一种采用后编码方式制备双荧光发射纳米探针的方法，以碲化镉量子点与金纳米簇作为荧光编码元素，硅球作为编码元素的载体，结合量子点与金纳米簇的荧光特性，先合成可用于后编码的荧光探针前躯体，再利用该前躯体中加入光学调节剂的后编码方式制备双荧光发射纳米探针。所得双荧光发射纳米探针中两编码元素间的荧光强度比值更大，有利于以更高的分辨率观察到荧光信号的变化；制备步骤如下：量子点的制备、量子点包硅、金纳米簇的合成、荧光探针前驱体微球的合成、双荧光发射纳米探针的制备。本发明的优点：该合成方法过程简单，编码探针具有不可逆性，不同批次间重现性良好，提供了一种制备大量可用作荧光成像的双荧光发射纳米探针的有效方法。
1.一种采用后编码方式制备双荧光发射纳米探针的方法，其特征在于：以碲化镉量子点与金纳米簇作为荧光编码元素，硅球作为编码元素的载体，结合量子点与金纳米簇的荧光特性，先合成可用于后编码的荧光探针前驱体，再利用该前驱体中加入光学调节剂L-半胱氨酸的方法制备双荧光发射纳米探针，包括如下步骤：
1）将巯基丙酸（MPA）加入到CdCl2中，得到含巯基丙酸的CdCl2溶液；
2）将碲粉（Te）、NaBH4与蒸馏水混合，在氮气保护并搅拌的条件下进行还原反应得到NaHTe溶液；
3）碲化镉量子点溶液的制备：将NaHTe溶液快速加入到上述含巯基丙酸的CdCl2溶液中，用NaOH水溶液调节溶液的pH为9.0，然后沸水浴加热1.5h，得到碲化镉量子点溶液；
4）量子点包硅微球的制备：将上述碲化镉量子点溶液加入乙醇中，加入氨水，搅拌条件下加入四乙氧基硅烷（TEOS），20℃反应2h，离心后弃去上清液，将沉淀物在乙醇中洗涤两次，烘干后得到粉末状量子点包硅微球（CdTe@SiO2）；
5）金纳米簇的合成：将反应容器用王水、乙醇、二次水依次洗涤后，先加入牛血清白蛋白（BSA）溶液，然后在37℃和搅拌条件下将氯金酸（HAuCl4）溶液加入牛血清白蛋白（BSA）溶液中，2分钟后，再加入氢氧化钠（NaOH）水溶液引发反应，反应12h后，所得产物透析48h，去除未反应的氢氧化钠（NaOH）及原料，得到金纳米簇溶液；
6）荧光探针前驱体微球的合成：将4）中所得的粉末状量子点包硅微球溶于乙醇中，再加入上述金纳米簇溶液和氨水，超声5分钟，然后加入四乙氧基硅烷（TEOS）、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB），在20℃温度下反应2h，将所得产物离心分离，沉淀物用60℃乙醇与水逐次洗涤，以除去CTAB及未反应物，得到可用于后编码的荧光探针前驱体微球；
7）双荧光发射纳米探针的制备：将上述荧光探针前驱体微球溶于水中，加入不同浓度的等体积荧光调节剂L-半胱氨酸后，反应20min后，即可制得两波长处荧光强度比值不同的一系列双荧光发射纳米探针。
2.根据权利要求1所述采用后编码方式制备双荧光发射纳米探针的方法，其特征在于：所述含MPA的CdCl2溶液中MPA与CdCl2的用量摩尔比为2.4:1。
3.根据权利要求1所述采用后编码方式制备双荧光发射纳米探针的方法，其特征在于：所述NaHTe溶液中NaBH4与蒸馏水的用量比为45.5mg/mL，Te与NaBH4的摩尔比为1:19。
4.根据权利要求1所述采用后编码方式制备双荧光发射纳米探针的方法，其特征在
于：所述碲化镉量子点溶液的制备中Te 与MPA的摩尔比为1:4.8，调节溶液pH的NaOH水溶液的浓度为1.0mol/L。
5.根据权利要求1所述采用后编码方式制备双荧光发射纳米探针的方法，其特征在于：所述量子点包硅微球的制备中氨水的质量百分比浓度为25%，氨水、乙醇、四乙氧基硅烷（TEOS）、碲化镉量子点的用量比为50μL：10mL：50μL：4mL。
6.根据权利要求1所述采用后编码方式制备双荧光发射纳米探针的方法，其特征在于：所述金纳米簇的合成中氯金酸（HAuCl4）溶液的浓度为5-20mM，牛血清白蛋白（BSA）溶液浓度为30-50mg/mL，氢氧化钠（NaOH）水溶液浓度为0.5-1.0mol/L，氯金酸（HAuCl4）溶液、牛血清白蛋白（BSA）溶液与氢氧化钠（NaOH）水溶液的体积比为1：1：0.1。
7.根据权利要求1所述采用后编码方式制备双荧光发射纳米探针的方法，其特征在于：所述荧光后编码前驱体微球的合成中量子点包硅微球、乙醇、金纳米簇、氨水、四乙氧基硅烷（TEOS）、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）的用量比为10mg：15mL：0.2mL：50μL：50μL：
8.根据权利要求1所述采用后编码方式制备双荧光发射纳米探针的方法，其特征在于：所述双荧光发射纳米探针的制备中荧光后编码前驱体微球溶于水的浓度为-4
0.1-0.5mg/mL，加入L-半胱氨酸的浓度范围为0-8.0×10 mol/L。
一种采用后编码方式制备双荧光发射纳米探针的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及双荧光发射纳米探针的制备技术，特别是一种采用后编码方式制备双荧光发射纳米探针的方法。
背景技术
[0002] 在生物技术领域，高通量成像与多色流动计数器的发展，推动了高容量的荧光载体和纳米探针的制备。当多元分析，如多色标记、多色成像等对成像密码子的需求量大时，就需要发展一种新型的探针编码策略来满足这种迫切的需求。目前存在前编码和后编码两种编码策略。由于前编码方式制备探针的过程相当耗时，而且编码元素用量的改变会严重影响密码子的制备过程顺利进行，因此无法满足多元分析中对密码子需求量大的问题。与此相比，后编码方式由于可编码探针数量大，操作相对简便，产物均一性好，易重复合成等优点(C.L.Wu,J.S.Zheng,C.B.Huang,J.P.Lai,S.Y.Li,C.Chen,Y.B.Zhao,Angew.Chem.Int.Ed.2007,46,5393–5396)，而得到越来越多的广泛关注。
[0003] 通常用于制备荧光探针的荧光编码元素主要有以下几种：染料、量子点、金、银纳米簇等。其中，量子点（quantum dots，QDs）是由Ⅱ-Ⅵ族或Ⅲ-Ⅴ族元素组成的半导体纳米晶粒。由于量子点具有激发光谱宽且连续、发射光谱窄且对称、发射波长可调、荧光量子产率高等优越的荧光特性，近年来，成为生物、医学领域最有生命力的发展方向之一（M.Bruchez Jr,M.Moronne,P.Gin,S.Weiss,A.P.Alivisatos,Science,1998,281(5385):2013-2016;W.C.W.Chan,S.Nie,Science,1998,281(5385):2016-2018）；金纳米簇，是一种新兴的荧光材料，由于超小的尺寸，无生物毒性，近红外发射，良好的生物相容性等特点（J.P.Xie,Y.G.Zheng,J.Y.Ying,J.Am.Chem.Soc.2009,131,888–889），它也可以作为一种理想的荧光编码元素。
[0004] 本发明采用后编码方式制备双荧光发射纳米探针，利用优良荧光性能的量子点与金纳米簇作为荧光编码元素，硅球作为荧光元素的载体，先合成新型的双荧光杂化结构微球作为荧光编码的前驱体，通过加入光学调节剂的后编码方式，简单方便地制备得到一系列荧光强度比值不同且光学分辨率高的双荧光发射纳米探针。
发明内容
[0005] 本发明的目的在于针对上述技术分析，提供一种采用后编码方式制备双荧光发射纳米探针的方法，该后编码方式通过调节剂的加入，使得到的纳米探针中两编码元素间的荧光强度比值更大，有利于以更高的分辨率观察到荧光信号的变化；且该制备方法过程简单，编码探针具有不可逆性，不同批次间重现性较好，不同批次间重现性较好，提供了一种制备大量双荧光发射纳米探针的有效方法。
[0006] 本发明的技术方案：
[0007] 一种采用后编码方式制备双荧光发射纳米探针的方法，以碲化镉量子点与金纳米簇作为荧光编码元素，硅球作为编码元素的载体，结合量子点与金纳米簇的荧光特性，先合成可用于后编码的荧光探针前躯体，再利用该前躯体中加入光学调节剂L-半胱氨酸的方法制备双荧光发射纳米探针，包括如下步骤：
[0008] 1）将巯基丙酸（MPA）加入到CdCl2中，得到含巯基丙酸的CdCl2溶液；
[0009] 2）将碲粉（Te）、NaBH4与蒸馏水混合，在氮气保护并搅拌的条件下进行还原反应得到NaHTe溶液；
[0010] 3）碲化镉量子点溶液的制备：将NaHTe溶液快速加入到上述含巯基丙酸的CdCl2溶液中，用NaOH水溶液调节溶液的pH为9.0，然后沸水浴加热1.5h，得到碲化镉量子点溶液；
[0011] 4）量子点包硅微球的制备：将上述碲化镉量子点溶液加入乙醇中，加入氨水，搅拌条件下加入四乙氧基硅烷（TEOS），20℃反应2h，离心后弃去上清液，将沉淀物在乙醇中洗涤两次，烘干后得到粉末状量子点包硅微球（CdTe@SiO2）；
[0012] 5）金纳米簇的合成：将反应容器用王水、乙醇、二次水依次洗涤后，先加入牛血清白蛋白（BSA）溶液，然后在37℃和搅拌条件下将氯金酸（HAuCl4）溶液加入牛血清白蛋白（BSA）溶液中，2分钟后，再加入氢氧化钠（NaOH）水溶液引发反应，反应12h后，所得产物透析48h，去除未反应的氢氧化钠（NaOH）及原料，得到金纳米簇溶液；
[0013] 6）荧光探针前驱体微球的合成：将4）中所得的粉末状量子点包硅微球溶于乙醇中，再加入上述金纳米簇溶液和氨水，超声5分钟，然后加入四乙氧基硅烷（TEOS）、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB），在20℃温度下反应2h，将所得产物离心分离，沉淀物用60℃乙醇与水逐次洗涤，以除去CTAB及未反应物，得到可用于后编码的荧光探针前躯体微球；
[0014] 7）双荧光发射纳米探针的制备：将上述荧光探针前驱体微球溶于水中，加入不同浓度的等体积荧光调节剂L-半胱氨酸后，反应20min后，即可制得两波长处荧光强度比值不同的一系列双荧光发射纳米探针。
[0015] 所述含MPA的CdCl2溶液中MPA与CdCl2的用量摩尔比为2.4:1。
[0016] 所述NaHTe溶液中NaBH4与蒸馏水的用量比为45.5mg/mL，Te与NaBH4的摩尔比为1:19。
[0017] 所述碲化镉量子点溶液的制备中Te2-与MPA的摩尔比为1:4.8，调节溶液pH的NaOH水溶液的浓度为1.0mol/L。
[0018] 所述量子点包硅微球的制中氨水的质量百分比浓度为25%，氨水、乙醇、四乙氧基硅烷（TEOS）、碲化镉量子点的用量比为50μL：10mL：50μL：4mL。
[0019] 所述金纳米簇的合成中氯金酸（HAuCl4）溶液的浓度为5-20mM，牛血清白蛋白（BSA）溶液浓度为30-50mg/mL，氢氧化钠（NaOH）水溶液浓度为0.5-1.0mol/L，氯金酸（HAuCl4）溶液、牛血清白蛋白（BSA）溶液与氢氧化钠（NaOH）水溶液的体积比为1：1：0.1。
[0020] 所述可用于后编码的荧光探针前躯体微球的合成中量子点包硅微球、乙醇、金纳米簇、氨水、四乙氧基硅烷（TEOS）、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）的用量比为10mg：15mL：0.2mL：50μL：50μL：0.01g，其中氨水的质量百分比浓度为25%。
[0021] 所述双荧光发射纳米探针的制备中荧光后编码前驱体微球溶于水的浓度为-40.1-0.5mg/mL，加入L-半胱氨酸的浓度范围为0-8.0×10 mol/L。
[0022] 本发明的优点和积极效果：
[0023] 1）金纳米簇作为荧光编码元素，包覆在外层硅层，其无毒性及良好生物相容性，近红外发射等优点，利于在生物成像、标记中的应用；
[0024] 2）硅球作为荧光编码元素的载体，不仅生物相容性好，而且可通过调节硅层的厚度，制备可用于后编码的荧光探针前躯体微球；
[0025] 3）所合成的可用于后编码的荧光探针前躯体微球，可以通过加入荧光调节剂的方式，简单方便地制备出大量光学分辨率好的双荧光发射纳米探针，并且批批间的可重现性良好。
附图说明
[0026] 图1是该双荧光发射纳米探针前躯体杂化微球的透射电镜图。
[0027] 图2是该双荧光发射纳米探针前躯体中加入不同量的荧光调节剂（L-半胱氨酸）后，对应产生的一系列双荧光发射纳米探针的荧光光谱图。
[0028] 图3是荧光调节剂（L-半胱氨酸）的浓度与产生双荧光发射纳米探针的荧光强度比值的关系图。
具体实施方式
[0029] 实施例：
[0030] 一种采用后编码方式制备双荧光发射纳米探针的方法，以碲化镉量子点与金纳米簇作为荧光编码元素，硅球作为编码元素的载体，结合量子点与金纳米簇的荧光特性，先合成可用于后编码的荧光探针前躯体，再利用该前躯体中加入光学调节剂L-半胱氨酸的方法制备双荧光发射纳米探针，包括如下步骤：
[0031] 1）将53μL巯基丙酸（MPA）加入到12.5mL CdCl2中，得到含巯基丙酸的CdCl2溶液；
[0032] 2）将0.064g碲粉（Te）、0.36g NaBH4与8mL蒸馏水混合，在氮气保护并搅拌的条件下进行还原反应得到NaHTe溶液；
[0033] 3）碲化镉量子点溶液的制备：将NaHTe溶液快速加入到上述含巯基丙酸的CdCl2溶液中，用NaOH水溶液调节溶液的pH为9.0，然后沸水浴加热1.5h，得到碲化镉量子点溶液；
[0034] 4）量子点包硅微球的制备：将4mL上述碲化镉量子点溶液加入10mL乙醇中，加入50μL质量百分比浓度为25%的氨水，搅拌条件下加入50μL四乙氧基硅烷（TEOS），20℃反应2h，离心后弃去上清液，将沉淀物在乙醇中洗涤两次,烘干后得到粉末状得到量子点包硅微球（CdTe@SiO2）；
[0035] 5）金纳米簇的合成：将反应容器用王水、乙醇、二次水依次洗涤后，先加入1mL浓度为50mg/mL的牛血清白蛋白（BSA）溶液，然后在37℃和搅拌条件下将1mL浓度为10mM的氯金酸（HAuCl4）溶液加入牛血清白蛋白（BSA）溶液中，2分钟后，再加入0.1mL浓度为1.0mol/L氢氧化钠（NaOH）水溶液引发反应，反应12h后，所得产物透析48h，去除未反应的氢氧化钠（NaOH）及原料，得到金纳米簇溶液；
[0036] 6）荧光探针前驱体微球的合成：将10mg步骤4）中所得的粉末状量子点包硅微球溶于15mL乙醇中，再加入上述金纳米簇溶液0.2mL和氨水50μL，超声5分钟，然后加入50μL四乙氧基硅烷（TEOS）、0.01g十六烷基三甲基溴化铵（CTAB），在20℃温度下反应2h，将所得产物离心分离，沉淀物用60℃乙醇与水逐次洗涤，以除去CTAB及未反应物，得到可用于后编码的荧光探针前躯体微球；
[0037] 7）双荧光发射纳米探针的制备：在200μL浓度为0.1mg/mL的荧光探针前驱体微-4球水溶液中，分别加入0-8.0×10 mol/L不同浓度的等体积荧光调节剂L-半胱氨酸后，反应20min后，即可制得两波长处荧光强度比值不同的一系列双荧光发射纳米探针。
[0038] 用荧光分光光度计来测定不同L-半胱氨酸加入量，对应产生的荧光探针在两个最大发射波长处荧光强度，继而求得强度的比值（荧光分光光度计：日立，日本，F-4500型；激发狭缝5nm，发射狭缝10nm，激发波长设定在380nm，在450-730nm范围内记录实验数据，光电管的电压为700V）。
[0039] 图1是该双荧光发射纳米探针前躯体杂化微球的透射电镜图。图中显示：该方法制备的荧光探针前躯体微球的尺寸约为400nm，具有双层结构，外层硅层约为10nm。
[0040] 图2是该双荧光发射纳米探针前躯体中加入不同量的荧光调节剂（L-半胱氨酸）后，对应产生的一系列双荧光发射纳米探针的荧光光谱图。图中可以看出，随着L-半胱氨酸的加入（箭头方向），碲化镉量子点的荧光强度逐渐增强，而金纳米簇的荧光强度逐渐降低。
[0041] 图3是荧光调节剂（L-半胱氨酸）的浓度与所产生双荧光发射纳米探针的荧光强-4度比值间的关系图。图中可以看出，在L-半胱氨酸浓度为0-8×10 mol/L范围内，每个固定的L-半胱氨酸浓度均会对于产生一个确定荧光强度比值的纳米探针，通过这种调节L-半胱氨酸量的后编码方式，可以制备得到一系列双荧光发射纳米探针。
