一种用于分离和检测志贺氏菌的显色培养基

摘要

本发明公开了一种用于分离和检测志贺氏菌的显色培养基，所述培养基含有酵母粉、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、氯化钠、乳糖、蔗糖、2-脱氧-D-核糖、琼脂粉、β-葡萄糖苷酶显色底物、β-吡喃岩藻糖苷酶显色底物、β-半乳糖苷酶显色底物、酚红、三号胆盐、新生霉素钠、头孢磺啶、头孢克肟，余量为水。本发明的显色培养基可用于志贺氏菌属的四个种的分离和检测，具有特异性强、灵敏度高、易于操作、结果判断简单等优点，适合于各种样本的检测，有广泛的应用前景。显色培养基检测效果可达到进口R&F公司同类产品水平，优于国内已有的同类产品。

权利要求

1.一种用于分离和检测志贺氏菌的显色培养基，每1000 mL培养基含有酵母粉4 g、胰蛋白胨3 g、大豆蛋白胨 6 g、氯化钠5 g、乳糖5 g、蔗糖5 g、2-脱氧-D-核糖5 g、琼脂粉

15 g、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷0.4 g、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-吡喃岩藻糖苷

0.2 g、5-溴-4-氯-3-吲哚-N-乙酰-β-半乳糖苷0.4 g、酚红0.08 g、三号胆盐6 g、新生霉素钠4 mg、头孢磺啶9 mg、头孢克肟0.03 mg，余量为去离子水，pH为6.8±0.2。

说明书

一种用于分离和检测志贺氏菌的显色培养基

技术领域

[0001] 本发明涉及一种微生物检测的培养基，尤其涉及一种用于分离和检测志贺氏菌的显色培养基。

背景技术

[0002] 志贺氏菌属（Shigella）属于肠杆菌科，有四个种，分别为痢疾志贺氏菌（Shigella dysenteriae）、福氏志贺氏菌(Shigellaflexneri)、鲍氏志贺氏菌(Shigellaboydii)、宋内志贺氏菌(Shigellasonnei)。志贺氏菌属的四个种均能在人体中产生细菌性痢疾的溃疡性结肠感染，且是细菌性痢疾中最重要的病原菌。该病原菌一般通过排泄物污染的食物或水传播的。每年世界各地均有大量因志贺氏菌感染而导致疾病的报道，我国受该菌的威胁也越来越大。因此，如何快速、准确、特异地从含有大量其它细菌的食品等样品中分离且鉴别出志贺氏菌具有重要的现实意义。

[0003] 目前对志贺氏菌的检测以选择性培养基为主，其原理是利用志贺氏菌不利用乳糖、蔗糖等糖类物质产酸的特性而与其它肠杆菌相区别。但是由于志贺氏菌的生物学特性与肠杆菌科其它细菌如大肠杆菌、沙门氏菌等非常相似，从而导致用于检测志贺氏菌的传统选择性培养基出现大量假阳性和假阴性结果。有的检测方法曾经建议同时使用三种不同的选择性培养基来检测单个样品，以增加培养基的准确性，这使得分离过程昂贵并且繁琐。虽然近年来已有一些基于分子生物学和免疫学的快速检测方法出现，但一方面，这些方法不能直接用于目标菌的检测，另一方面，这些方法需要专业的技术人员或者昂贵的仪器，使其应用受到了很大的限制。相比较，利用酶活性检测鉴别细菌是一种有效的方法，这种技术可以定量并初步鉴定目标菌，且操作简便，大幅度提高了工作效率。

[0004] 然而目前暂未发现志贺氏菌表达的特异性酶，使得志贺氏菌的显色培养基开发受到了限制。因此目前志贺氏菌显色培养基大多利用特异性酶使其它细菌显色，从而与不显色的志贺氏菌相区分。美国专利（Pat. No. 5,871,944）描述了一种从一个混合细菌样品中鉴别沙门氏菌和志贺氏菌的显色培养基，该培养基利用志贺氏菌不产β-半乳糖苷酶的特性，在培养基中添加相应的底物。然而，一方面，这种培养基不能区分沙门氏菌和志贺氏菌；另一方面，其它不产生β-半乳糖苷酶的细菌将不能与志贺氏菌相区分，从而导致假阳性。虽然目前已有利用沙门氏菌产生硫化氢在培养基上显示黑心来区分沙门氏菌的志贺氏菌显色培养基，但是不产硫化氢的沙门氏菌仍然不能与志贺氏菌区分开，并且有些产硫化氢的沙门氏菌在培养基中产生黑心不明显，也会造成假阳性结果。

[0005] 综上所述，目前用于分离和检测志贺氏菌的培养基的技术瓶颈在于：一方面，一种培养基很难同时检测志贺氏菌的四个种，造成漏检现象；另一方面，志贺氏菌与沙门氏菌等肠杆菌科细菌很难区分，造成假阳性结果。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于提供一种用于分离和检测志贺氏菌的显色培养基。

[0007] 本发明所采取的技术方案为：

[0008] 一种用于分离和检测志贺氏菌的显色培养基，每1000 mL培养基含有酵母粉2～10 g、胰蛋白胨2～7 g、大豆蛋白胨2～10 g、氯化钠4～7 g、乳糖3～15g、蔗糖3～15 g、2-脱氧-D-核糖3～15 g、琼脂粉12～20 g、β-葡萄糖苷酶显色底物0.05～0.5 g、β-吡喃岩藻糖苷酶显色底物0.05～0.5 g、β-半乳糖苷酶显色底物0.05～0.5 g、pH指示剂0.03～0.09 g、胆盐2～9 g、新生霉素钠1～5 mg、头孢磺啶1～10 mg、头孢克肟0.01～0.1 mg，余量为水。

[0009] 优选的，β-葡萄糖苷酶显色底物为5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷。

[0010] 优选的，β-吡喃岩藻糖苷酶显色底物为5-溴-4-氯-3-吲哚-β-吡喃岩藻糖苷。

[0011] 优选的，β-半乳糖苷酶显色底物为5-溴-4-氯-3-吲哚-N-乙酰-β-半乳糖苷。

[0012] 优选的，胆盐为去氧胆酸钠、猪胆盐、混合胆盐、牛胆盐和三号胆盐中的至少一种。

[0013] 优选的，胆盐为三号胆盐。

[0014] 优选的，pH指示剂为酚红。

[0015] 优选的，每1000 mL培养基中包含酵母粉4 g、胰蛋白胨3 g、大豆蛋白胨 6 g、氯化钠5 g、乳糖5 g、蔗糖5 g、2-脱氧-D-核糖5 g、琼脂粉15 g、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷0.4 g、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-吡喃岩藻糖苷0.2 g、5-溴-4-氯-3-吲哚-N-乙酰-β-半乳糖苷0.4 g、酚红0.08 g、三号胆盐6 g、新生霉素钠4 mg、头孢磺啶9 mg、头孢克肟0.03 mg，余量为水。

[0016] 本发明在培养基中添加了志贺氏菌不利用的碳水化合物以及指示剂酚红。志贺氏菌不利用的碳水化合物包括：山梨醇、侧金盏花醇、2-脱氧-D-核糖、肌醇、木糖、纤维二糖、乳糖、卫矛醇、蔗糖、棉子糖、水杨素，能利用这些碳水化合物中的一种或几种产酸的细菌，在pH指示剂作用下显示的颜色，能将该细菌与志贺氏菌区分开来，本发明在优选pH指示剂酚红作用下使发酵糖类产酸的细菌显示出黄色菌落，从而与志贺氏菌区分。本发明优选乳糖、蔗糖和2-脱氧-D-核糖。

[0017] 本发明在培养基中添加了β-葡萄糖苷酶、β-吡喃岩藻糖苷酶和β-半乳糖苷酶的显色底物，能表达产生这三种酶中的至少一种的细菌在酶的作用下分解底物，游离出发色基团，使菌落呈现出发色基团的色泽，从而与志贺氏菌相区分。

[0018] 本发明在培养基中添加了胆盐，可抑制样品中大部分的革兰氏阳性细菌。

[0019] 本发明的培养基还添加了抗生素。抗生素能抑制某些菌生长，如亚碲酸盐可用来延缓大肠埃希氏菌的生长，新生霉素钠和头孢克肟可以抑制变形杆菌的生长，头孢磺啶可以抑制假单胞菌属一类的细菌。本发明优选新生霉素钠、头孢磺啶和头孢克肟。

[0020] 细菌在本发明培养基中呈现的特征有：

[0021] 1）不利用乳糖、蔗糖和2-脱氧-D-核糖产酸并且不产β-葡萄糖苷酶、β-吡喃岩藻糖苷酶和β-半乳糖苷酶的微生物会形成第一种颜色菌落（白色），志贺氏菌呈现第一种颜色菌落；

[0022] 2）能利用乳糖、蔗糖和2-脱氧-D-核糖中的至少一种物质产酸的微生物，在pH指示剂酚红作用下形成第二种颜色菌落（黄色）；

[0023] 3）能产β-葡萄糖苷酶、β-吡喃岩藻糖苷酶和β-半乳糖苷酶中至少一种的微生物，形成第三种颜色菌落（绿色）；

[0024] 4）能利用乳糖、蔗糖和2-脱氧-D-核糖中的至少一种物质产酸且产β-葡萄糖苷酶、β-吡喃岩藻糖苷酶和β-半乳糖苷酶中至少一种的微生物，则形成第二种和第三种颜色的混合颜色，从而形成第四种颜色的菌落（蓝绿色或墨绿色）；以上四种颜色容易区分。

[0025] 本发明的显色培养基用于分离和检测志贺氏菌的方法，包括如下步骤：

[0026] 1)显色平板的制备：将上述显色培养基除新生霉素钠、头孢磺啶、头孢克肟、2-脱氧-D-核糖外的各组分，加入到去离子水中，搅拌，加热煮沸至完全溶解，调节pH至
6.8±0.2，待冷却至45～55℃，加入过滤除菌的新生霉素钠、头孢磺啶、头孢克肟、2-脱氧-D-核糖，混匀，倒平板，备用；

[0027] 2)样品处理：依据各领域规范规定的样本处理方法处理；

[0028] 3)接种培养：将样品或含样品的增菌液划线或涂布接种到显色平板上，37℃培养20～24 h；

[0029] 4)结果分析：若显色平板上培养基变红，出现清晰白色或无色半透明、直径为1～3 mm，没有色素沉着的菌落，则说明此菌落为可疑志贺氏菌菌落，可将该菌落挑出进一步做生化鉴定，其它细菌或被抑制或呈现黄色、绿色、蓝绿色、墨绿色。

[0030] 本发明的有益效果是：

[0031] 本发明的显色培养基可用于志贺氏菌属的四个种的分离和检测，具有特异性强、灵敏度高、易于操作、结果判断简单等优点，适合于各种样本的检测，有广泛的应用前景。显色培养基检测效果可达到进口R&F公司同类产品水平，优于国内已有的同类产品。

[0032] 本发明的显色培养基大大降低了假阳性和假阴性结果的出现，有很广泛的应用前景。本发明的显色培养基适用于包含大量其它肠杆菌科的样品中志贺氏菌的分离和检测，特别地，本发明的培养基能很好地区分沙门氏菌和志贺氏菌。

[0033] 本发明的显色培养基比以往的培养基菌落颜色更少，更容易可靠地检测志贺氏菌，志贺氏菌在本发明培养基中呈现白色，可清晰地与其它细菌呈现的鲜艳黄色或绿色等颜色区分。

具体实施方式

[0034] 下面结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限如此。

[0035] 实施例1

[0036] 一种用于检测和分离志贺氏菌的显色培养基，每1000 mL培养基含有酵母粉4 g、胰蛋白胨3 g、大豆蛋白胨 6 g、氯化钠5 g、乳糖5 g、蔗糖5 g、2-脱氧-D-核糖5 g、琼脂粉15 g、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷0.4 g、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-吡喃岩藻糖苷0.2 g、5-溴-4-氯-3-吲哚-N-乙酰-β-半乳糖苷0.4 g、酚红0.08 g、三号胆盐6 g、新生霉素钠4 mg、头孢磺啶9 mg、头孢克肟0.03 mg，余量为去离子水，pH为6.8±0.2。

[0037] 实施例2

[0038] 一种用于检测和分离志贺氏菌的显色培养基，每1000 mL培养基含有酵母粉6 g、胰蛋白胨3 g、大豆蛋白胨 7 g、氯化钠5 g、乳糖3 g、蔗糖8 g、2-脱氧-D-核糖7 g、琼脂粉18 g、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷0.2 g、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-吡喃岩藻糖苷0.1 g、5-溴-4-氯-3-吲哚-N-乙酰-β-半乳糖苷0.2 g、酚红0.06 g、三号胆盐5 g、新生霉素钠3 mg、头孢磺啶3 mg、头孢克肟0.05 mg，余量为去离子水，pH为6.8±0.2。

[0039] 实施例3

[0040] 一种用于检测和分离志贺氏菌的显色培养基，每1000 mL培养基含有酵母粉8 g、胰蛋白胨2 g、大豆蛋白胨 6 g、氯化钠5 g、乳糖5 g、蔗糖5 g、2-脱氧-D-核糖10 g、琼脂粉15 g、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷0.1 g、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-吡喃岩藻糖苷0.2 g、5-溴-4-氯-3-吲哚-N-乙酰-β-半乳糖苷0.4 g、酚红0.04 g、三号胆盐7 g、新生霉素钠2 mg、头孢磺啶8 mg、头孢克肟0.07 mg，余量为去离子水，pH为6.8±0.2。

[0041] 实施例4

[0042] 一种用于检测和分离志贺氏菌的显色培养基，每1000 mL培养基含有酵母粉7 g、胰蛋白胨6 g、大豆蛋白胨 3 g、氯化钠5 g、乳糖8 g、蔗糖3 g、2-脱氧-D-核糖12 g、琼脂粉15 g、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷0.2 g、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-吡喃岩藻糖苷0.4 g、5-溴-4-氯-3-吲哚-N-乙酰-β-半乳糖苷0.3 g、酚红0.08 g、三号胆盐5 g、新生霉素钠3 mg、头孢磺啶7 mg、头孢克肟0.015 mg，余量为去离子水，pH为6.8±0.2。

[0043] 实施例5

[0044] 一种用于检测和分离志贺氏菌的显色培养基，每1000 mL培养基含有酵母粉2 g、胰蛋白胨5 g、大豆蛋白胨 4 g、氯化钠4 g、乳糖3 g、蔗糖9 g、2-脱氧-D-核糖15 g、琼脂粉17 g、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷0.3 g、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-吡喃岩藻糖苷0.5 g、5-溴-4-氯-3-吲哚-N-乙酰-β-半乳糖苷0.05 g、酚红0.09 g、三号胆盐9 g、新生霉素钠1 mg、头孢磺啶6 mg、头孢克肟0.1 mg，余量为去离子水，pH为6.8±0.2。

[0045] 实施例6

[0046] 一种用于检测和分离志贺氏菌的显色培养基，每1000 mL培养基含有酵母粉5 g、胰蛋白胨4 g、大豆蛋白胨 10 g、氯化钠6 g、乳糖10 g、蔗糖15 g、2-脱氧-D-核糖8 g、琼脂粉12 g、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷0.5 g、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-吡喃岩藻糖苷0.05 g、5-溴-4-氯-3-吲哚-N-乙酰-β-半乳糖苷0.1 g、酚红0.03 g、三号胆盐4 g、新生霉素钠5 mg、头孢磺啶10 mg、头孢克肟0.01 mg，余量为去离子水，pH为6.8±0.2。

[0047] 实施例7

[0048] 一种用于检测和分离志贺氏菌的显色培养基，每1000 mL培养基含有酵母粉10 g、胰蛋白胨7 g、大豆蛋白胨 2 g、氯化钠7 g、乳糖15 g、蔗糖3 g、2-脱氧-D-核糖3 g、琼脂粉20 g、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷0.05 g、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-吡喃岩藻糖苷0.3 g、5-溴-4-氯-3-吲哚-N-乙酰-β-半乳糖苷0.5 g、酚红0.05 g、三号胆盐2 g、新生霉素钠3 mg、头孢磺啶1 mg、头孢克肟0.05 mg，余量为去离子水，pH为6.8±0.2。

[0049] 特异性实验

[0050] 将表1中所述22株标准菌株分别制成108～109 CFU/mL的菌悬液，分别取一环划线接种于实施案例1中所描述培养基制成的平板（简称HKM）上，37℃培养24 h，观察各菌的生长情况及菌落特征，结果见表2。注：表2中菌落生长情况用生长几区来表示，4区表示生长良好，菌落大小正常，1～3区表示生长受抑制，菌落偏小或生长少于4区。

[0051]

[0052]

[0053] 由表2可知，7株志贺氏菌在培养基上均形成白色、清晰的菌落，宋内氏志贺氏菌有清晰白色透明环，均显示阳性结果，除痢疾志贺氏菌CMCC (B) 51056菌落偏小外，其余6株志贺氏菌生长良好。非目标菌要么被抑制，要么形成与志贺氏菌不同颜色的菌落，可较好地与志贺氏菌区分。实验结果表明本发明的用于志贺氏菌分离和检测的显色培养基有较高的特异性。

[0054] 将表1所述22株标准菌株制备成107～108 CFU/mL的菌悬液，分别取一环划线接种于实施案例1中所描述培养基制成的平板（简称HKM）和对照平板上，37℃培养24 h，观察菌落的显色情况，实验结果见表3所示。

[0055] 对照培养基有：R&F公司的志贺氏菌显色培养基（简称R&F）、国内厂家的志贺氏菌显色培养基（简称国内厂家）、OXOID公司的木糖-赖氨酸-去氧胆酸盐琼脂（简称XLD）、OXOID公司的HE琼脂（简称HE）。志贺氏菌在上述对照培养基中特征分别为，R&F为培养基变成红色，形成清晰白色或无色半透明的菌落；国内厂家为培养基变成红色，菌落为白色或无色半透明；XLD为培养基变成红色，无色半透明菌落；HE为培养基成变成深绿色，菌落为绿色或淡绿色。

[0056]

[0057]

[0058] 由表3可知，志贺氏菌在上述5种培养基中均显示阳性结果。对于其它非志贺氏菌，在HKM和R&F平板上除普通变形杆菌与志贺氏菌不能很好地相区分外，其它菌均能与志贺氏菌较好的区分，而在国内厂家、XLD及HE平板上，不产硫化氢的沙门氏菌如甲型副伤寒沙门氏菌不能与志贺氏菌区分，另外铜绿假单胞菌也不能与志贺氏菌区分，假阳性率较高。表明本发明所述的志贺氏菌显色培养基与R&F平板在特异性及显色方面均无明显差异，均优于XLD、HE及国内厂家的同类产品。

[0059] 灵敏度实验

[0060] 将表1中所述7株志贺氏菌标准菌株分别制成102～103 CFU/mL菌悬液，取100 μL用螺旋接种法分别接种到实施案例1中所描述培养基、R&F公司志贺氏菌显色培养基、国内厂家志贺氏菌显色培养基、OXOID公司的木糖-赖氨酸-去氧胆酸盐琼脂、OXOID公司的HE琼脂等5种培养基制成的平板上，37℃培养24 h，通过菌落数计算菌悬液的浓度，结果见表4。

[0061]