重组转录激活子样效应因子、转录激活子样效应因子核酸酶及其编码基因及应用

摘要

本发明涉及基因工程领域，公开了一对多肽及其编码基因，序列如SEQ ID NO.1～4。利用这对多肽构建获得的一对重组的转录激活子样效应因子（TALE）；转录激活子样效应因子核酸酶（TALEN），TALEN是由一对DNA识别蛋白分别与DNA切割蛋白融合形成的融合蛋白，能够对人胰岛素基因靶位点进行定向切割，从而实现对人胰岛素基因的靶向修饰，具有特异性强、效率高和准确度高等特点。

权利要求

1.一对多肽，其特征在于，氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。

2.一对编码权利要求1所述多肽的基因，其特征在于，分别为编码SEQID NO:1和SEQ ID NO:2所述氨基酸序列的核苷酸序列。

3.权利要求2所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。

4.一对重组转录激活子样效应因子，其特征在于，氨基酸序列分别如SEQID NO:5和SEQ ID NO:6所示。

5.一对重组转录激活子样效应因子的编码基因，其特征在于，为编码权利要求4所述重组转录激活子样效应因子氨基酸序列的核苷酸序列。

6.权利要求5所述一对重组转录激活子样效应因子的编码基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示。

7.一对转录激活子样效应因子核苷酸酶，其特征在于，是由权利要求4所述的一对重组转录激活子样效应因子分别与天然或经人工改造的Fok1DNA内切酶融合形成的融合蛋白，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO:9和SEQ IDNO:10所示。

8.一对转录激活子样效应因子核苷酸酶基因，其特征在于，是编码权利要求7所述一对转录激活子样效应因子核苷酸酶的核苷酸序列。

9.权利要求8所述转录激活子样效应因子核苷酸酶基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示。

10.一种重组载体，其特征在于，含有权利要求2、3、5、6、8、9任一项所述的核苷酸序列中的任一个。

11.一种宿主细胞，其特征在于，含有权利要求10所述的载体。

12.权利要求11所述宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为人离体细胞。

13.权利要求7所述转录激活子样效应因子核苷酸酶在非诊断或治疗目的的人胰岛素基因的识别和靶向修饰中的应用。

14.权利要求8或9任一项所述转录激活子样效应因子核苷酸酶基因在非诊断或治疗目的的人胰岛素基因的识别和靶向修饰中的应用。

15.权利要求10所述重组载体在非诊断或治疗目的的人胰岛素基因的识别和靶向修饰中的应用。

16.一种非诊断或治疗目的的人胰岛素基因靶向修饰的方法，其特征在于，将权利要求

7所述的转录激活子样效应因子核苷酸酶、权利要求8或9所述转录激活子样效应因子核苷酸酶基因或者权利要求10所述的重组载体转入人离体细胞，在30～37℃下培养1～4天，得到人胰岛素基因被靶向修饰的细胞。

说明书

重组转录激活子样效应因子、转录激活子样效应因子核酸

酶及其编码基因及应用

技术领域

[0001] 本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一对与胰岛素基因识别相关的多肽、一对重组转录激活子样效应因子、一对转录激活子样效应因子核酸酶及其编码基因与应用。

背景技术

[0002] 人insulin基因是人胰岛素编码基因。胰岛素是由胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一种蛋白质激素。胰岛素是机体内唯一降低血糖的激素，同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成.胰岛β细胞受损,胰岛素分泌不正常会引起糖尿病.糖尿病（diabetes）是胰岛功能减退、胰岛素抵抗等而引发的糖、蛋白质、脂肪、水和电解质等一系列代谢紊乱综合征，临床上以高血糖为主要特点，典型病例可出现多尿、多饮、多食、消瘦等表现，即“三多一少”症状，糖尿病（血糖）一旦控制不好会引发并发症，导致肾、眼、足等部位的衰竭病变，且无法治愈。对内源胰岛素基因进行定向基因修饰有利于胰岛素基因功能,糖尿病发病机理和胰岛β细胞定向分化的研究.[0003] 按照人类的意愿对基因组进行定向靶向修饰一直是许多科学家的梦想。在内源的基因组上特异地删除或加入我们需要的序列，一方面可以构建出各种动物模型用于生物学基础研究和疾病机理研究，另一方面可以生产动物反应器用以廉价生产我们需要的又很难从其他途径得到的生物组分。

[0004] 人们一直没有找到简单高效的方法对基因组进行基因组靶向修饰。传统的基因打靶技术依赖于细胞内自然发生的同源染色体随机交换，其打靶效率非常低，通常只有-6 -810 -10 ，这种打靶方法只在小鼠中得到了广泛了应用，而在其他模式动物及大型哺乳动物中都因效率太低而得不到广泛应用。

[0005] 近年发展很快的序列特异的核酸酶可以用于精确的基因组靶向修饰。一般由序列特异的核酸酶由一个DNA识别结构域和一个非特异性核酸内切酶结构域构成。原理是首先由DNA识别域把核酸酶定位到需要编辑的基因组区域，然后非特异性核酸内切酶切断双链DNA从而造成DNA双链断裂（double-strand break，DSB），引入的DSB激活的DNA自我修复可以引起基因的突变和促进该位点DNA同源重组。锌指核酸酶（Zinc-finger nucleases，ZFN）是现在研究最清楚也是应用最广的序列特异的核酸酶。其原理是两个锌指蛋白特异识别两段相隔5-7bp的DNA序列，并把与之融合表达的非特异性DNA切割蛋白Fok1的两个单聚体定位到了一起，DNA切割蛋白形成双聚体时可以切断该位置的双链DNA，从而造成DSB。ZFN的出现使基因组靶向修饰技术向前迈进了一大步，然而，ZFN技术还存在靶向不确定性、效率低、拖把率高等问题，研究者很难自行设计出特异和高效的靶向基因组目的序列的锌指核酸酶仍然是制约ZFN广泛应用的瓶颈。而商业购买高效特异的锌指核酸酶又价格昂贵（20万人民币/基因），一般研究者或商业公司根本无法承受这笔费用。

[0006] 2009年两个研究组发现植物病原体Xanthomonas中的一种可以调节植物基因表达的转录激活子样效应因子（transcription activator-like effector，TALE）表现出DNA结合特异性，而其识别密码具有模块化和简单化的特点，为科学家们开发出更简易的新型基因组靶向修饰技术带来了新希望。

[0007] TALE与Fok1融合后即形成转录激活子样效应因子核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALEN）。TALEN的打靶原理与ZFN相同，只是识别特异DNA的蛋白不同。TALEs由数十个特异性识别DNA的串联“蛋白模块”和两侧的N-末端及C-末端序列组成。每个“蛋白模块”包含34个氨基酸，第12和13位残基是靶向识别的关键位点，被称作重复可变的di-residues（RVDs）位点。然而不同于每个锌指蛋白识别特异性的三联体碱基，TALEs上的每个RVDs仅能识别一个碱基。

[0008] Sangamo BioSciences公司和哈佛大学的两个研究小组分别利用TALEs技术进行了基因组靶向修饰相关研究，两篇研究论文发表在同一期的《自然生物技术》（Nature Biotechnology）杂志上。

[0009] Edward Rebar领导的研究小组将带有不同C-末端TALE的截短片段连接到核酸酶FokI的催化结构域上。当研究人员将构建的TALENs靶向内源性的人类NTF3和CCR5基因时，证实TALENs能够特异性地对这些基因片段进行剪切。哈佛大学研究小组开发了一种基于分层连接的策略来构建包含12个重复模块的TALEs。他们在保留RVDs的基础上减少了每个模块的DNA序列，同时将剩余序列的重复性降到最低。进而通过12重PCR获得了带有特异性连接序列的单体，并将其克隆至包含TALE N-末端和C-末端序列的骨架载体中。为了构建TALE转录因子，研究人员又将TALE融合到一个转录因子的激活域。在接下来的靶向性检测中，研究人员证实其能特异地使四个检测内源基因中的两个基因表达上调。

[0010] MIT的Rudolf Jaenisch小组也验证了TALEN在人胚胎干细胞和人iPSC中的打靶效果。其通过在五个位点的TALENs与之前其在相同位置的ZFNs的打靶效果作对比，得出五组TALENs在打靶效率和精确度上都与从Sangamo BioSciences公司购买的ZFNs相似，进一步验证了TALENs是非常好的基因组编辑工具。

发明内容

[0011] 本发明旨在提供一对多肽及其编码基因。

[0012] 本发明利用这对多肽构建获得的一对重组的转录激活子样效应因子（TALE）能够特异性地识别人insulin基因组上的二段相邻核苷酸。

[0013] 本发明还利用这对转录激活子样效应因子构建获得的一对转录激活子样效应因子核酸酶（TALEN），能够对人insulin基因进行准确、高效地打靶。

[0014] 本发明针对人胰岛素insulin基因的一个位点设计了一对转录激活子样效应因子核酸酶，这对TALENs分别由可以识别insulin基因上一段核苷酸的DNA识别结构域与一个Fok1DNA内切酶的两个异源亚基融合得到。

[0015] 具体技术方案为：

[0016] 一对多肽，分别具有如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

[0017] 一对编码上述多肽的基因，分别为编码上述SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的DNA核苷酸序列，优选的，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。

[0018] 一对重组转录激活子样效应因子蛋白，分别含有上述具有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2氨基酸序列的多肽。其结构组成为：SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的多肽分别嵌入在转录激活子样效应因子氨基酸序列的框架内，两端连接转录激活子样效应因子TALE氨基酸序列框架的N端和C端。转录激活子样效应因子氨基酸序列框架的N端和C端为天然的或经过人工改造的序列。优选的，这对重组转录激活子样效应因子蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。

[0019] 一对重组转录激活子样效应因子的编码基因，是编码上述这对重组转录激活子样效应因子的核苷酸序列。优选的，核苷酸序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示。

[0020] 上述重组转录激活子样效应因子蛋白进一步用于构建一对转录激活子样效应因子核酸酶，是上述一对转录激活子样效应因子分别与DNA切割蛋白融合形成的融合蛋白。DNA切割蛋白优选为Fok 1 DNA内切酶，可以是天然的或经人工改造的Fok 1 DNA内切酶。更优选的，所述一对转录激活子样效应因子蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示。

[0021] 转录激活子样效应因子核酸酶基因，是编码上述一对转录激活子样效应因子核酸酶的核苷酸序列。优选的，核苷酸序列如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示。

[0022] 一种重组载体，含有编码上述短肽的基因，或含有重组转录激活子样效应因子的编码基因，或含有转录激活子样效应因子核酸酶基因。

[0023] 该重组载体构建方法为将编码SEQ ID No.1和SEQ ID No.2氨基酸序列的核苷酸片段插入含有TALE编码基因和Fok1DNA内切酶的载体中，如pEASY-B载体。

[0024] 将上述重组载体转染宿主细胞，优选为人离体细胞，更优选为人293T细胞，得到含有上述重组载体转染的宿主细胞。为了便于筛选，转染重组载体的宿主细胞中还转入抗puro蛋白或者能表达puro蛋白的质粒。

[0025] 上述的一对多肽及编码基因、一对重组转录激活子样效应因子及编码基因、一对转录激活子样效应因子核酸酶及编码基因、重组载体可识别人胰岛素基因上的特定序列，用于识别和靶向修饰人胰岛素基因。

[0026] 将这对转录激活子样效应因子核酸酶同时转入宿主细胞，或者将这对转录激活子样效应因子核酸酶基因同时转入宿主细胞，或者用含有这对转录激活子样效应因子核酸酶编码基因核苷酸序列的重组载体转染宿主细胞，使这对转录激活子样效应因子核酸酶在宿主内表达，在30～37℃下培养1～4天，得到人胰岛素基因被靶向修饰的细胞。

[0027] 本发明针对人胰岛素insulin基因的一个位点设计了一对转录激活子样效应基因核酸酶（TALENs），这对TALENs分别由可识别人胰岛素基因上某段核苷酸的DNA识别区域与一个DNA蛋白酶（优选Fok1 DNA内切酶）的两个异源亚基融合得到。将这对TALENs同时转入宿主细胞时，能对宿主细胞insulin基因的位点打靶，并使打靶位点发生基因突变，包括碱基缺失、碱基插入等，从而实现对人胰岛素insulin基因的靶向修饰，具有特异性强、打靶效率高、准确度高等优点，突变率可达16%。

附图说明

[0028] 图1为人工设计的转录激活子样效应因子核酸酶识别的DNA序列及位点；

[0029] 图2为18个识别模块连接策略示意图；其中，

[0030] A：PCR为每个识别模块添加酶切识别序列和连接接头过程示意图；

[0031] B：PCR为每个识别模块添加酶切识别序列和连接接头后示意图；

[0032] C：PCR扩增6模块片段与中间载体示意图；

[0033] D：最终构建的TALEN质粒示意图；

[0034] 图3为中间载体pCMV-NLS-TALE backbone-Fok1(R)-intermediate示意图；

[0035] 图4为最终载体pEF1a-NLS-TALE backbone-Fok1(R)-pA示意图；

[0036] 图5为最终载体pEF1a-NLS-TALE backbone-Fok1(L)-IRES-PURO-pA示意图；

[0037] 图6为insulin基因在打靶位点的基因型变化；其中，-表示碱基缺失，+表示碱基插入。

具体实施方式

[0038] 以下实施例中所使用的技术，包括PCR扩增与检测、细胞转染等分子生物学技术，以及细胞培养、检测技术等，除非特别说明，均为本领域内的技术人员已知的常规技术；所使用的仪器设备、试剂和细胞系等，除非是本说明书特别注明，均为一般本领域的研究和技术人员可以通过公共途径获得的。

[0039] 实施例1 TALENs靶序列的设计

[0040] 1、从NCBI上下载人insulin基因组序列（NC 000011.9）

[0041] 2、设计引物并PCR扩增基因组上打靶位点片段，并测序，其中，PCR引物及测序引物见表1；

[0042] 表1

[0043]

[0044] 3、设计TALENs识别序列（靶序列）：

[0045] 根据测序得到的序列，并依照以下原则确定TALENs识别序列：

[0046] （1）第0位碱基为T（识别序列第一位之前的碱基为第0位）

[0047] （2）最后一位碱基为T

[0048] （3）识别序列长度在13-19之间

[0049] （4）二个识别序列之间的间隔序列（Spacer）长度控制在13-21之间（12也可，但效率可能较低）

[0050] 设计得到的靶序列位置如图1所示，具体序列见表2。

[0051] 表2

[0052]编号 TALE名称 靶序列
L1 insulin-TALE-L 1 ccaggacaggctgcat（SEQ ID NO:16）
L2 insulin-TALE-L2 cagccctccaggacaggct（SEQ ID NO:17）
R1 insulin-TALE-R 1 tggaacagacctgcttgat（SEQ ID NO:18）
R2 insulin-TALE-R2 tggaacagacctgctt（SEQ ID NO:19）
R3 insulin-TALE-R3 tggaacagacctgct（SEQ ID NO:20）

[0053] 识别L1、L2、R1、R2、R3靶位点的多肽氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:2所示。

[0054] 实施例2 TALENs识别模块之间的连接及重组载体的构建

[0055] 1、TALENs识别模块（modular）的获得

[0056] （1）合成分别识别碱基A、T、C、G的四个识别模块NI、NG、HD、NK，序列见表3。

[0057] 表3

[0058]

[0059] （2）将四个片段连入pEASY-B载体（购自北京全式金公司），连接方法为：①取PCR产物3μl；②加入1μl pEASY-B载体；③25℃，7min；④转化DH5a感受态细胞，涂布卡纳霉素平板；⑤挑取克隆、小量提取质粒、酶切、测序，最后得到连接到载体pEASY-B中的识别模块NI、NG、HD、NK。

[0060] 2、识别模块之间的连接

[0061] 连接策略：以19个识别模块的连接为例，说明连接策略。因最后一个可以识别碱基T的半个模块已在载体上，所以只要连18个模块即可，连接示意图见图2。

[0062] （1）将识别序列（靶序列）分为三个部分（分别为原序列SEQ ID NO:16-20去掉最后一个碱基，如下所示），即每条识别序列先分为三段，每段含有3-6个碱基，相应地每段对应3-6个识别模块，先以每段为单位，将该段的3-6个识别模块连接。

[0063]

[0064] （2）3-6个识别模块之间的连接方法

[0065] ①PCR扩增添加酶切识别序列和连接接头

[0066] 以6个识别模块之间的连接为例：图2（A）为6个模块PCR添加酶切识别序列和连接接头过程示意图，其中引物F1、F7、F8、R6、R7、R8带有Bbs1酶切识别序列，引物F2、F3、F4、F5、R1、R2、R3、R4、R5带有Bsa1酶切识别序列。Bbs1识别序列（SEQ ID NO:25）为GAAGACNN‘NNNN，Bsa1的识别序列（SEQ ID NO:26）为GGTCTCN‘NNNN，这两个酶都属于type4
IIs enzymes，同一个酶切识别序列可以产生多个粘性识别末端，理论上可以产生4 个粘性识别末端，再加上每个模块的结尾和开头Gly密码子4种，Leu密码子6种的限制，利用一个type IIs enzyme可以产生24种接头。我们选取其中的16种设计了引物，除了F1与R8外，Fn可与Rn+1的粘性末端相连，而不能与其他引物上的粘性末端相连。

[0067] 同样地，如果是5模块，4模块，3模块连接，则分别在第4，第3，第2个连接模块添加F4R6，F3R6，F2R6引物即可，相应的前面的模块和最后一个模块加的引物保持不变，连接的片段数则相应的减少1、2、3个模块片段。

[0068] 各个引物序列（SEQ ID NO:27-42）见表4。

[0069] 表4

[0070]引物名称 引物序列
TALE-F1 CGGGAGCCGACGTCGACAgaagacACTGACCCCAGAGCAGGTCGTGG
TALE-R1 TCTTATCGGTGCTTCGTTCTggtctcTGAGGCCGTGCGCTTGGCAC
TALE-F2 TGCTCTTTATTCGTTGCGTCggtctcGCCTCACCCCAGAGCAGGTCGTG
TALE-R2 TCTTATCGGTGCTTCGTTCTggtctcTTAATCCGTGCGCTTGGCAC
TALE-F3 TGCTCTTTATTCGTTGCGTCggtctcGATTAACCCCAGAGCAGGTCGTG
TALE-R3 GTATCTTTCCTGTGCCCAggtctcTAAGTCCGTGCGCTTGGCAC
TALE-F4 AGATGCCGTCCTAGCGggtctcGACTTACCCCAGAGCAGGTCGTG
TALE-R4 GTATCTTTCCTGTGCCCAggtctcTTAGTCCGTGCGCTTGGCAC
TALE-F5 AGATGCCGTCCTAGCGggtctcGACTAACCCCAGAGCAGGTCGTG
TALE-R5 GTATCTTTCCTGTGCCCAggtctcTAAGGCCGTGCGCTTGGCAC
TALE-F6 AGATGCCGTCCTAGCGggtctcGCCTTACCCCAGAGCAGGTCGTG
TALE-R6 CGCTCGAGCGACACGCAGgaagacATTAAGCCGTGCGCTTGGCAC
TALE-F7 CGGGAGCCGACGTCGACAgaagacAGCTTAACCCCAGAGCAGGTCGTG
TALE-R7 CGCTCGAGCGACACGCAGgaagacATGAGCCCGTGCGCTTGGCAC
TALE-F8 CGGGAGCCGACGTCGACAgaagacAGGCTCACCCCAGAGCAGGTCGTG
TALE-R8 CGCTCGAGCGACACGCAGgaagacATGAGTCCGTGCGCTTGGCAC

[0071] 注：小写加粗字母为酶切位点的识别序列

[0072] PCR扩增体系（50μl）为：DNA模板（Template）：0.5μl（约50ng）；引物（Primer）：每个1μl（50μM）；LATaq酶（Takara）：0.3μl；10×缓冲液（buffer）：5μl；dNTP：2.5μl（2.5μM）；ddH2O：40.7μl。

[0073] PCR程序：95℃2min；95℃15s，55.8℃30s，72℃11s，36个循环；72℃延长10min。

[0074] PCR后即可得到如图2（B）中的片段，每个模块按照目的结合序列被加上不同的内切酶识别序列和不同的接头，相同颜色的两个接头表示两者产生的粘性末端可以相连。

[0075] ②纯化

[0076] 将所得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，确定浓度。使用天根公司的通用型DNA纯化回收试剂盒（离心柱型）纯化PCR片段，纯化后在进行琼脂糖凝胶电泳标定各个产物的浓度。

[0077] ③酶切连接

[0078] 因相邻的模块连接后不再能被Bsa1切开所以本连接可以酶切连接同时进行，酶切连接体系为：模块：100ng/模块(3-6)；Bsa1(NEB):1μl；T4连接酶(fermentas):1μl；T4连接酶缓冲液(NEB):2μl；ddH2O:补至20μl。

[0079] PCR酶切连接程序：37℃5min，20℃5min，35-45个循环；80℃10min。

[0080] （3）将 三 段 3-6 模 块 的 片 段 连 接 到 中 间 载 体 pCMV-NLS-TALE backbone-Fok1(R)-intermediate上

[0081] ①扩增3-6模块片段

[0082] 将上一步骤酶切连接的20μl产物全部进行琼脂糖凝胶电泳，会出现一个模块长度倍数大小的一个数条有梯度的条带，切胶回收最上面的条带。把切回的小块凝胶小心地放在带滤膜的200μl移液枪的枪头中，把枪头放在1.5ml离心管（EP管）中；以最大转速离心5min，离心后用200μl的移液枪将枪头中没有全部甩到离心管中的液体全部吹到离心管中；离心下来的液体既可作为PCR扩增多模块片段的模板之用。PCR扩增的引物为F-assem和R-assem，序列见表5。

[0083] 表5

[0084]引物名称 引物序列
F-assem（SEQ ID NO:43） CGGGAGCCGACGTCGACAG
R-assem（SEQ ID NO:44） CGCTCGAGCGACACGCAGG

[0085] PCR 体 系（50μl）：模 板：2μl；引 物：each 0.5μl（50μM）；Accuprime pfx:0.3μl；10×缓冲液:5μl；ddH2O:42.2μl。

[0086] PCR程序：95℃2min；95℃15s，64℃30s，68℃50s，35个循环；68℃延长10min。

[0087] ②纯化PCR产物

[0088] 将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，确认有无杂带以及目的条带的浓度。如果无杂带或杂带相对于目的条带比例很低则用直接Kit纯化PCR产物；如果杂带较多则需要胶回收纯化。纯化后电泳标定条带浓度。

[0089] ③酶切中间载体pCMV-NLS-TALE backbone-Fok1(R)-intermediate

[0090] 因最终载体上有bbs1酶切位点，而与3个3-6模块片段连接时，连接与bbs1的酶切是同时进行的。所以不能直接连到最终载体上，而只能先连到没有bbs1酶切位点的中间载体上。中间载体的示意图见图3。

[0091] 中间载体酶切体系：质粒：5μg；BsmB1:2μl；DTT（100mM）：1μl；ddH2O:补足100μl。

[0092] 37℃酶切过夜，酶切中每过两个小时补0.5μl BsmB1，并混匀，最好换一个管子，以消除钉在管壁上未被酶切的环形质粒。酶切好后电泳确定质粒是否已全部线性化。确定好后，Kit纯化酶切产物，电泳标定载体浓度。

[0093] ④三片段与中间载体的连接

[0094] 与Bsa1相同，Bbs1也是type IIs enzyme，酶切产生的粘性末端连接后是不能被该酶切开的，所以这个连接也可以酶切连接同时进行的。

[0095] 载 体：100ng；模 块：200ng/ 模 块；Bbs 1(fermentas):1μl；T4 连 接 酶(fermentas):1μl；T4连接酶缓冲液(NEB):2μl；ddH2O:补至20μl。

[0096] 酶切连接程序：PCR程序：37℃5min，20℃5min，35-45个循环；80℃10min。

[0097] ⑤转染，挑选克隆，小量提取质粒，酶切鉴定，测序鉴定

[0098] 连接完后取10μl转化DH5a感受态，剩下的10μl于-20℃冻存。第二天挑一定数量的单克隆（大于10个/板），第三天小量提取质粒，得到的质粒用BamH1和Pst1酶切鉴定，连接正确的应该有2kb左右的条带，而自连的会有约550bp条带。酶切正确后送测序，测序正确即可得到14-19个片段连接成功克隆了。

[0099] 测序引物见表6，其中，连接成功的insulin-TALE-L1，insulin-TALE-R3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:6所示；insulin-TALE-L1中的15.5个模块的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，insulin-TALE-R3中的14.5个模块的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

[0100] 表6

[0101]引物名称 引物序列
TALE-正向测序（SEQ ID NO:45） CTCCCCTTCAGCTGGACAC
TALE-反向测序（SEQ ID NO:46） AGCTGGGCCACGATTGAC

[0102] （4）将连接入中间载体并测序正确的片段连入最终载体pEF1a-NLS-TALE backbone-Fok1(R)-pA与pEF1a-NLS-TALE backbone-Fok1(L)-IRES-PURO-pA

[0103] 最 终 载 体 pEF 1a-NLS-TALE backbone-Fok1(R)-pA 与 pEF1a-NLS-TALE backbone-Fok1(L)-IRES-PURO-pA是在ZFN载体（购于Sigma公司）的基础上，用BamHI+KpnI酶切后加上TALEN的N末端和C末端后得到的。TALEN的N末端和C末端的核苷酸序列如SEQ ID NO:49所示；最终载体的示意图见图4与图5。

[0104] 将连有正确片段的中间载体与两个最终载体同时用BamH1和Pst1双酶切，切胶回收相应的片段。按照设计时的左右顺序将含有Modulars的TALE连入最终载体的左右两个载体上。连接、转染、挑取克隆、小量抽取质粒，BamH1和Pst1双酶切鉴定，测序鉴定。鉴定正确的克隆即为最终我们需要的TALENs质粒。

[0105] 实施例3 质粒的转染人293T细胞

[0106] 1、在6孔板每个孔中加入100μl基质胶，来回晃动，使之铺满整个孔的底部，铺好后置于5%CO2培养箱中30min。

[0107] 2、将培养IPS细胞T25瓶中的培养基吸出，PBS吸一遍，加入1mL 0.25%胰酶，来回晃动，使其均匀覆盖瓶底，置于5%CO2培养箱中5min。

[0108] 3、消化完成后加入1ml 10%DMEM中和胰酶，将消化下来的细胞转移至15ml离心管中，细胞计数，离心，1200rpm，5min。

[0109] 4、用适量的10%DMEM重悬细胞，取200万293T细胞置于已铺好基质胶的6孔板中，加入2ml新鲜的10%DMEM。

[0110] 5、传代同时进行转染。

[0111] 6、将 构建 好的 insulin-TALEN-L1，insulin-TALEN-L2，，insulin-TALEN-R1，insulin-TALEN-R2，insulin-TALEN-R3按表7两两配对组合转染细胞，共12种组合。

[0112] 表7

[0113]insulin-TALEN-R1 insulin-TALEN-R2 insulin-TALEN-R3
insulin-TALEN-L1 L1+R1 L1+R2 L1+R3
insulin-TALEN-L2 L2+R1 L2+R2 L2+R3

[0114] 根据下列方案混合质粒、转染试剂和介质溶液：

[0115]

[0116] 体系中各成分的比例：TALEN-L：TALEN-R：Lv-EF1a-Mcherry=5:5:2

[0117] 总DNA：opti MEM=2μg：100μl

[0118] 总DNA：Fμgene=2μg：5μl

[0119] 7、转染后第二天，即可在荧光显微镜下观察Mcherry荧光亮度以及转染效率。若转染成功，则将6孔中的培养基吸掉，加入2.0μg/ml puro的2ml新鲜的10%DMEM。

[0120] 8、置于5%CO2培养箱中37℃培养两天，每天换2.0μg/ml puro的2ml新鲜的10%DMEM培养液。

[0121] 9、撤掉药杀，37℃的5%CO2培养箱中培养至细胞量够抽基因鉴定之用，培养液换为2ml 10%DMEM。

[0122] 实施例4 细胞打靶鉴定

[0123] 1、将药杀后的6孔板中用加入300μl 0.25%胰酶，来回晃匀。37℃放置5min，用枪吹打使所有细胞都被消化下来。

[0124] 2、将300μl液体吸入1.5ml EP管中，用400μl的PBS洗6孔板两次，也加入EP管中。

[0125] 3、13200rpm/min离心5min，弃去上清液。

[0126] 4、用直接PCR Kit（thermo货号：F-140）抽提基因组，并PCR扩增打靶区域DNA片段。

[0127] 5、鉴定打靶细胞的基因型及打靶效率

[0128] 将上述的insulin-TALEN-L1/insulin-TALEN-R3组合处理的293T细胞的基因组的PCR片段加A后连入PMD18-T载体中，单克隆化DNA片段，送测序后得到insulin基因的打靶位点的基因型。共送25个样品测序有2个克隆发生了突变：其中一个删除6个碱基，另一个删除150个碱基，同时插入ATA三个碱基，见图6。

[0129] 其他组合如L1+R1、L1+R2、L2+R2、L2+R1、L2+R3的PCR扩增片段连接到PMD18-T载体中，单克隆化DNA片段，样品送测序后，每组25个样品，都没有发生突变。

[0130] 加A体系为：DNA：10μl

[0131] rTaq:0.5μl

[0132] 10xbuffer：1.5

[0133] dNTP：0.5μl

[0134] ddH2O：2.5μl

[0135] 然后混匀，置于72℃20min。

[0136] 结果显示：2个突变的克隆中，其中一个缺失600多个碱基，另一个插入了ccatca。在假设细胞中没有双敲除的前提下，insulin-TALEN-L1/insulin-TALEN-R3组合使insulin基因发生了突变的概率是（2×2）/25，即16%。本研究只在insulin基因的一个位点设计了TALENs分子就得到可以定点修饰该基因的一对TALENs，并且效率非常高。可见TALENs技术的相较于ZFN技术的优越性。该对多核苷酸可以识别SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:22的核苷酸序列，而且可以识别这二个序列的一个或二个核苷酸被取代后所衍生的核苷酸序列。该对多核苷酸或其表达的融合蛋白是可以对人基因高效打靶的TALENs，它们为通过同源重组修正insulin基因的的突变或其他基因修饰提供了一个非常高效的工具。通过用本发明多核苷酸转染人离体细胞或者将本发明融合蛋白注入人离体细胞中，可以促进同源重组，插入目的基因，获得高经济价值的蛋白。

[0137] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。