己酸1-(2-硝基苯基)-2-(4-炔丁酰胺基)乙酯(化合物13)的制备

[0063] 在无水环境下，化合物10(270mg,504μmol)，1，3-二环己基碳二亚胺（DCC）(210mg,1.02mmol)和4-二甲氨基吡啶（DMAP）(18mg,80μmol)溶于DMF(5mL)，在室温下搅拌1小时后加入化合物11a(100mg,382μmol)，在70℃下继续搅拌3小时，用乙酸乙酯(50mL)稀释，水洗(3×50mL)无水硫酸钠干燥。浓缩有机相，硅胶柱分离，流动相石油醚/1
乙酸乙酯比为1/1加1%TEA，得化合物13：黄色油状液体(121mg,185μmol,48%产率).H NMR(400MHz,CDCl3)δ=7.90-7.08(m,13H),6.73(d,4H,J=8Hz),6.28(m,1H,J=4Hz),6.00(br,1H),4.03(q,1H,J=7Hz),3.82(m,1H,J=7Hz),3.70(s,6H),2.39-2.23(m,6H),1.96(s,2H)
13
,1.88(s,1H),1.53-1.25(m,6H). C NMR(100MHz,CDCl3)δ=172.6,170.9,158.3,148.0,145.3,136.5,133.6,133.5,129.9,129.1,129.0,128.1,128.0,127.8,127.7,127.6,126.5,12
4.6,113.1,112.9,85.6,82.8,70.2,69.3,63.0,60.3,55.1,43.5,35.1,34.0,25.8,25.1,2+ +
4.6,24.3,14.7,14.1.m/z MS(ESI-TOF)实测值[M]701.2128,C40H42N2O8理论值701.2839.[0064] 实施例8 S-6-羟己基O-1-(2-硝基苯基)-2-(4-炔丁酰胺基)乙基硫代碳酸酯(化合物14a)的制备

[0065] 在无水环境下，化合物11a(199mg,400μmol)，DSC(123mg,480μmol),DMAP(60mg,491μmol)溶解于乙腈(10mL)，体系在室温下搅拌30分钟后加入6-巯基己醇(65μL,515μmol)。继续搅拌1.5小时后，浓缩体系，硅胶柱分离，流动相石油醚/乙酸乙酯
1
比为1/3，得化合物14a：黄色油状液体(123mg,292μmol,77%产率).H NMR(400MHz,CDCl3)δ=8.01(d,1H,J=8Hz),7.65(m,2H),7.48(dd,1H,d=2,4Hz),6.45(dd,1H,J=4,7Hz),6.
18(br,1H),3.90-3.79(m,2H),3.62(dd,2H,J=2,7Hz),2.81(t,2H,J=7Hz),2.44(m,2H)-
13
,2.37(m,2H),1.72-1.45(m,8H). C NMR(100MHz,CDCl3)δ=171.0,170.7,147.7,133.8,133.1,129.2,127.9,124.9,82.8,73.2,69.4,62.7,43.3,39.0,35.2,32.5,31.0,29.4,28.2,2+ +
9.2,25.5,14.7.m/z MS(ESI-TOF)实测值[M]445.1453,C20H26N2O6S理论值445.1409.[0066] 实施例9 S-6-[贰(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基]己基-1-(2-硝基苯
基)-2-(4-炔丁酰胺基)乙基硫代碳酸酯(化合物14b)的制备

[0067] 在无水环境下，化合物14a(123mg,292μmol)和DMTr-Cl(108mg,320μmol)溶于二氯甲烷(5mL)得一紫红色溶液。向该体系滴加TEA(89μL,640μmol)后，室温下搅拌30分钟后用二氯甲烷(40mL)稀释，饱和NaHCO3水溶液(2×40mL)洗，无水硫酸钠干燥。浓缩有机相，硅胶柱分离，流动相石油醚/乙酸乙酯比为1/1加1%TEA，得化合物14b，无色泡沫(160mg,221μmol,78%产率).

[0068] 化 合物 14b：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ=8.03-7.25(m,13H),6.81(d,4H,J=9Hz),6.47(dd,1H,J=4,7Hz),6.08(br,1H),3.88-3.81(m,2H),3.77(s,6H),3.02(t,2H,J=7Hz),2.78(t,2H,J=7Hz),2.45(t,2H,J=2Hz),2.44(m,2H),1.99(t,2H,J=3Hz),1.59-1.55(m,4H)13
,1.35-1.30(m,4H). CNMR(100MHz,CDCl3)δ=170.8,170.6,158.3,147.7,145.3,136.6,1
33.7,133.2,130.0,129.2,128.1,127.9,127.6,126.5,124.9,112.9,85.6,82.8,73.1,6+
9.5,63.1,55.1,43.3,35.2,31.1,29.8,29.5,28.5,25.7,14.7.m/z MS(ESI-TOF)实测 值+
[M]747.2657,C41H44N2O8S理论值747.2716.

[0069] 实施例10 4-叠氮丁酸(化合物15)的制备

[0070] 溴丁酸甲酯(600μL,4.77mmol)，叠氮酸钠(372mg,5.72mmol)溶于DMF(5mL)，室温下搅拌2小时后用二氯甲烷(50mL)稀释，水洗(4×50mL)，无水硫酸钠干燥。浓缩有机相，加入LiOH(228mg,9.54mmol)的MeOH(7mL)溶液，室温下搅拌过夜。浓缩体系，加入水(10mL)，用NH4Cl饱和水溶液中和体系至pH=5。二氯甲烷(3×30mL)萃取，无水硫酸钠1
干燥有机相，蒸干，即得化合物15：深黄色油状液体(395mg,3.06mmol,64%两步产率).H
13
NMR(400MHz,CDCl3)δ=3.36(t,2H,J=7Hz),2.45(t,2H,J=7Hz),1.90(m,2H,J=7Hz). C NMR(100MHz,CDCl3)δ=177.7,50.5,30.8,24.0.

[0071] 实施例11 氨基固相（CPG 11）的制备

[0072] 苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸盐（HBTU）(38mg,100μmol),DMAP(12mg,100μmol)和4-叠氮丁酸(43mg,330μmol)溶于无水DMF(1mL)，室温下混悬30分钟后加入LCAA-CPG(100mg,99.2μmol/g,9.9μmol)。在室温下继续混悬24小时后，依次用甲醇(3×1mL)、二氯甲烷(3×1mL)、乙醚(3×1mL)洗固相。为检测第一步偶联效果，取极少的固相，滴加10%二异丙基乙基胺（DIPEA）的DMF溶液和1%2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）的DMF溶液。固相仍未白色则表明其上氨基基本已经反应。固相分散于溶有化合物11b(200μmol)的二甲基亚砜（DMSO）(1mL)溶液，加入L-抗血酸钠(20mg,100μmol),无水硫酸铜(8mg,50μmol)和二异丙基乙基胺（DIPEA）(8μL,50μmol)。反应体系在25℃下混悬24小时后依次用DMSO(1×1mL)，0.1MNaHCO3水溶液(1×1mL)，甲醇(3×1mL)，二氯甲烷(3×1mL)，乙醚(1×1mL)。此后，向固相中加入N-甲基咪唑的吡啶和乙腈溶液(500μL)、醋酸酐的乙腈溶液(500μL)，即Cap A、CapB，室温下混悬30分钟，用乙腈(3×1mL)洗固相，即得。

[0073] 实施例12 氨基固相（CPG 12）的制备

[0074] HBTU(38mg,100μmol),DMAP(12mg,100μmol)和4-叠氮丁酸(43mg,330μmol)溶于无水DMF(1mL)，室温下混悬30分钟后加入LCAA-CPG(100mg,99.2μmol/g,9.9μmol)。在室温下继续混悬24小时后，依次用甲醇(3×1mL)、二氯甲烷(3×1mL)、乙醚(3×1mL)洗固相。为检测第一步偶联效果，取极少的固相，滴加10%DIPEA的DMF溶液和1%TNBS的DMF溶液。固相仍未白色则表明其上氨基基本已经反应。固相分散于溶有化合物12b(200μmol)的DMSO(1mL)溶液，加入L-抗血酸钠(20mg,100μmol),无水硫酸铜(8mg,50μmol)和DIpeA(8μL,50μmol)。反应体系在25℃下混悬24小时后依次用DMSO(1×1mL)，0.1M NaHCO3水溶液(1×1mL)，甲醇(3×1mL)，二氯甲烷(3×1mL)，乙醚(1×1mL)。此后，向固相中加入N-甲基咪唑的吡啶和乙腈溶液(500μL)、醋酸酐的乙腈溶液(500μL)，即CapA、CapB，室温下混悬30分钟，用乙腈(3×1mL)洗固相，即得。

[0075] 实施例13 氨基固相（CPG 13）的制备

[0076] HBTU(38mg,100μmol),DMAP(12mg,100μmol)和4-叠氮丁酸(43mg,330μmol)溶于无水DMF(1mL)，室温下混悬30分钟后加入LCAA-CPG(100mg,99.2μmol/g,9.9μmol)。在室温下继续混悬24小时后，依次用甲醇(3×1mL)、二氯甲烷(3×1mL)、乙醚(3×1mL)洗固相。为检测第一步偶联效果，取极少的固相，滴加10%DIPEA的DMF溶液和1%TNBS的DMF溶液。固相仍未白色则表明其上氨基基本已经反应。固相分散于溶有化合物13(200μmol)的DMSO(1mL)溶液，加入L-抗血酸钠(20mg,100μmol),无水硫酸铜(8mg,50μmol)和DIpeA(8μL,50μmol)。反应体系在25℃下混悬24小时后依次用DMSO(1×1mL)，0.1M NaHCO3水溶液(1×1mL)，甲醇(3×1mL)，二氯甲烷(3×1mL)，乙醚(1×1mL)。此后，向固相中加入N-甲基咪唑的吡啶和乙腈溶液(500μL)、醋酸酐的乙腈溶液(500μL)，即CapA、CapB，室温下混悬30分钟，用乙腈(3×1mL)洗固相，即得。

[0077] 实施例14 氨基固相（CPG 14）的制备

[0078] HBTU(38mg,100μmol),DMAP(12mg,100μmol)和4-叠氮丁酸(43mg,330μmol)溶于无水DMF(1mL)，室温下混悬30分钟后加入LCAA-CPG(100mg,99.2μmol/g,9.9μmol)。在室温下继续混悬24小时后，依次用甲醇(3×1mL)、二氯甲烷(3×1mL)、乙醚(3×1mL)洗固相。为检测第一步偶联效果，取极少的固相，滴加10%DIPEA的DMF溶液和1%TNBS的DMF溶液。固相仍未白色则表明其上氨基基本已经反应。固相分散于溶有化合物14b(200μmol)的DMSO(1mL)溶液，加入L-抗血酸钠(20mg,100μmol),无水硫酸铜(8mg,50μmol)和DIpeA(8μL,50μmol)。反应体系在25℃下混悬24小时后依次用DMSO(1×1mL)，0.1M NaHCO3水溶液(1×1mL)，甲醇(3×1mL)，二氯甲烷(3×1mL)，乙醚(1×1mL)。此后，向固相中加入N-甲基咪唑的吡啶和乙腈溶液(500μL)、醋酸酐的乙腈溶液(500μL)，即CapA、CapB，室温下混悬30分钟，用乙腈(3×1mL)洗固相，即得。

[0079] 实施例15 寡聚核苷酸的合成

[0080] 用实施例11-14所制备的四种固相进行寡聚核苷酸的固相合成，DNA自动合成为常规方法，最终合成了5′TTT TTC TCT CTC TCT Y3′四条链（表1）。

[0081] 为了应用该策略合成环状寡聚核苷酸，在寡聚两端分别使用氨基固相和羧基保护基分子，如ODN 11。

[0082] 表1 3′端为修饰固相的寡聚核苷酸及双功能化的寡聚物

[0083]

[0084]

[0085] 试验例1所制备的四种氨基固相的固载效率和光切割效率的测定试验[0086] 为测定实施例11-14所制备的四种固相的固载效率，在此步取少量封闭后的固相，加入3%TFA的二氯甲烷溶液，脱下DMTr保护基。以无水二氯甲烷作空白对照，测定该溶液的不同稀释浓度在504nm下的吸光度值，并线性回归外推至该溶液的吸光度（表2）。通过-1 -1文献报告的DMTr正离子的吸光系数78000M cm ，计算得DMTr正离子的物质的量浓度，进而计算得出修饰后的固载量（表3）。从结果我们可以看出，四种固相的组内平行度和组间平行度均良好，且此两步固相反应的效率约为60%。结果表明，这种修饰方法是可行、有效、可再现的。

[0087] 为测定固载相的光切割效率，再次取少量固相（实施例11-14所制备），混悬于乙腈/水中（4/1，6mg/1mL），365nm光照30分钟后分别按上述方法测定其溶液中和固相上残留的DMTr正离子的物质的量，溶液中的量与总物质的量之比即为这四种固相在该条件下的光切割效率（表3）。

[0088] 表2 固载率测定结果（示DMTr吸光度）

[0089]

[0090] 表3 四种固相的固载率和光切割效率

[0091]

[0092] 试验例2含3′端修饰固相ODN的光切割

[0093] 将实施例15所合成的四种固相核苷酸用光进行切割试验。

[0094] 表4 3′端功能化的寡聚核苷酸的质谱和色谱分析结果

[0095]

[0096] 将实施例15所制备的ODN 7、ODN 8、ODN 9和ODN 10光照（365nm）30分钟后，将切下的ODN用浓氨水水解，并进行HPLC纯化。如果是完整无错的ODN，其5′末端会有DMTr，它比合成出错的ODN（5′端用乙酰基封闭，而没有DMTr）会有更长的保留时间，易于用反相柱分离。再将得到的ODN用80%醋酸水溶液去除DMTr保护基，HPLC纯化后即得目标修饰的ODN。质谱表征结果（表4）证实了这些ODN是所期望的。

[0097] 上述试验结束后，通过参考文献，可以看出因为没有羧酸酯键，上述修饰的磷酸基固相对于浓氨水是稳定的，即浓氨水只会去除碱基保护基和磷酸三酯键的乙腈氧基，而不会将ODN从固相上切割下来。故对于3′端的磷酸基亦可先氨解，再在固相上对其进行修饰，最后光解得到3′端为磷酸基的寡聚物。

[0098] 试验例33′端功能基团ODN的标记与环状寡聚物的合成

[0099] ODN 8（实施例15所制备）固相光照后，带有官能团的寡聚核苷酸在液相中。在氨解前将其与1-芘丁酸反应。通过尝试乙腈、二氯乙烷、DMSO和DMF等溶剂后认为DMF做溶剂效果较为理想，由HPLC峰面积计算得到的产率为85%。进而用醋酸脱除5′端DMTr，HPLC纯化后以质谱表征，其分子量确证（表5）。

[0100] 表5 标记的寡聚核苷酸质谱和色谱结果（a)为分析柱结果）

[0101]