一种适用于鲑鱼类全雌二倍体育种的方法，它涉及适用于鲑鱼类全雌二倍体育种的方法，本发明要解决现有不存在鲑鱼类全雌二倍体育种方法的问题。本发明中一种适用于鲑鱼类全雌二倍体育种的方法通过如下步骤来实现：一、人工方法分别采集鱼卵和精液；二、用生理盐水清洗鱼卵并用人工精浆稀释精液；三、鱼卵受精：四、孵化全雌二倍体；五、孵化得到稚鱼。采用本发明方法进行鲑鱼全雌二倍体育种，全雌率可达85%，本发明可应用于鲑鱼类全雌二倍体育种生产领域。
1.一种适用于鲑鱼类全雌二倍体育种的方法，其特征在于它是通过以下步骤实现的：
一、首先挑选体健成熟的鲑鱼类雌鱼和雄鱼用人工方法分别采集鱼卵和精液，将鱼卵和精液放置于不同的烧杯中；
二、用生理盐水洗涤鱼卵1次～2次后，将洗涤干净的鱼卵放入产卵盘中，加入浓度为1N的NaOH；按人工精浆与精液的体积比为（80～100）:1的比例向烧杯里的精液中加入人工精浆进行稀释后放入培养皿中；将稀释后的精液施加紫外线照射，照射强度为
3000ergs/mm ～4000ergs/mm，照射时间为50s～70s，其中，生理盐水的配制：将7.5g的NaCl、0.2g的KCl、0.2g的CaCl2·2H2O和0.02g的NaHCO3加入到1000ml蒸馏水制成生理盐水；人工精浆的配制：将7.6g的NaCl、2.98g的KCl、0.37g的CaCl2·2H2O、0.31g的MgCl2·6H2O和0.21g的NaHCO3加入到1000ml蒸馏水制成溶液，再向该溶液中加入浓度为
1N的NaOH溶液将该溶液的pH值调整为8.2～8.6，获得人工精浆；
三、按鱼卵与稀释后并施加紫外线照射的精液体积比为1:（20～30）的比例向产卵盘中加入稀释后并施加紫外线照射的精液进行混合后，立即按清水与稀释后并施加紫外线照射的精液的体积比为1:（3～5）的比例加入温度为9℃～11℃的清水，用羽毛搅匀之后静止2min～3min后，用清水反复冲洗受精卵4次～6次，洗掉残余的精液，放入盛有清水的烧杯内；
四、对经步骤三洗净后的受精卵在受精后5min～10min进行热休克诱导处理，将受精卵放入热休克诱导处理设备中，调节其内部温度为25℃～30℃，热休克诱导处理时间为18min～22min，然后将受精卵放入盛有清水的孵化桶中进行孵化，孵化温度为9.5℃～
10.5℃；对经步骤三洗净后的受精卵在受精后7.5h～8.5h用静水压力设备进行处理
5.5min～6.5min，静水压力为550KPa～650KPa，然后将受精卵放入盛有清水的孵化桶中进行孵化，孵化温度为9.5℃～10.5℃；
五、当孵化积温达到220度·日～230度·日，即达到发眼卵阶段从孵化桶内将孵化后的鱼卵取出，去除未受精和未发育的死鱼卵，再将发眼卵放入盛有清水的孵化桶中进行孵化，孵化温度为9.5℃～12.5℃，发眼卵发育至300度·日，稚鱼孵化出膜，即完成鲑鱼类全雌二倍体育种过程。
2.如权利要求1所述的一种适用于鲑鱼类全雌二倍体育种的方法，其特征在于步骤二中按人工精浆与精液的体积比为（85～95）:1的比例向烧杯里的精液中加入人工精浆进行
稀释；将稀释后的精液施加紫外线照射，照射强度为3200ergs/mm ～3800ergs/mm，照射时间为55s～65s。
3.如权利要求1所述的一种适用于鲑鱼类全雌二倍体育种的方法，其特征在于步骤二中按人工精浆与精液的体积比为90:1的比例向烧杯里的精液中加入人工精浆进行稀释；
将稀释后的精液施加紫外线照射，照射强度为3500ergs/mm，照射时间为60s。
4.如权利要求1、2或3所述的一种适用于鲑鱼类全雌二倍体育种的方法，其特征在于步骤二中再向该溶液中加入浓度为1N的NaOH溶液将该溶液的pH值调整为8.4。
5.如权利要求4所述的一种适用于鲑鱼类全雌二倍体育种的方法，其特征在于步骤三中按鱼卵与稀释后并施加紫外线照射的精液体积比为1:（22～28）的比例向产卵盘中加入稀释后并施加紫外线照射的精液进行混合后，立即按清水与稀释后并施加紫外线照射的精液的体积比为1:（3.5～4.5）的比例加入温度为9.5℃～10.5℃的清水。
6.如权利要求4所述的一种适用于鲑鱼类全雌二倍体育种的方法，其特征在于步骤三中按鱼卵与稀释后并施加紫外线照射的精液体积比为1:25的比例向产卵盘中加入稀释后并施加紫外线照射的精液进行混合后，立即按清水与稀释后并施加紫外线照射的精液的体积比为1:4的比例加入温度为10℃的清水。
7.如权利要求5所述的一种适用于鲑鱼类全雌二倍体育种的方法，其特征在于步骤四中对经步骤三洗净后的受精卵在受精后6min～9min进行热休克处理，将受精卵放入热休克诱导处理设备中，调节其内部温度为26℃～29℃，热休克处理时间为19min～21min，然后将受精卵放入盛有清水的孵化桶中进行孵化，孵化温度为9.8℃～10.2℃；对经步骤三洗净后的受精卵在受精后7.8h～8.2h用静水压力设备进行处理5.8min～6.2min，静水压力为580KPa～620KPa，然后将受精卵放入盛有清水的孵化桶中进行孵化，孵化温度为
8.如权利要求5所述的一种适用于鲑鱼类全雌二倍体育种的方法，其特征在于步骤四中对经步骤三洗净后的受精卵在受精后8min进行热休克处理，将受精卵放入热休克诱导处理设备中，调节其内部温度为28℃，热休克处理时间为20min，然后将受精卵放入盛有清水的孵化桶中进行孵化，孵化温度为10℃；对经步骤三洗净后的受精卵在受精后8h用静水压力设备进行处理6min，静水压力为600KPa，然后将受精卵放入盛有清水的孵化桶中进行孵化，孵化温度为10℃。
9.如权利要求7所述的一种适用于鲑鱼类全雌二倍体育种的方法，其特征在于步骤五中孵化积温达到222度·日～228度·日，孵化温度为10℃～12℃，发眼卵发育至305度·日～315度·日，稚鱼孵化出膜。
10.如权利要求7所述的一种适用于鲑鱼类全雌二倍体育种的方法，其特征在于步骤五中孵化积温达到225度·日，孵化温度为11℃，发眼卵发育至310度·日，稚鱼孵化出膜。
一种适用于鲑鱼类全雌二倍体育种的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及适用于鲑鱼类全雌二倍体育种的方法。
背景技术
[0002] 自从上个世纪末以来，国内曾有过关于鲤科鱼类（鲤、鲫等）和虹鳟的三倍体诱导试验报导，试验方法是静水压力法或温度（低温、高温）休克法诱导三倍体，但仅仅是试验室规模的小型试验，迄今尚无生产性试验及投入生产的报导。
[0003] 鲑鱼全雌二倍体的主要用途是制备性逆转雄鱼，因为全雌二倍体的制备是诱导性逆转雄鱼的前提条件，因此，必须解决全雌二倍体的制备方法。针对鲑鱼类进行的染色体操作仅有一家国内公司和日本一些相关科研单位实施过热休克法诱导虹鳟鱼三倍体的实验。目前，对于鲑鱼类全雌二倍体育种的方法国内尚无可与之相比较的技术实例。
发明内容
[0004] 本发明是要解决现有不存在鲑鱼类全雌二倍体育种方法的问题，而提出一种适用于鲑鱼类全雌二倍体育种的方法。
[0005] 本发明中的一种适用于鲑鱼类全雌二倍体育种的方法按以下步骤进行：
[0006] 一、首先挑选体健成熟的鲑鱼类雌鱼和雄鱼用人工方法分别采集鱼卵和精液，将鱼卵和精液放置于不同的烧杯中；
[0007] 二、用生理盐水洗涤鱼卵1次～2次后，将洗涤干净的鱼卵放入产卵盘中，加入浓度为1N的NaOH；按人工精浆与精液的体积比为（80～100）:1的比例向烧杯里的精液中加入人工精浆进行稀释后放入培养皿中；将稀释后的精液施加紫外线照射，照射强度为2 2
3000ergs/mm ～4000ergs/mm，照射时间为50s～70s，其中，生理盐水的配制：将7.5g的NaCl、0.2g的KCl、0.2g的CaCl2·2H2O和0.02g的NaHCO3加入到1000ml蒸馏水制成生理盐水；人工精浆的配制：将7.6g的NaCl、2.98g的KCl、0.37g的CaCl2·2H2O、0.31g的MgCl2·6H2O和0.21g的NaHCO3加入到1000ml蒸馏水制成溶液，再向该溶液中加入浓度为
1N的NaOH溶液将该溶液的pH值调整为8.2～8.6，获得人工精浆；
[0008] 三、按鱼卵与稀释后并施加紫外线照射的精液体积比为1:（20～30）的比例向产卵盘中加入稀释后并施加紫外线照射的精液进行混合后，立即按清水与稀释后并施加紫外线照射的精液的体积比为1:（3～5）的比例加入温度为9℃～11℃的清水，用羽毛搅匀之后静止2min～3min后，用清水反复冲洗受精卵4次～6次，洗掉残余的精液，放入盛有清水的烧杯内；
[0009] 四、对经步骤三洗净后的受精卵在受精后5min～10min进行热休克诱导处理，将受精卵放入热休克诱导处理设备中，调节其内部温度为25℃～30℃，热休克诱导处理时间为18min～22min，然后将受精卵放入盛有清水的孵化桶中进行孵化，孵化温度为9.5℃～10.5℃；对经步骤三洗净后的受精卵在受精后7.5h～8.5h用静水压力设备进行处理
5.5min～6.5min，静水压力为550KPa～650KPa，然后将受精卵放入盛有清水的孵化桶中进行孵化，孵化温度为9.5℃～10.5℃；
[0010] 五、当孵化积温达到220度·日～230度·日，即达到发眼卵阶段从孵化桶内将孵化后的鱼卵取出，去除未受精和未发育的死鱼卵，再将发眼卵放入盛有清水的孵化桶中进行孵化，孵化温度为9.5℃～12.5℃，发眼卵发育至300度·日，稚鱼孵化出膜，即完成鲑鱼类全雌二倍体育种过程。
[0011] 本发明全雌二倍体育种的工作原理：
[0012] 鲑鱼类的成熟卵细胞内，含有一个携带1倍数染色体(n)的卵核和1个携带1倍数染色体(n)的第二极体(第一极体此前已被排出)。当精细胞进入卵细胞时，在精细胞的刺激下，第二极体连同他的1倍数的染色体被排出卵外，携带1倍数染色体(n)的卵核与携带1倍数染色体(n)的精核相互融合，生成具有二倍数染色体的受精卵，该卵将发育成二倍体鱼。
[0013] 但当精细胞的遗传物质被紫外线照射后，精细胞所携带的1倍数染色体失去遗传能力（该套染色体无法与卵细胞内的染色体配对成二倍体），进入卵细胞后，在适当时机，采取适当的人工措施(本发明采取的是热休克处理法)，阻止第二极体的排出，就会生成由卵核、无效精核、第二极体三方融合成的含有二倍数染色体(1n、0n、1n)的受精卵，该卵将发育成全雌二倍体鱼。
[0014] 本发明的有益效果如下：
[0015] 1、紫外线照射鲑鱼精子，使其遗传物质失活。即保持精子的受精能力，但雄性遗传物质已经无法参与子代基因组的构建；
[0016] 2、热休克法阻止受精卵第二极体排出，使受精卵所含有的非同源的全套染色体（遗传物质）均来自于雌性配子（卵子），从而保持了后代的二倍性，且所有后代均为XX机制，即均为雌性；
[0017] 3、静水压力法阻止第一次卵裂，使受精卵所含有的同源的全套染色体（遗传物质）均来自于雌性配子（卵子），从而保持了后代的二倍性，且所有后代均为XX机制，即均为雌性；
[0018] 4、用热休克法诱导处理受精卵会得到异源全雌二倍体，用静水压力法处理受精卵会得到同源全雌二倍体。
具体实施方式
[0019] 本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
[0020] 具体实施方式一：本实施方式中的一种适用于鲑鱼类全雌二倍体育种的方法按以下步骤进行：
[0021] 一、首先挑选体健成熟的鲑鱼类雌鱼和雄鱼用人工方法分别采集鱼卵和精液，将鱼卵和精液放置于不同的烧杯中；
[0022] 二、用生理盐水洗涤鱼卵1次～2次后，将洗涤干净的鱼卵放入产卵盘中，加入浓度为1N的NaOH；按人工精浆与精液的体积比为（80～100）:1的比例向烧杯里的精液中加入人工精浆进行稀释后放入培养皿中；将稀释后的精液施加紫外线照射，照射强度为2 2
3000ergs/mm ～4000ergs/mm，照射时间为50s～70s，其中，生理盐水的配制：将7.5g的NaCl、0.2g的KCl、0.2g的CaCl2·2H2O和0.02g的NaHCO3加入到1000ml蒸馏水制成生理盐水；人工精浆的配制：将7.6g的NaCl、2.98g的KCl、0.37g的CaCl2·2H2O、0.31g的MgCl2·6H2O和0.21g的NaHCO3加入到1000ml蒸馏水制成溶液，再向该溶液中加入浓度为
1N的NaOH溶液将该溶液的pH值调整为8.2～8.6，获得人工精浆；
[0023] 三、按鱼卵与稀释后并施加紫外线照射的精液体积比为1:（20～30）的比例向产卵盘中加入稀释后并施加紫外线照射的精液进行混合后，立即按清水与稀释后并施加紫外线照射的精液的体积比为1:（3～5）的比例加入温度为9℃～11℃的清水，用羽毛搅匀之后静止2min～3min后，用清水反复冲洗受精卵4次～6次，洗掉残余的精液，放入盛有清水的烧杯内；
[0024] 四、对经步骤三洗净后的受精卵在受精后5min～10min进行热休克诱导处理，将受精卵放入热休克诱导处理设备中，调节其内部温度为25℃～30℃，热休克诱导处理时间为18min～22min，然后将受精卵放入盛有清水的孵化桶中进行孵化，孵化温度为9.5℃～10.5℃；对经步骤三洗净后的受精卵在受精后7.5h～8.5h用静水压力设备进行处理
5.5min～6.5min，静水压力为550KPa～650KPa，然后将受精卵放入盛有清水的孵化桶中进行孵化，孵化温度为9.5℃～10.5℃；
[0025] 五、当孵化积温达到220度·日～230度·日，即达到发眼卵阶段从孵化桶内将孵化后的鱼卵
[0026] 取出，去除未受精和未发育的死鱼卵，再将发眼卵放入盛有清水的孵化桶中进行孵化，孵化温度为9.5℃～12.5℃，发眼卵发育至300度·日～320度·日，稚鱼孵化出膜，即完成鲑鱼类全雌二倍体育种过程。
[0027] 本发明全雌二倍体育种的工作原理：
[0028] 鲑鱼类的成熟卵细胞内，含有一个携带1倍数染色体(n)的卵核和1个携带1倍数染色体(n)的第二极体(第一极体此前已被排出)。当精细胞进入卵细胞时，在精细胞的刺激下，第二极体连同他的1倍数的染色体被排出卵外，携带1倍数染色体(n)的卵核与携带1倍数染色体(n)的精核相互融合，生成具有二倍数染色体的受精卵，该卵将发育成二倍体鱼。
[0029] 但当精细胞的遗传物质被紫外线照射后，精细胞所携带的1倍数染色体失去遗传能力（该套染色体无法与卵细胞内的染色体配对成二倍体），进入卵细胞后，在适当时机，采取适当的人工措施(本发明采取的是热休克处理法)，阻止第二极体的排出，就会生成由卵核、无效精核、第二极体三方融合成的含有二倍数染色体(1n、0n、1n)的受精卵，该卵将发育成全雌二倍体鱼。
[0030] 本发明的有益效果如下：
[0031] 1、紫外线照射鲑鱼精子，使其遗传物质失活。即保持精子的受精能力，但雄性遗传物质已经无法参与子代基因组的构建；
[0032] 2、热休克法阻止受精卵第二极体排出，使受精卵所含有的非同源的全套染色体（遗传物质）均来自于雌性配子（卵子），从而保持了后代的二倍性，且所有后代均为XX机制，即均为雌性；
[0033] 3、静水压力法阻止第一次卵裂，使受精卵所含有的同源的全套染色体（遗传物质）均来自于雌性配子（卵子），从而保持了后代的二倍性，且所有后代均为XX机制，即均为雌性；
[0034] 4、用热休克法诱导处理受精卵会得到异源全雌二倍体，用静水压力法处理受精卵会得到同源全雌二倍体。
[0035] 具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤二中按人工精浆与精液的体积比为（85～95）:1的比例向烧杯里的精液中加入人工精浆进行稀释；将稀释2 2
后的精液施加紫外线照射，照射强度为3200ergs/mm ～3800ergs/mm，照射时间为55s～
65s。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
[0036] 具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤二中按人工精浆与精液的体积比为90:1的比例向烧杯里的精液中加入人工精浆进行稀释；将稀释后的精液2
施加紫外线照射，照射强度为3500ergs/mm，照射时间为60s。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
[0037] 具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是步骤二中再向该溶液中加入浓度为1N的NaOH溶液将该溶液的pH值调整为8.4。其它步骤及参数与具体实施方式一至三之一相同。
[0038] 具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是步骤三中按鱼卵与稀释后并施加紫外线照射的精液体积比为1:（22～28）的比例向产卵盘中加入稀释后并施加紫外线照射的精液进行混合后，立即按清水与稀释后并施加紫外线照射的精液的体积比为1:（3.5～4.5）的比例加入温度为9.5℃～10.5℃的清水。其它步骤及参数与具体实施方式一至四之一相同。
[0039] 具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是步骤三中按鱼卵与稀释后并施加紫外线照射的精液体积比为1:25的比例向产卵盘中加入稀释后并施加紫外线照射的精液进行混合后，立即按清水与稀释后并施加紫外线照射的精液的体积比为1:4的比例加入温度为10℃的清水。其它步骤及参数与具体实施方式一至四之一相同。
[0040] 具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是步骤四中对经步骤三洗净后的受精卵在受精后6min～9min进行热休克处理，将受精卵放入热休克诱导处理设备中，调节其内部温度为26℃～29℃，热休克处理时间为19min～21min，然后将受精卵放入盛有清水的孵化桶中进行孵化，孵化温度为9.8℃～10.2℃；对经步骤三洗净后的受精卵在受精后7.8h～8.2h用静水压力设备进行处理5.8min～6.2min，静水压力为580KPa～620KPa，然后将受精卵放入盛有清水的孵化桶中进行孵化，孵化温度为9.8℃～
10.2℃。其它步骤及参数与具体实施方式一至六之一相同。
[0041] 具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是步骤四中对经步骤三洗净后的受精卵在受精后8min进行热休克处理，将受精卵放入热休克诱导处理设备中，调节其内部温度为28℃，热休克处理时间为20min，然后将受精卵放入盛有清水的孵化桶中进行孵化，孵化温度为10℃；对经步骤三洗净后的受精卵在受精后8h用静水压力设备进行处理6min，静水压力为600KPa，然后将受精卵放入盛有清水的孵化桶中进行孵化，孵化温度为10℃。其它步骤及参数与具体实施方式一至六之一相同。
[0042] 具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一至八之一不同的是步骤五中孵化积温达到222度·日～228度·日，孵化温度为10℃～12℃，发眼卵发育至305度·日～315度·日，稚鱼孵
