一种肽生物材料的纯化方法

摘要

本发明涉及肽生物材料的纯化方法，包含以下步骤：肽生物材料采用三氟醋酸溶解，过滤得滤液；以氰基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，将肽生物材料的滤液用纯水稀释上样；采用三氟醋酸水溶液为A相，三氟醋酸的乙腈为B相，线性梯度洗脱；以甲基硅烷键合硅胶为固定相，将得到的纯化样品上样；TFA水溶液为A相，乙腈为B相，线性梯度洗脱；以甲基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，将得到的纯化样品上样；醋酸铵水溶液为A1相，色谱纯乙腈为B相，等梯度洗脱；然后再以醋酸水溶液为A2相，色谱纯乙腈为B相，等梯度洗脱，收集目的峰馏分；干燥得精肽。本发明的纯化方法简单，产品纯度高且收率好且易于产业化。

权利要求

1.一种肽生物材料的纯化方法，所述肽生物材料为RAD-16I或RAD-16II，该方法包括以下步骤：

1）肽生物材料RAD-16I或RAD-16II采用三氟醋酸溶解，过滤得滤液；

2）以氰基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，将步骤1）肽生物材料的滤液用纯水稀释上样；采用0.2%三氟醋酸水溶液为A相，以体积浓度为0.1%三氟醋酸的乙腈为B相，以B相梯度为1%-16%线性梯度洗脱，收集目的峰馏分；

3）以甲基硅烷键合硅胶为固定相，将步骤2）得到的纯化样品上样；体积浓度为0.1%—

0.2%TFA水溶液为A相，体积浓度为0.1%—0.2%TFA的乙腈为B相，以B相梯度为8%-23%线性梯度洗脱，收集目的峰馏分；

4）以甲基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，将步骤3）得到的纯化样品上样；以体积浓度为0.1%-0.2%，pH值5.0-7.0醋酸铵水溶液为A1相，色谱纯乙腈为B相，梯度为(1-10)%B+(99-90)%A1等梯度洗脱10-15min；然后再以0.1%-0.2%醋酸水溶液为A2相，色谱纯乙腈为B相，梯度为(1-10)%B+(99-90)%A2等梯度洗脱10-15分钟，以50%A2+50%B将样品洗脱下柱，收集目的峰馏分；干燥得精肽。

2.如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：所述的步骤2）中将步骤1）肽生物材料用纯三氟醋酸溶解，所得的滤液用纯水稀释上样，稀释的倍数为0.5-5倍。

说明书

一种肽生物材料的纯化方法

技术领域

[0001] 本发明涉及肽生物材料的纯化方法，尤其涉及富含R、A、D氨基酸的肽生物材料的纯化方法。

背景技术

[0002] 最近发现一类由自发自我组装的寡肽组成的生物材料。这些生物材料支架的成分是自我互补的两性寡肽组成，它们有规则的重复单位：带正电的氨基酸残基（赖氨酸或精氨酸）和带负电的氨基酸残基（天冬氨酸或谷氨酸）被疏水性残基（丙氨酸或亮氨酸）分开。自我互补的两性寡肽包含50%的带电残基，并且以交替的离子亲水性和不带电的疏水性氨基酸的周期重复为特征。典型的例子包括RAD16-I,其分子结构为Ac-RADARADARADARADA-NH2，RAD16-II,其分子结构为Ac-RARADADARARADADA-NH2。RAD16-I有4个(RADA)的空间模式，而RAD16-II只有2个(RARADADA)的空间模式。等浮力（在溶液中自由漂浮，既不下沉也不升至表面）的基质支架能被编织成有相对粘稠的各种各样的几何形式，要么像带子，要么像线条，要么成片状。肽和盐浓度，连同处理仪器的维数，决定宏观基质的几何结构和维数。圆性二色性分光镜显示基于RAD模型具有如前描述的典型周期性的肽链在水溶液中展示强的β片层二级结构。

[0003] RAD的两性多肽的结构与细胞黏附受体整合素配体RGD有相似性。细胞吸附在基于RAD基质上是整合素依赖模式，并且基于RAD的基质支持细胞吸附和生长。研究表明：RAD-16II是一种能协助正确的细胞分化的生物材料支架。

[0004] 该序列的肽因形成了较强的β片层结构，在水溶液中的溶解性很差，制备时在十八烷基硅烷基硅胶填料制备柱或者丁烷基硅烷硅胶填料制备柱上很难下柱，制备峰拖尾非常严重，纯化比较困难。收率很低，用较常用的十八烷基硅烷或者丁基硅烷基填料制备非常困难不易于产业化生产。

[0005] 本发明提出了一种可纯化固相合成得到的RAD-16I和RAD-16II的纯化方法，方法简单，产品纯度高且收率好且易于产业化。

发明内容

[0006] 提出了一种可纯化固相合成得到的RAD-16I和RAD-16II的纯化方法，方法简单，产品纯度高且收率好且易于产业化。

[0007] 为实现上述目的，本发明提供的技术方案包括以下步骤：

[0008] 1）肽生物材料RAD-16I或RAD-16II采用三氟醋酸溶解，过滤得滤液；所述的三氟醋酸优选纯三氟醋酸。

[0009] 2）以氰基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，将步骤1）肽生物材料的滤液用纯水稀释上样；三氟醋酸水溶液为A相，体积浓度为0.05%—0.4%三氟醋酸的乙腈为B相，线性梯度洗脱，收集目的峰馏分；

[0010] B相梯度：1%-30% B，流速范围5ml/min—500ml/min。稀释上样，稀释的倍数为0.5-1.5倍，优选1倍; A相所述三氟醋酸水溶液的体积浓度为0.1%-0.5%，优选为0.2%。

[0011] 由于肽生物材料RAD-16I或RAD-16II的疏水性强,一般的硅胶柱,比如十八烷基硅烷基硅胶填料的分离效果十分不理想,申请人意外地发现,氰基硅烷键合硅胶填料对于肽生物材料在分离时有理想的效果。

[0012] 确定B相的浓度是一个复杂的技术问题,当B项的体积浓度过低时,不能实现分析目的,当B项浓度过高时,酸性大,对填充料有加大的伤害.为了实现分离效果与填充柱正常使用之间平衡,需要对B项的浓度做出遴选.申请人意外地发现,当B项体积浓度介于0.05%—0.4%时,可以实现本发明的目的,同时也可以保持填充柱的稳定使用，优选体积浓度为0.2%。

[0013] 梯度：1%-30% B。实际操作中梯度变化太快会导致样品冲出。样品就会冲出来，没有分离效果。梯度变化的速率范围:1分钟三个梯度至5分钟一个梯度之间。

[0014] 色谱柱优选HPLC，HPLC指高效液相色谱仪。

[0015] 3）甲基硅烷键合硅胶为固定相，将步骤2）得到的纯化样品上样；体积浓度为0.1%—0.2%TFA水溶液为A 相，体积浓度为0.1%—0.2%TFA的乙腈为B相，线性梯度洗脱，收集目的峰馏分；

[0016] B相梯度：10%—40% ；TFA指三氟醋酸。

[0017] 肽生物材料RAD-16I或RAD-16II在十八烷基硅烷基硅胶填料难以分离，或者出峰拖尾，但在甲基硅烷基填料上却能够实现良好分离，出峰就不会拖尾。甲基硅烷基填料相比氰基硅烷基填料的分离度好，当肽生物材料RAD-16I或RAD-16II用氰基硅烷基填料分离后，纯度依然达不到要求，再次用甲基硅烷基填料分离一次，既能有较好的分离效果，也能很好地下柱，保证收率。

[0018] 色谱柱优选HPLC，HPLC指高效液相色谱仪。

[0019] 4）以甲基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，将步骤3）得到的纯化样品上样；以体积浓度为0.1%-0.2%，pH值5.0-7.0醋酸铵水溶液为A1 相，色谱纯乙腈为B相，梯度为（1-10）%B+(99-90)A1等梯度洗脱10-15min；然后再以0.1%-0.2%醋酸水溶液为A2相，色谱纯乙腈为B相，梯度为（1-10）%B+(99-90)A2等梯度洗脱10-15分钟，将样品以50%A2+50%B洗脱下柱，收集目的峰馏分；干燥得精肽。

[0020] 色谱柱优选HPLC，HPLC指高效液相色谱仪。

[0021] 以上的浓度以体积浓度计算。流动相的浓度和pH值太低，转盐时，三氟醋酸难以除净，浓度太高了浪费试剂。所以体积浓度为0.1%-0.2%醋酸铵水溶液为A1 相可以实现转盐效率和转盐成本的平衡。pH值太高了会损害制备柱，同时样品可能在制备柱中析出，而堵塞制备柱，醋酸铵水溶液pH值5.0-7.0为理想。

[0022] 其中“等度”是等梯度额含义。流速的参数为5ml/min-500ml/min。

[0023] 将脱盐纯化馏分进行减压旋蒸浓缩后，进行冷冻干燥即得活性样品。

[0024] 现有技术使用十八烷基硅胶填料，峰很不正常，严重拖尾，分离效果十分不理想，收率极低。而用氰基硅烷基填料和甲基硅烷基填料联合使用可以很好地解决上述问题。

[0025] 同时，肽生物材料RAD-16I或RAD-16II溶解性不好，常用的试剂,比如水，乙腈，甲醇，异丙醇，醋酸，氨水等,很难溶解。本发明采用三氟醋酸溶解，实现良好的溶解效果；溶解完后，上样时再加水稀释，产生了良好的分离纯化效果。

[0026] 本发明提供的纯化的方法操作简单可行、纯度达到98%以上、纯化总收率可达60%以上，达到产业化要求。

[0027] 纯化规模包括各种规格色谱柱，并且可以线性放大。色谱柱内径dc为R(R=50 mm或其他尺寸)，例如柱子内径：20mm、50 mm、100 mm 等。

[0028] 具体实施方式：

[0029] 实施例一：

[0030] 1. 样品处理：将1.0g固体RAD-16II粗肽用10ml纯TFA超声使样品完全溶解后，用滤膜过滤，收集滤液备用。

[0031] 2. 第一步HPLC纯化：

[0032] 纯化条件：色谱柱：以氰基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：20 mm × 250 mm 。流动相：A 相： 0.2%三氟乙酸液水溶液；B相：0.1%三氟醋酸的乙腈，流速：19ml/min，梯度：1% B—16% B,检测波长：230 nm。进样量为1.0g 。

[0033] 纯化过程：将色谱柱用50%以上的乙腈冲洗干净后用99% A相+1%B相平衡上样，上样量为1.0g，上样时样品滤液用纯水稀释一倍。线性梯度洗脱45min，收集目的峰，得到纯度大于80%以上馏分，将收集的目的峰馏分于水温不超过35℃的条件下减压旋蒸完乙腈后作第二步纯化样品。

[0034] 3. 第二步HPLC纯化：

[0035] 纯化条件：色谱柱：以甲基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：20 mm × 250 mm 。流动相：A 相： 0.1%三氟醋酸的水溶液为A 相， 0.1%三氟醋酸的乙腈为B相，梯度： 8% B—23% B，检测波长：230 nm。

[0036] 纯化过程：将色谱柱用50%以上的乙腈冲洗干净平衡后将第一步纯化馏分上样。线性梯度洗脱45min，收集目的峰，得到纯度大于95%以上馏分，将收集的目的峰馏分于水温不超过35℃的条件下旋完乙腈后作第三步脱盐纯化样品。

[0037] 4.第三步HPLC脱盐纯化：色谱柱：以甲基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为： 20 mm × 250 mm 。浓度0.2%，pH值为6.5醋酸铵的水溶液为A 1相，色谱纯乙腈为B相，梯度：95% A+5% B平衡10分钟，然后再以浓度0.1%，pH值为6.5HAc水溶液为A2相，色谱纯乙腈为B相，梯度：95%A2+5%B平衡10分钟，然后再用50%A2+50%B将肽洗脱下柱。检测波长：230 nm。

[0038] 收集目的峰，得到纯度大于95%以上馏分，将收集的目的峰馏分于水温不超过35℃的条件下减压旋蒸浓缩至约50 mg/ml 后进行冷冻干燥，即可得到纯度为95%的RAD-16II精肽710mg，纯化总收率为71%。

[0039] 实施例二：

[0040] 1. 样品处理：将1.0g固体RAD-16I粗肽用10ml纯TFA超声使样品完全溶解后，用滤膜过滤，收集滤液备用。

[0041] 2. 第一步HPLC纯化：

[0042] 纯化条件：色谱柱：以氰基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：20 mm × 250 mm 。流动相：A 相： 0.2%三氟乙酸液水溶液；B相：0.1%三氟醋酸的乙腈，流速：19ml/min，梯度：1% B—16% B,检测波长：230 nm。进样量为1.0g 。

[0043] 纯化过程：将色谱柱用50%以上的乙腈冲洗干净后用99%A相+1%B相平衡上样，上样量为1.0g，上样时样品滤液用纯水稀释一倍。线性梯度洗脱45min，收集目的峰，得到纯度大于80%以上馏分，将收集的目的峰馏分于水温不超过35℃的条件下减压旋蒸完乙腈后作第二步纯化样品。

[0044] 3. 第二步HPLC纯化：

[0045] 纯化条件：色谱柱：以甲基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：20 mm × 250 mm 。流动相：A 相： 0.1%三氟醋酸的水溶液为A 相， 0.1%三氟醋酸的乙腈为B相，梯度： 8% B—23% B，检测波长：230 nm。

[0046] 纯化过程：将色谱柱用50%以上的乙腈冲洗干净平衡后将第一步纯化馏分上样。线性梯度洗脱45min，收集目的峰，得到纯度大于95%以上馏分，将收集的目的峰馏分于水温不超过35℃的条件下旋完乙腈后作第三步脱盐纯化样品。

[0047] 4.第三步HPLC脱盐纯化：色谱柱：以甲基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为： 20 mm × 250 mm 。浓度0.2%，pH值为6.5醋酸铵的水溶液为A 1相，色谱纯乙腈为B相，梯度：95% A+5% B平衡10分钟，然后再以浓度0.1%，pH值为6.5HAc水溶液为A2相，色谱纯乙腈为B相，梯度：95%A2+5%B平衡10分钟，然后再用50%A2+50%B将肽洗脱下柱。检测波长：230 nm。

[0048] 收集目的峰，得到纯度大于95%以上馏分，将收集的目的峰馏分于水温不超过35℃的条件下减压旋蒸浓缩至约50 mg/ml 后进行冷冻干燥，即可得到纯度为95%的RAD-16I精肽720mg，纯化总收率为72%。

[0049] 实施例三：

[0050] 1. 样品处理：将1.5g固体RAD-16II粗肽用10ml纯TFA超声使样品完全溶解后，用滤膜过滤，收集滤液备用。

[0051] 2. 第一步HPLC纯化：

[0052] 纯化条件：色谱柱：以氰基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：20 mm × 250 mm 。流动相：A 相： 0.2%三氟乙酸液水溶液；B相：0.1%三氟醋酸的乙腈，流速：19ml/min，梯度：1% B—16% B,检测波长：230 nm。进样量为1.5g 。

[0053] 纯化过程：将色谱柱用50%以上的乙腈冲洗干净后用99%A相+1%B相平衡上样，上样量为1.5g，上样时样品滤液用纯水稀释一倍。线性梯度洗脱45min，收集目的峰，得到纯度大于80%以上馏分，将收集的目的峰馏分于水温不超过35℃的条件下减压旋蒸完乙腈后作第二步纯化样品。

[0054] 3. 第二步HPLC纯化：

[0055] 纯化条件：色谱柱：以甲基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：20 mm × 250 mm 。流动相：A 相： 0.1%三氟醋酸的水溶液为A 相， 0.1%三氟醋酸的乙腈为B相，梯度： 8% B—23% B，检测波长：230 nm。

[0056] 纯化过程：将色谱柱用50%以上的乙腈冲洗干净平衡后将第一步纯化馏分上样。线性梯度洗脱45min，收集目的峰，得到纯度大于95%以上馏分，将收集的目的峰馏分于水温不超过35℃的条件下旋完乙腈后作第三步脱盐纯化样品。

[0057] 4.第三步HPLC脱盐纯化：色谱柱：以甲基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为： 20 mm × 250 mm 。浓度0.2%，pH值为6.5醋酸铵的水溶液为A 1相，色谱纯乙腈为B相，梯度：95% A+5% B平衡10分钟，然后再以浓度0.1%，pH值为6.5HAc水溶液为A2相，色谱纯乙腈为B相，梯度：95%A2+5%B平衡10分钟，然后再用50%A2+50%B将肽洗脱下柱。检测波长：230 nm。

[0058] 收集目的峰，得到纯度大于95%以上馏分，将收集的目的峰馏分于水温不超过35℃的条件下减压旋蒸浓缩至约50 mg/ml 后进行冷冻干燥，即可得到纯度为95%的RAD-16II精肽923mg，纯化总收率为61.5%。

[0059] 实施例四：

[0060] 1. 样品处理：将4.5g固体RAD-16II粗肽用30ml纯TFA超声使样品完全溶解后，用滤膜过滤，收集滤液备用。

[0061] 2. 第一步HPLC纯化：

[0062] 纯化条件：色谱柱：以氰基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：50 mm × 250 mm 。流动相：A 相： 0.2%三氟乙酸液水溶液；B相：0.1%三氟醋酸的乙腈，流速：80ml/min，梯度：1% B—16% B,检测波长：230 nm。进样量为4.5g 。

[0063] 纯化过程：将色谱柱用50%以上的乙腈冲洗干净后用99%A相+1%B相平衡上样，上样量为4.5g，上样时样品滤液用纯水稀释一倍。线性梯度洗脱45min，收集目的峰，得到纯度大于80%以上馏分，将收集的目的峰馏分于水温不超过35℃的条件下减压旋蒸完乙腈后作第二步纯化样品。

[0064] 3. 第二步HPLC纯化：

[0065] 纯化条件：色谱柱：以甲基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：50 mm × 250 mm 。流动相：A 相： 0.1%三氟醋酸的水溶液为A 相， 0.1%三氟醋酸的乙腈为B相，梯度： 8% B—23% B，检测波长：230 nm。

[0066] 纯化过程：将色谱柱用50%以上的乙腈冲洗干净平衡后将第一步纯化馏分上样。线性梯度洗脱45min，收集目的峰，得到纯度大于95%以上馏分，将收集的目的峰馏分于水温不超过35℃的条件下旋完乙腈后作第三步脱盐纯化样品。

[0067] 4.第三步HPLC脱盐纯化：色谱柱：以甲基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为： 50 mm × 250 mm 。浓度0.2%，pH值为6.5醋酸铵的水溶液为A 1相，色谱纯乙腈为B相，梯度：95% A+5% B平衡10分钟，然后再以浓度0.1%，pH值为6.5HAc水溶液为A2相，色谱纯乙腈为B相，梯度：95%A2+5%B平衡10分钟，然后再用50%A2+50%B将肽洗脱下柱。检测波长：230 nm。

[0068] 收集目的峰，得到纯度大于95%以上馏分，将收集的目的峰馏分于水温不超过35℃的条件下减压旋蒸浓缩至约50 mg/ml 后进行冷冻干燥，即可得到纯度为95%的RAD-16II精肽2.9g，纯化总收率为64.4%。

[0069] 实施例五：

[0070] 1.样品处理：将5.1g固体RAD-16II粗肽用35ml纯TFA超声使样品完全溶解后，用滤膜过滤，收集滤液备用。

[0071] 2.第一步HPLC纯化：

[0072] 纯化条件：色谱柱：以氰基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：50 mm × 250 mm 。流动相：A 相： 0.2%三氟乙酸液水溶液；B相：0.1%三氟醋酸的乙腈，流速：80ml/min，梯度：1% B—16% B,检测波长：230 nm。进样量为4.5g 。

[0073] 纯化过程：将色谱柱用50%以上的乙腈冲洗干净后用99%A相+1%B相平衡上样，上样量为4.5g，上样时样品滤液用纯水稀释一倍。线性梯度洗脱45min，收集目的峰，得到纯度大于80%以上馏分，将收集的目的峰馏分于水温不超过35℃的条件下减压旋蒸完乙腈后作第二步纯化样品。

[0074] 3.第二步HPLC纯化：

[0075] 纯化条件：色谱柱：以甲基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：50 mm × 250 mm 。流动相：A 相： 0.1%三氟醋酸的水溶液为A 相， 0.1%三氟醋酸的乙腈为B相，梯度： 8% B—23% B，检测波长：230 nm。

[0076] 纯化过程：将色谱柱用50%以上的乙腈冲洗干净平衡后将第一步纯化馏分上样。线性梯度洗脱45min，收集目的峰，得到纯度大于95%以上馏分，将收集的目的峰馏分于水温不超过35℃的条件下旋完乙腈后作第三步脱盐纯化样品。

[0077] 4.第三步HPLC脱盐纯化：色谱柱：以甲基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为： 50 mm × 250 mm 。浓度0.2%，pH值为6.5醋酸铵的水溶液为A 1相，色谱纯乙腈为B相，梯度：95% A+5% B平衡10分钟，然后再以浓度0.1%，pH值为6.5HAc水溶液为A2相，色谱纯乙腈为B相，梯度：95%A2+5%B平衡10分钟，然后再用50%A2+50%B将肽洗脱下柱。检测波长：230 nm。

[0078] 收集目的峰，得到纯度大于95%以上馏分，将收集的目的峰馏分于水温不超过35℃的条件下减压旋蒸浓缩至约50 mg/ml 后进行冷冻干燥，即可得到纯度为95%的RAD-16II精肽2.9g，纯化总收率为64.4%。

[0079] 实施例六：

[0080] 1.样品处理：将5.0g固体RAD-16I粗肽用35ml纯TFA超声使样品完全溶解后，用滤膜过滤，收集滤液备用。

[0081] 2.第一步HPLC纯化：

[0082] 纯化条件：色谱柱：以氰基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：50 mm × 250 mm 。流动相：A 相： 0.2%三氟乙酸液水溶液；B相：0.1%三氟醋酸的乙腈，流速：80ml/min，梯度：1% B—16% B,检测波长：230 nm。进样量为4.5g 。

[0083] 纯化过程：将色谱柱用50%以上的乙腈冲洗干净后用99%A相+1%B相平衡上样，上样量为5.0g，上样时样品滤液用纯水稀释一倍。线性梯度洗脱45min，收集目的峰，得到纯度大于80%以上馏分，将收集的目的峰馏分于水温不超过35℃的条件下减压旋蒸完乙腈后作第二步纯化样品。

[0084] 3.第二步HPLC纯化：

[0085] 纯化条件：色谱柱：以甲基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：50 mm × 250 mm 。流动相：A 相： 0.1%三氟醋酸的水溶液为A 相， 0.1%三氟醋酸的乙腈为B相，梯度： 8% B—23% B，检测波长：230 nm。

[0086] 纯化过程：将色谱柱用50%以上的乙腈冲洗干净平衡后将第一步纯化馏分上样。线性梯度洗脱45min，收集目的峰，得到纯度大于95%以上馏分，将收集的目的峰馏分于水温不超过35℃的条件下旋完乙腈后作第三步脱盐纯化样品。

[0087] 4.第三步HPLC脱盐纯化：色谱柱：以甲基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为： 50 mm × 250 mm 。浓度0.2%，pH值为6.5醋酸铵的水溶液为A 1相，色谱纯乙腈为B相，梯度：95% A+5% B平衡10分钟，然后再以浓度0.1%，pH值为6.5HAc水溶液为A2相，色谱纯乙腈为B相，梯度：95%A2+5%B平衡10分钟，然后再用50%A2+50%B将肽洗脱下柱。检测波长：230 nm。

[0088] 收集目的峰，得到纯度大于95%以上馏分，将收集的目的峰馏分于水温不超过35℃的条件下减压旋蒸浓缩至约50 mg/ml 后进行冷冻干燥，即可得到纯度为95%的RAD-16I精肽3.1g，纯化总收率为62%。

[0089] 实施例七：

[0090] 1.样品处理：将10.0g固体RAD-16I粗肽用50ml纯TFA超声使样品完全溶解后，用滤膜过滤，收集滤液备用。

[0091] 2.第一步HPLC纯化：

[0092] 纯化条件：色谱柱：以氰基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：100 mm × 250 mm 。流动相：A 相： 0.2%三氟乙酸液水溶液；B相：0.1%三氟醋酸的乙腈，流速：220ml/min，梯度：1% B—16% B,检测波长：230 nm。进样量为10.0g 。

[0093] 纯化过程：将色谱柱用50%以上的乙腈冲洗干净后用99%A相+1%B相平衡上样，上样量为10.0g，上样时样品滤液用纯水稀释一倍。线性梯度洗脱45min，收集目的峰，得到纯度大于80%以上馏分，将收集的目的峰馏分于水温不超过35℃的条件下减压旋蒸完乙腈后作第二步纯化样品。

[0094] 3.第二步HPLC纯化：

[0095] 纯化条件：色谱柱：以甲基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：100 mm × 250 mm 。流动相：A 相： 0.1%三氟醋酸的水溶液为A 相， 0.1%三氟醋酸的乙腈为B相，梯度： 8% B—23% B，检测波长：230 nm。

[0096] 纯化过程：将色谱柱用50%以上的乙腈冲洗干净平衡后将第一步纯化馏分上样。线性梯度洗脱45min，收集目的峰，得到纯度大于95%以上馏分，将收集的目的峰馏分于水温不超过35℃的条件下旋完乙腈后作第三步脱盐纯化样品。

[0097] 4.第三步HPLC脱盐纯化：色谱柱：以甲基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为： 100 mm × 250 mm 。浓度0.2%，pH值为6.5醋酸铵的水溶液为A 1相，色谱纯乙腈为B相，梯度：95% A+5% B平衡10分钟，然后再以浓度0.1%，pH值为6.5HAc水溶液为A2相，色谱纯乙腈为B相，梯度：95%A2+5%B平衡10分钟，然后再用50%A2+50%B将肽洗脱下柱。检测波长：230 nm。

[0098] 收集目的峰，得到纯度大于95%以上馏分，将收集的目的峰馏分于水温不超过35℃的条件下减压旋蒸浓缩至约50 mg/ml 后进行冷冻干燥，即可得到纯度为95%的RAD-16I精肽6.3g，纯化总收率为63%。

[0099] 实施例八：

[0100] 1.样品处理：将11.0g固体RAD-16II粗肽用55ml纯TFA超声使样品完全溶解后，用滤膜过滤，收集滤液备用。

[0101] 2.第一步HPLC纯化：

[0102] 纯化条件：色谱柱：以氰基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：100 mm × 250 mm 。流动相：A 相： 0.2%三氟乙酸液水溶液；B相：0.1%三氟醋酸的乙腈，流速：80ml/min，梯度：1% B—16% B,检测波长：230 nm。进样量为11.0g 。

[0103] 纯化过程：将色谱柱用50%以上的乙腈冲洗干净后用99%A相+1%B相平衡上样，上