大白菜eIF4E.a突变位点特异性分子标记及其应用

摘要

本发明公开了两种与大白菜eIF4E.a野生型和突变体鉴定直接相关的位点特异性显性ASM标记，其中一种：与野生型位点检测相关的标记命名为ASM-4E.a-s，如SEQ ID No.1所示；对应的突变位点检测相关的标记命名为ASM-4e.a-s，SEQ ID No.3所示。另外一种：与野生型位点检测相关的标记命名为ASM-4E.a-lc，如SEQ ID No.2所示；对应的突变位点检测相关的标记分别命名为ASM-4e.a-lc，SEQ ID No.4所示。本发明还公开了一种用于鉴别上述两种特异性显性分子标记的引物，如SEQ ID NO.5、6、7所示。本发明的标记和引物可以作为分子标记应用于大白菜种质资源鉴定和育种辅助选育，选择含有06-247或Guan291中eIF4E.a突变类型的种质材料或转育后代。

权利要求

1.一种大白菜eIF4E.a突变位点特异性分子标记，其特征在于：与野生型位点检测相关的标记命名为ASM-4E.a-s，片段大小384bp，如SEQ ID No.1所示；对应的突变位点检测相关的标记命名为ASM-4e.a-s，片段大小383bp，SEQ ID No.3所示。

2.一种大白菜eIF4E.a突变位点特异性分子标记，其特征在于：与野生型位点检测相关的标记命名为ASM-4E.a-lc，片段大小348bp，如SEQ ID No.2所示；对应的突变位点检测相关的标记命名为ASM-4e.a-lc，片段大小347bp，SEQ ID No.4所示。

3.权利要求1或2所述的大白菜eIF4E.a突变位点特异性分子标记的引物，其特征在于：引物序列如下：正向引物FW：5'-GAAGCTCCTTACGATCCGTCTTCAC-3'；

正向引物Fm：5'-GGAAGCTCCTTACGATCCGTCTTCT-3'；

反向引物RWm：5'-TGGCACAGATAGGATCCTCCCAC-3'；

如SEQ ID NO.5、6、7所示；

这三个引物有以下两种组合：

正向引物FW和反向引物RWm的组合用于扩增ASM-4E.a-s/ASM-4e.a-s；

正向引物Fm和反向引物RWm的组合用于扩增ASM-4E.a-lc/ASM-4e.a-lc。

4.权利要求1或2所述的大白菜eIF4E.a突变位点特异性分子标记在鉴别大白菜eIF4E.a基因位点的基因型中的应用。

5.权利要求3所述的引物在鉴别大白菜eIF4E.a基因位点的基因型中的应用。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：具体应用方式为：利用（FW+RWm）组合和（Fm+RWm）组合这两套引物组合，对待测个体的基因组DNA进行两次PCR扩增，检测扩增片段的有无，如果（FW+RWm）组合扩增出384bp或348bp的条带，则为野生型，扩不出则为突变型；如果（Fm+RWm）组合扩增出383bp或347bp的条带则为突变型，扩不出则为野生型；如果两个组合都能扩出条带则为杂合型。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述PCR扩增具体为：在20μl反应体系中，包含1×TransStart FastPfu buffer；20ng的基因组DNA；0.4μM正反向引物；

0.25mMdNTPmix;1个单位的TransStart FastPfu DNA聚合酶；

PCR循环条件：95℃预变性5分钟;接着是95℃变性30秒，57.5℃退火30秒，72℃延伸40秒，35-38个循环，最后72℃延伸10分钟。

8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：具体应用方式为：利用（FW+RWm）组合和（Fm+RWm）组合这两套引物组合，对待测个体的基因组DNA进行两次PCR扩增，检测扩增片段的有无，如果（FW+RWm）组合扩增出384bp或348bp的条带，则为野生型，扩不出则为突变型；如果（Fm+RWm）组合扩增出383bp或347bp的条带则为突变型，扩不出则为野生型；如果两个组合都能扩出条带则为杂合型。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述PCR扩增具体为：在20μl反应体系中，包含1×TransStart FastPfu buffer；20ng的基因组DNA；0.4μM正反向引物；

0.25mMdNTPmix;1个单位的TransStart FastPfu DNA聚合酶；

PCR循环条件：95℃预变性5分钟;接着是95℃变性30秒，57.5℃退火30秒，72℃延伸40秒，35-38个循环，最后72℃延伸10分钟。

说明书

大白菜eIF4E.a突变位点特异性分子标记及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种基因的突变体及其相关位点特异性分子标记的开发，尤其涉及一种大白菜真核生物翻译起始因子eIF4E.a的突变及其位点特异性分子标记开发和应用。突变体能够为选育含该突变位点的抗病毒大白菜种质提供变异源，位点特异分子标记能够直接应用于分子标记辅助育种来选择含有该突变位点的大白菜材料，提高eIF4E突变体的选择效率，属于生物技术领域。

背景技术

[0002] 大白菜(Brassica rapa L.ssp pekinensis)是十字花科重要的蔬菜作物，原产于中国，目前在世界各地均有种植。尤其在我国蔬菜的常年供应和淡季蔬菜调剂中已经成为蔬菜产品供给的重要组成部分，因而对人们生活具有重要影响。在大白菜生产过程中，常遭病毒病、霜霉病和软腐病等病害的威胁。就整体而言病毒病的危害最为严重，且没有普遍适用的抗病毒病药剂或其它行之有效的控制技术。培育抗病毒大白菜新品种是应对病毒病危害的首选途径[王雪,刘玉梅,李汉霞,张扬勇,方智远.芸薹属作物抗芜菁花叶病毒育种研究进展.园艺学报.2005,32(5):939-946]。苗立强等[苗立强,张耀伟,崔崇士.我国白菜抗病育种研究进展.东北农业大学学报.2008,37(4):529-533]研究发现，我国大白菜病毒病的病原分离物中70%是芜菁花叶病毒(Turnip Mosaic Virus,TuMV)、还有少量黄瓜花叶病毒(Cucumber Mosaic Virus,CMV)和其它病毒。因此我国大白菜抗病毒病育种的主攻目标是抗TuMV。

[0003] 培育抗TuMV大白菜新品种的两个关键要素是拥有丰富的抗TuMV种质资源和高效的育种效率。我国是大白菜原产地，种质资源非常丰富，其中不乏抗TuMV的优良资源，同时也有更多品质优良但不抗病毒的资源。在常规育种实践中，常通过回交转育的手段获得更多遗传背景丰富的抗性材料。随着分子标记技术的兴起及研究的深入，标记辅助选择在常规育种操作中已经成为提高选择效率、缩短育种年限的主要手段。一些跨国的育种集团更是不惜重金把创新资源和开发与重要农艺性状紧密连锁的分子标记作为育种攻关的主要内容。

[0004] 一般而言，要寻找与某农艺性状紧密连锁的分子标记，往往需要先选择在目标性状方面存在显著差异的亲本，并构建分离群体(F2,RI,BC1,DH等)，采用混合分群(BSA)和传统的分子标记（如RAPD,SRAP，AFLP，SSR等）技术进行分析，用相应的软件分析所得标记与性状的连锁距离，最终得到与目标性状连锁的分子标记。目前报道的与大白菜抗芜菁花叶病毒(TuMV)性状连锁的分子标记正是采用上述方法得到的。由于不同研究者所用材料和所选择的标记类型不同，所得到的与抗病毒特性连锁的标记距离亦不同，介于3.8-15.36cM。由于这些标记与性状的连锁程度不够紧密，因而其用于大白菜抗TuMV辅助育种尚有一定的距离。

[0005] 另一方面，由于拟南芥与大白菜同属十字花科,其抗病毒相关功能基因已有较深入的研究；同时大白菜的全基因组序列已经公布(Wang et al.,2011，the genome of the mesopolyploid crop species Brassica rapa.Nature Genetics.43(10):1035-1039)。所以可以将拟南芥功能基因研究的结果和大白菜基因组序列信息，直接从抗病毒相关功能基因的角度入手，通过对大白菜自然群体在某一个重要功能基因位点的自然变异入手，寻找抗病毒相关功能基因的突变体；针对突变位点开发位点特异性分子标记(Allele specific marker，ASM)，则这种标记本身与性状直接相关，这无疑会使标记辅助选择更加精准。

[0006] 在抗病毒功能基因研究方面近年来发现，由隐性单基因控制的抗病毒性状多与真核生物翻译起始因子4E及其异构体的突变有关。Wittmann等[Wittmann S,Chatel H,Fortin MG，Laliberte JF.Interaction of the viral protein genome linked of Turnip mosaic virus with the translational eukaryotic initiation factor(iso)4E of Arabidopsis thaliana using the yeast two-hybrid system.Virology.1997,234:84-92]和Léonard等[Léonard S,Plante D,Wittmann S,Daigneault N,Fortin MG，LalibertéJF.Complex formation between potyvirus VPg and translation eukaryotic initiation factor 4E correlates with virus infectivity.J.Virol.2000,74:7730-7737]分别证明：拟南芥eIF4E和eIF(iso)4E可以同TuMV的病毒基因组结合蛋白(VPg)相互作用。这种相互作用的关键氨基酸与真核生物自身mRNA翻译所需的关键氨基酸位点不同，所以eIF4E及eIF(iso)4E的一些氨基酸突变不影响植物自身的生长发育、却导致病毒与寄主不能发生互作，从而使寄主表现出抵抗病毒侵染的特性。Ryder在生菜[Ryder EJ.1970.Inheritance of resistance to common lettuce mosaic.Am Soc Horticult Sci.95:378–379]、Ruffel 在 辣 椒 [Ruffel S,Dussault MH,Palloix A,Moury B,Bendahmane A,Robaglia C,Caranta C.2002.A natural recessive resistance gene against potato virus Y in peper corresponds to the eukaryotic initiation factor 4E(eIF4E).Plant J.2002 Dec;32(6):1067-75]、Nieto在甜瓜[Nieto C,Piron F,Dalmais M,Marco CF，Moriones E,Gomez-Guillamon ML,Truniger V，Gomez P，Garcia-Mas J,Aranda MA,Bendahmane A.2007.EcoTILLING for the identification of allelic variants of melon eIF4E,a factor that controls virus susceptibility.BMC Plant Biology.7,34-42]等重要蔬菜作用中已经发现了不少这样的突变体资源，Yeam等[Yeam I,Kang BC,Lindeman W，Frantz JD,Faber N,and Jahn MM.2005.Allele-specific CAPS markers based on point mutations in resistance alleles at the pvr1 locus encoding eIF4E in Capsicum.Theor.Appl.Genet.NNO,178-186]在辣椒中针对突变位点开发了相应的位点特异性CAPs标记并用于抗病毒材料转育时的辅助选择。

[0007] 我国大白菜种质资源十分丰富，从其他作物的eIF4E和eIF(iso)4E突变及其在抗病毒中的作用推测，大白菜自然群体中也可能存在eIF4E和eIF(iso)4E的突变体，且这种突变可能与大白菜的抗病毒特性有关。目前，国内外有关大白菜抗病毒特性与eIF4E和eIF(iso)4E关系的研究很少，涉及的材料极为有限。Rusholme等[Rusholme RL，Higgins EE，Walsh JA，Lydiate DJ.Genetic control of broad-spectrum resistance to turnip mosaic virus in Brassica rapa(Chinese cabbage).Journal of General Virology.2007,88:3177–3186]以高抗TuMV的大白菜自交系RLR22和病毒敏感材料R-O-18为亲本，构建BC1F1群体，进行抗TuMV(CDN 1和CZE1株系)遗传研究。结果发现了一个大白菜抗病毒隐性遗传位点retr01和一个显性位点ConTR01，RFLP标记关联分析分别发现了与retr01连锁的标记pN202e1和与ConTR01连锁的标记pO85e1。进一步采用southern杂交的手段发现，在A基因组中分别有3个拷贝的eIF4E(分别位于染色体N1、N3和N8)和3个拷贝的eIF(iso)4E(分别位于染色体N4、N5和N8)。作者根据杂交结果，推测位于第8染色体上的eIF4E和eIF(iso)4E可能与ConTR01有关，而位于第4染色体上的eIF(iso)4E可能与retr01有关。文中没有关于两个基因的序列信息报道。Jenner等 [Jenner CE,Nellist CF,Barker GC,Walsh JA.Turnip mosaic virus(TuMV)is able to use alleles of both eIF4E and eIF(iso)4E from multiple loci of the diploid Brassica rapa.Mol Plant Microbe Interact.2010，3(11):1498-1505]从 病毒敏感材料R-O-18中克隆得到了eIF4E和eIF(iso)4E各三个拷贝，分别命名为BraA.eIF4E.a、BraA.eIF4E.b、BraA.eIF4E.c和BraA.eIF(iso)4E.a、BraA.eIF(iso)4E.b、BraA.eIF(iso)4E.c。除BraA.eIF4E.b和BraA.eIF(iso)4E.b以外，其余4个基因分别转化拟南芥At.eIF(iso)4E功能缺失突变体[DupratA,Caranta C,Revers F，Menand B,Browning KS,Robaglia C.2002.The Arabidopsis eukaryotic initiation factor(iso)4E is dispensable for plant growth but required for susceptibility to potyviruses.The Plant Journal,32:927–934]，然后对所有转基因株系接种TuMV加拿大株系CDN1，进行病毒敏感性互补实验。根据病情指数及ELISA结果，发现所转的四个基因均能使突变体完全或部分恢复对TuMV侵染的敏感性。这表明，在TuMV侵染白菜类蔬菜作物时，eIF4E和eIF(iso)4E都可能参与病毒与寄主的相互作用。同时作者指出，要想在大白菜中获得与eIF4E和eIF(iso)4E有关的抗病毒材料，则这几个基因需同时丧失功能。截止目前，大白菜在上述两个基因位点的突变及相关突变体检测的标记开发国内外未见报道。

[0008] 鉴于此，有必要对我国丰富的大白菜抗/感TuMV材料中eIF4E和eIF(iso)4E各个位点的多态性进行广泛筛查，以发现各位点可能存在的突变类型；同时针对突变位点与野生型的序列差异，开发与突变体检测有关的位点特异性分子标记。有以下几个方面的潜在益处：①可以将该标记用于筛查大白菜种群，提供高效的大白菜突变体检测手段；②当其他位点发现突变类型时，可以采用同样的方法开发标记；③当多个位点的突变位于不同的材料中时，可以通过标记辅助选择手段将多位点的突变聚合在一起，创造广谱抗TuMV大白菜新种质；④在培育广谱抗TuMV大白菜新品种时，可以实现标记辅助选择，提高育种效率。由于这种标记直接位于功能基因内部，因此选择的准确率达100%。

发明内容

[0009] 针对上述现有技术，针对目前大白菜在eIF4E和eIF(iso)4E基因位点突变体鉴定方面的空白，本发明首先获得了两个eIF4E.a位点的突变体，其次根据突变位点的序列特点，设计引物，开发了鉴定野生型和突变体的ASM显性标记并用于标记辅助选择。

[0010] 本发明是通过以下技术方案实现的：

[0011] 一种与大白菜eIF4E.a野生型和突变体鉴定直接相关的位点特异性显性ASM标记：与野生型位点检测相关的标记命名为ASM-4E.a-s，片段大小384bp，如SEQ ID No.1所示；对应的突变位点检测相关的标记命名为ASM-4e.a-s，片段大小383bp，SEQ ID No.3所示。

[0012] 另外一种大白菜eIF4E.a野生型和突变体鉴定直接相关的位点特异性显性ASM标记：与野生型位点检测相关的标记命名为ASM-4E.a-lc，片段大小348bp，如SEQ ID No.2所示；对应的突变位点检测相关的标记命名为ASM-4e.a-lc，片段大小347bp，SEQ ID No.4所示。

[0013] 一种用于鉴别上述两种特异性显性分子标记的引物是：

[0014] 正向引物FW：5'-GAAGCTCCTTACGATCCGTCTTCAC-3'；

[0015] 正向引物Fm：5'-GGAAGCTCCTTACGATCCGTCTTCT-3'；

[0016] 反向引物RWm：5'-TGGCACAGATAGGATCCTCCCAC-3'；如SEQ ID NO.5、6、7所示。

[0017] 本发明采用同源克隆技术从4份大白菜抗/感TuMV自交系材料中分别克隆到了eIF4E.a基因全序列，将4个序列与GenBank中已经报道的B.rapa自交系R-O-18的eIF4E.a比较后发现有多处SNPs的差异，表明所克隆到的BrA.eIF4E.a为新的单倍型。进一步通过编码区预测和氨基酸序列推导发现，其中两份材料的eIF4E.a基因ORF虽然与R-O-18的ORF有几个SNPs的差异，但编码产物与R-O-18的完全一致；而另外两份材料的ORF则在第250位缺失了一个碱基导致ORF移码突变。据此确定缺失一个碱基的eIF4E.a是突变基因。
为了便于在琼脂糖凝胶上检测这一个碱基的差异，我们根据突变位点设计了两个正向引物(FW和Fm，其中FW用于鉴别野生型，Fm用于鉴别突变型)，在下游保守区设计了一个通用反向引物RWm。在确保材料基因组DNA提取完整的前提下，当FW与RWm组合对基因组DNA进行扩增时，凡能够扩增出条带的，就是野生型，凡不能扩出条带的就是突变型；反之，当Fm与RWm组合对基因组DNA进行扩增时，凡能扩出条带的就是突变型，凡是不能扩出条带的就是野生型；另外，当两种组合都能扩出条带的材料是杂合型。所以两种引物组合结合使用，互相印证，对野生型、突变体以及杂合型的鉴别效率达100%。

[0018] 所述ASM标记的筛选过程如下：

[0019] (1)以大白菜抗TuMV自交系He102、8407和TuMV敏感自交系06-247、Guan291为材料， 采用CTAB法，提取两者的基因组DNA。

[0020] (2)依据GenBank中已经报道的B.rapa自交系R-O-18的eIF4E.a序列，在编码区上下游设计引物。采用同源克隆技术，从四份材料中分别克隆得到了其eIF4E.a并进行测序。

[0021] (3)将所得eIF4E.a与R-O-18的eIF4E.a序列分别进行比较，发现了多处SNPs和小片段插入及缺失；同时对编码区进行推导和翻译产物的预测，发现来自两份敏感材料06-247和Guan291的eIF4E.a在编码区缺失一个碱基导致了移码突变，只翻译产生一个
103个氨基酸的小肽，而另外两份抗性材料He102和8407的eIF4E.a其编码区虽与R-O-18有几处SNPs的差异，但翻译产物完全一致。所以根据碱基缺失位点设计两个正向引物与一个通用的反向引物，两正向引物分别与反向引物组合，再扩增四份材料，结果在四份中分别得到了条带有和无的扩增结果，此即为显性标记。

[0022] 所述标记可以作为分子标记应用于大白菜种质资源鉴定和育种辅助选育，选择含有06-247或Guan291中eIF4E.a突变类型的种质材料或转育后代。具体应用方式为：利用ASM标记的两套引物组合对待测个体的基因组DNA进行两次PCR扩增，检测扩增片段的有无，如果（FW+RWm）组合扩增出384bp或348bp的条带，则为野生型，扩不出则为突变型；或者如果（Fm+RWm）组合扩增出383bp或347bp的条带则为突变型，扩不出则为野生型；如果两个组合都能扩出条带则为杂合型。

[0023] 本发明的有益效果是：由于大白菜eIF4E位点上受多个基因的控制，在同一份材料中多基因同时突变的频率较低。如果能够分别在各个位点鉴定出各自的突变体，开发针对各个突变体检测的位点特异性分子标记，则可以通过聚合杂交并结合分子标记辅助选择，将多个突变位点聚合在同一份材料中。本发明利用同源克隆技术发现了eIF4E.a位点的一个突变体并开发了鉴定该位点的分子标记。利用该标记可以对回交转育后代的基因型进行准确选择。同时该标记还可用于对大白菜种质资源进行筛查，以寻找遗传背景更加丰富的突变体材料。其优点具体如下：

[0024] 1.本发明获得的与eIF4E.a位点突变直接相关的标记，结果稳定、准确、操作简便。适用于不同遗传背景大白菜材料的筛选，是一个普遍性标记。它能够准确鉴定大白菜种质资源在该位点的基因型，极大地提高了对大白菜种质资源在eIF4E.a位点突变体的筛选效率。

[0025] 2.在大白菜eIF4E基因序列及突变型研究方面，仅Jenner等(2010)报道了B.rapa的一个自交系R-O-18的序列，其它突变体未见报道。针对该突变位点的特异标记，可以为种质资源鉴定、通过回交转育等手段筛选和培育不同遗传背景的突变体材料提供辅助选择工具。本发明的应用可大大简化筛选手段、缩短转育年限，避免了常规育种方法中选择的盲目性。

附图说明

[0026] 图1：四份大白菜材料eIF4E.a基因的扩增(琼脂糖凝胶电泳)，其中1、2、3、4分别代表06-247、Guan291、He102和8407四份大白菜自交系材料，M为DNA分子量标准DL2000plus。

[0027] 图2：来自06-247、Guan291、He102、8407以及GenBank检索到的R-O-18的eIF4E.a基因组序列比对(图中示有差异的部分)。

[0028] 图3：四份材料及R-O-18的eIF4E.a的开放阅读框(ORF)序列比对图(图中示差异明显部分，椭圆圈出部分是06-247及Guan291碱基缺失部分，其余均为同义突变)。

[0029] 图4：四种推导的氨基酸序列与来自R-O-18的eIF4E.a氨基酸序列比较(图中可以看出06-247与Guan291从第84位氨基酸开始发生移码突变，并提前终止)。

[0030] 图5：两套ASM引物对四份大白菜材料基因组DNA的扩增结果，1、2、3、4分别指He102，8407，06-247与Guan291。

[0031] 图6：两套ASM引物在不同大白菜资源中的检测结果。

[0032] 图7：两套ASM引物在回交后代中对部分单株的检测结果。

具体实施方式

[0033] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明。实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

[0034] 实施例1、不同大白菜自交系材料中eIF4E.a的克隆

[0035] 1.1大白菜基因组DNA提取

[0036] （1）将大白菜幼苗叶片放入液氮预冷的研钵中，在液氮中充分研磨成粉末；

[0037] （2）待液氮挥发干，立即转移到2ml的离心管中，每100mg材料约加入0.6ml预热至65℃的CTAB提取液，融化后，剧烈振荡混匀样品，65℃水浴放置40-60分钟使细胞裂解；

[0038] （3）裂解结束后，取出样品使其完全冷却至室温。加入等体积的氯仿(chloroform)，轻轻颠倒使混匀，室温放置10分钟；

[0039] （4）室温，12000rpm离心15分钟；

[0040] （5）用移液器小心吸出上层水相，加入新的1.5ml的离心管中，加入500μl的异丙醇(1:1体积)，充分混匀，室温沉淀10min；

[0041] （6）4℃，12000rpm离心10min，小心弃去上清液；

[0042] （7）DNA沉淀用1ml的75%乙醇洗涤。4℃，8000rpm离心10min收集沉淀；

[0043] （8）重复用75%乙醇洗涤一次DNA沉淀；

[0044] （9）去上清，DNA沉淀于无菌操作台上晾干约10-15分钟，DNA略显透明，加入适当体积（30-50μl）的10mM的Tris.HCl，pH8.0使沉淀溶解(可放于4℃冰箱溶解过夜)；

[0045] （10）紫外分光光度计及1% Agrose凝胶电泳检测DNA浓度及质量。

[0046] 1.2eIF4E.a的克隆及序列分析

[0047] (1)检索B.rapa自交系R-O-18的eIF4E.a基因全序列(GenBank:HM131206)，在编码区上游和下游分别设计正反向引物，

[0048] 正向引物：5'GTTCGGAGAAGAGAAGACGGAG3'

[0049] 反向引物：5'AAGATTACAGGCTTTTAAGGCC3'，如SEQ ID NO.17、18所示。

[0050] (2)PCR扩增：在20μl反应体系中，包含1×TransStart FastPfu buffer；20ng的基因组DNA；0.4μM正反向引物；0.25mM dNTPmix;1个单位的TransStart FastPfu DNA聚合酶(TransGenAP221)。PCR循环条件：95℃预变性5分钟;接着是95℃变性30秒，57.5℃退火30秒，72℃延伸40秒，35-38个循环，最后72℃延伸10分钟。

[0051] (3)PCR产物的电泳检测：

[0052] PCR结束后，取10μlPCR扩增产物加入1μl 10×loading buffer，在1%的琼脂糖凝胶上进行电泳，电泳结束后EB染色，自动凝胶成像系统观察拍照。结果见图1。

[0053] (4)PCR产物的克隆测序

[0054] 电 泳 确 认 目 的 条 带 被 扩 增 后，取 1μl PCR扩 增 产 物 加 1μl pEasy-Blunt(TransGen CB101)载体室温连接10分钟，转化大肠杆菌感受态细胞Trans1-T1(TransGen：CD501)，转化菌在含Kan 50μg/ml的LB固体平板上37℃倒置培养16小时左右。菌液PCR检测后挑取阳性克隆委托北京博尚生物技术有限公司进行DNA序列的测定。

[0055] (5)所克隆的大白菜eIF4E.a序列分析

[0056] 将来自TuMV抗性材料He102和8407的基因命名为BrA.eIF4E.a1和BrA.eIF4E.a2，其序列如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示；将来自TuMV敏感材料06-247和Guan的基因命名为BrA.eIF4e.a1和BrA.eIF4e.a2，序列如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示。它们与GenBank中R-O-18的同源基因序列比较的差异显著部分如图2所示。

[0057] 1.3 ORF预测及氨基酸推导

[0058] (1)从GenBank中检索得到R-O-18中同源基因的ORF。用NCBI的Splign(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/splign/splign.cgi?textpage=online&level=form) 工具，分析BrA.eIF4E.a1、BrA.eIF4E.a2以及BrA.eIF4e.a1、BrA.eIF4e.a2的ORF，其序列分别如SEQ ID NO.12-15所示。

[0059] (2)对其ORF进行序列比对，差异部分如图3所示。其中He102和8407的ORF与R-O-18的ORF差异部分主要是SNPs。氨基酸的推导用DNAMAN软件进行，结果发现其全部为同意突变。06-247和Guan291的ORF有一处碱基缺失，如图3椭圆圈出部分。氨基酸预测结果如图4所示，结果06-247和Guan291的eIF4E.a只编码产生103个氨基酸残基的小肽(正常编码产物为227个氨基酸残基)，其序列如SEQ ID NO.16所示。另外两个的编码产物与R-O-18的完全相同。

[0060] (3)据此判定来自06-247和Guan291的eIF4E.a为突变体。

[0061] 实施例2 显性ASM标记的开发

[0062] 2.1引物设计

[0063] 仔细比较BrA.eIF4E.a1、BrA.eIF4E.a2、BrA.eIF4e.a1、BrA.eIF4e.a2的基因组序列，差异较大的区域即介于150-600bp之间，关键是位于外显子区的单碱基缺失，所以针对野生型和突变体在该处的差异，用Primer Premier 5.0软件设计位点特异性引物。与突变体检测相关的正向引物序列为Fm：5'-GGAAGCTCCTTACGATCCGTCTTCT-3'，与野生型检测相关的正向引物为FW:5'-GGAAGCTCCTTACGATCCGTCTTCAC-3'，通用的反向引物为RWm：5'-TGGCACAGATAGGATCCTCCCAC-3'。引物委托北京华大基因公司合成。

[0064] 2.2 ASM标记的获得：

[0065] (1)分别利用(FW+RWm)与(Fm+RWm)引物组合在抗/感材料中的扩增：PCR反应液的配制及扩增条件如1.2第(2)条所述。

[0066] (2)扩增结果的检测如1.2第(3)条所述。

[0067] (3)扩增结果如图5所示，(FW+RWm)引物能够在野生型He102与8407中扩增出384bp和348bp的条带，在突变体06-247与Guan291中扩不出条带；反之(Fm+RWm)组合在野生型He102与8407中扩不出条带，在突变体06-247与Guan291中扩出383bp和347bp的条带。此即显性ASM标记。四种条带的序列如SEQ ID NO.1-4所示。

[0068] 实施例3 ASM标记对大白菜不同资源的鉴定

[0069] (1)不同大白菜资源的基因组DNA提取：随机选取不同的大白菜材料8份，这些材料基因组DNA提取如1.1所述。

[0070] (2)PCR扩增：PCR反应液的配制及扩增条件如1.2第(2)条所述。

[0071] (3)PCR产物的检测如1.2第(3)条所述。检测结果如图6所示，A：FW+RWm组合扩增结果；B：Fm+RWm组合扩增结果；M分子量标准DL2000，1-8是八份大白菜材料。从图中可以看出，1-4是野生型，5-8为突变体。两套引物对纯合野生型和突变体的鉴定效率达100%。

[0072] (4)eIF4E位点的测序验证如1.2所述。将不同材料中完整的eIF4E位点进行克隆测序。

[0073] (5)测序结果表明，利用(FW+RWm)引物组合能够在野生型He102与8407中扩增出条带的，测序结果表明，该位点的确是野生型，扩不出条带的是突变型。因此用任何一套引物组合都能实现对该位点纯合的大白菜材料的准确鉴定。两套引物组合使用，使得对于杂合型的鉴定成为可能。因此两套标记组合使用，对于鉴定eIF4E.a位点的野生/突变以及杂合/纯合性的准确率达100%。

[0074] 实施例4.ASM标记对回交后代的检测

[0075] 4.1回交后代的制备：以He102为母本，06-247与Guan291为父本，蕾期人工杂交获得F1，以F1为母本，分别以06-247与Guan291为父本，同样蕾期人工杂交获得F1BC1。

[0076] 4.2回交群体各单株DNA提取：随机选取F1BC1单株100株，温室育苗，苗期取真叶按照1.1的方法提取基因组DNA。

[0077] 4.3回交后代各单株基因型鉴定：以各单株基因组DNA为模板，用上述引物组合进行PCR扩增及PCR产物的检测，扩增条件及检测方法如1.2所述。部分单株检测结果如图7所示，A：FW+RWm组合扩增结果；B：Fm+RWm组合扩增结果；M分子量标准DL2000，1-8是随机选择的8个F1BC1单株。M:DNA分子量标准D2000。从A图可以看出，1,2,4,6,7是野生型，3，5，8是突变体类型。