抗暗纹东方鲀源致病性维氏气单胞菌卵黄抗体的制备方法转让专利
申请号 : CN201210181107.1
文献号 : CN102718866B
文献日 : 2013-10-23
发明人 : 曹军 , 常燕 , 金大勇 , 王兆慧 , 刘思园 , 徐磊
申请人 : 南通大学
摘要 :
本发明公开了一种抗暗纹东方鲀源致病性维氏气单胞菌卵黄抗体的制备方法，包括制备菌苗、免疫程序、卵黄液的预处理、卵黄粉的制备等步骤。本发明易操作，效果好，对免疫后每间隔7d收集的鸡蛋进行效价测定，第四次免疫后ELISA测定的效价可达1∶12560，进一步制成的卵黄抗体粉效价不变。
权利要求 :
1.一种抗暗纹东方鲀源致病性维氏气单胞菌卵黄抗体的制备方法，其特征是：包括下列步骤：（1）将保藏编号为CCTCC No：M2012154的暗纹东方鲀源致病性维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）SY-R2划线接种大豆酪蛋白琼脂培养基平板，37℃培养24h，挑取单菌落涂布于直径15cm的TSA平板，于37℃培养20h；用无菌PBS洗下菌苔，测定并调整菌液浓
10
度为2.5×10 CFU/mL；纯检合格后按0.5%福尔马林液37℃灭活24h，无菌检验合格后供制备抗原；每5重量份灭活菌液加入灭菌的氢氧化铝胶1重量份，加入相当于灭活菌液和氢氧化铝胶总重量0.01%的硫柳汞防腐，得到菌苗；
（2）免疫程序：28周龄罗曼蛋鸡进行翅静脉采血作为对照血清，开产后收集鸡蛋作为实验对照；开产后第3天，用步骤（1）制备的菌苗胸肌多点注射免疫，剂量0.5mL/只；首次免疫后1周进行第二次免疫，免疫剂量1.0mL/只；第二次免疫后每隔20d加强免疫，连续免疫2次，免疫剂量均为1.0mL/只；第四次免疫后40d，再进行免疫，免疫剂量为2.0mL/只；
从首次免疫开始，每次免疫后7天翅静脉采血分离血清，并收集所有鸡蛋，对免疫后每间隔
7d收集的鸡蛋进行效价测定；用微量凝集法初步测定免疫鸡血清和卵黄中抗体的有无；
（3）卵黄液的预处理：收集第四次免疫后鸡蛋，用清水刷拭干净后浸于0.5%新洁尔灭中消毒、凉干，于无菌条件下分离出卵黄，加入1.5倍体积的生理盐水，高速匀浆制备乳浊液；高速匀浆转速为9500r/min，时间为10-20min；
（4）卵黄粉的制备：将经步骤（3）预处理的卵黄液进行喷雾干燥，制得卵黄粉，其中IgY即抗暗纹东方鲀源致病性维氏气单胞菌卵黄抗体。
说明书 :
抗暗纹东方鲀源致病性维氏气单胞菌卵黄抗体的制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种抗暗纹东方鲀源致病性维氏气单胞菌卵黄抗体的制备技术，用于维氏气单胞菌引起的鱼类疾病防治。属于生物制品制备技术领域。
背景技术
[0002] 维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）又称凡隆气单胞菌、维罗纳气单胞菌，1983年，美国疾病预防与控制中心为纪念法国微生物学家Veron在弧菌和气单胞菌研究中的贡献而命名。该菌普遍存在于淡水、污水，土壤乃至海水中，其中一部分菌株是微生态环境中正常存在的，而另一些菌株具有致病性，主要感染变温动物，如中华绒螯蟹、泥鳅、锦鲤，斑点叉尾鲴等，可引起大量死亡；维氏气单胞菌对恒温动物是一种机会致病菌，但有人认为免疫功能健全者也可被感染 ，通常患者发生急性腹泻，也可能引起菌血症、脑膜炎和心内膜炎等。近年来，日益增多的病例表明维氏气单胞菌已成为一种重要的人一鱼共患致病菌，并在食品安全上表现出重要意义，部分国家已经将其规定为食品安全的检疫对象。抗菌药物的使用是动物生产和疫病防治的重要措施，但抗菌药的不科学使用，致使药物残留、环境污染和细菌耐药已经成为一个世界关注的兽医公共卫生问题。因此，寻求一种安全、高效的抗菌药替代品成为一个急待解决的问题。特异性卵黄抗体可治疗由细菌或病毒感染引起的疾病，具有安全、无残留、不产生耐药性、廉价、易得等优点，是一种具有广泛应用前景的抗生素替代品。
[0003] 目前，卵黄抗体研制技术正成为国内外医药领域的新热点。卵黄中的卵黄抗体浓度能长期维持在相当于甚至超过血液抗体浓度的水平（Larsson 等，1993）,(Hatta 等，1993)，一羽高产蛋禽产蛋期每月大约可产1500 mg卵黄抗体（Schade 等，1994）。卵黄抗体的化学本质是蛋白质，发挥作用后即可被机体作为营养物质分解利用，纯品不会残留任何有害物质；而且稳定性较好，能耐酸、耐碱、耐热、耐酶解( Shimizu 等，1992)，可制成方便保存和运输的卵黄抗体粉，是一种理想的绿色生物制品。目前IgY技术在国内研究与应用的大体情况是：在兽医学和功能食品开发上比较受重视，甚至较许多西方国家更加重视产品开发和商品化。但IgY技术应用的基础研究工作还比较薄弱，其剂型研究几乎无人涉及，这也成为IgY普遍应用的“瓶颈”。
[0004] IgY在疾病防冶中的研究是被动免疫领域的热点和十分活跃的课题。在细菌性肠道疾病防治方面，目前认为IgY有三大作用机理：一是抗特定病原菌的IgY能直接粘附于病原菌的细胞壁上，改变病原菌细胞的完整性，直接抑制病原菌的生长；二是IgY可粘附于细菌菌毛上，使病原菌不能粘附于肠道黏膜；三是部分IgY在肠道消化酶作用下，降解为小肽（含有抗体未端高度可变的小肽：Fab部分），这些小肽仍能与抗原结合，具有中和病原能力。在非胃肠道疾病防治方面，IgY进入胃肠道后，在消化酶的作用下，IgY部分降解为小肽，极易被肠道吸收，进入血液后能与特定病原菌的粘附因子结合，使病原菌不能粘附易感细胞而失去致病性，可对非肠道病原菌发挥抑菌作用。抗胆囊收缩素IgY能在SD大鼠十二指肠段以完整分子形式吸收或部分吸收进入血液，发挥其免疫学和生物学效应，但抗CCK卵黄抗体的吸收机制未得到进一步的实验论证。
[0005] 卵黄抗体在鱼类细菌性疾病防冶方面的应用已有一些报道， Arastech等用卵黄抗体对虹鳟进行被动免疫预防试验，发现虹鳟服用卵黄抗体15天后对鳗弧菌产生了明显的免疫力。Gutierrez等用卵黄抗体对日本鳗鱼进行口服免疫，发现免疫后其肠道中迟缓爱德华菌的数量显著减少，因而抑制该病原从受伤的肠壁入侵肝脏和肾脏，降低了该病的死亡率。王斌等在采用口服法对大菱鲆进行免疫保护试验发现，无论是用肌肉注射还是用划伤浸泡的方法进行人工感染，都不会使鱼发病，保护效果较好；卵黄抗体对划伤浸泡感染的保护效果要好于注射感染组。但其中原因也未得到进一步的实验论证。李肖梁等用特异性卵黄抗体添加剂对中华鳖的免疫保护实验表明：特异性IgY抗体的饲料添加剂对相应病原具有较好的预防作用，肾脏中细菌总数明显减少，但IgY在中华鳖机体内的作用机理和代谢未做更明确的实验论证。
[0006] 暗纹东方鲀（Takifugu fasciatus）是具有极高经济价值的特种水产养殖对象，随着暗纹东方鲀人工繁殖、营养及无毒人工养殖等综合养殖技术的不断完善，暗纹东方鲀高密度、集约化养殖规模的不断扩大，病害已成为制约该行业发展的主要因素之一。维氏气单胞菌引起的暗纹东方鲀疾病在生产实践中已有出现，造成一定的经济损失。
发明内容
[0007] 本发明的目的在于提供一种易操作，效果好的抗暗纹东方鲀源致病性维氏气单胞菌卵黄抗体的制备方法。
[0008] 本发明的技术解决方案是：
[0009] 一种抗暗纹东方鲀源致病性维氏气单胞菌卵黄抗体的制备方法，其特征是：包括下列步骤：
[0010] （1）将保藏编号为CCTCC No：M2012154的暗纹东方鲀源致病性维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）SY-R2（保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：中国武汉大学，保藏日期：2012年5月3日，分类命名：Aeromonas veronii SY-R2）划线接种大豆酪蛋白琼脂培养基平板，37℃培养24 h，挑取单菌落涂布于直径15 cm的TSA平板，于37 ℃10
培养20 h；用无菌PBS洗下菌苔，测定并调整菌液浓度为2.5 ×10 CFU/ mL ；纯检合格后按0.5%（V/V）福尔马林液37 ℃灭活24 h，无菌检验合格后供制备抗原；每5重量份灭活菌液加入灭菌的氢氧化铝胶1重量份，加入相当于灭活菌液和氢氧化铝胶总重量0.01%的硫柳汞防腐，得到菌苗；
培养20 h；用无菌PBS洗下菌苔，测定并调整菌液浓度为2.5 ×10 CFU/ mL ；纯检合格后按0.5%（V/V）福尔马林液37 ℃灭活24 h，无菌检验合格后供制备抗原；每5重量份灭活菌液加入灭菌的氢氧化铝胶1重量份，加入相当于灭活菌液和氢氧化铝胶总重量0.01%的硫柳汞防腐，得到菌苗；
[0011] （2）免疫程序：28周龄罗曼蛋鸡进行翅静脉采血作为对照血清，开产后收集鸡蛋作为实验对照；开产后第3天，用步骤（1）制备的菌苗胸肌多点注射免疫，剂量0.5mL/只；首次免疫后1周进行第二次免疫，免疫剂量 1.0mL/只；第二次免疫后每隔20d加强免疫，连续免疫2次，免疫剂量均为1.0mL/只；第四次免疫后40d，再进行免疫，免疫剂量为2.0mL/只；从首次免疫开始，每次免疫后7天翅静脉采血分离血清，并收集所有鸡蛋，对免疫后每间隔7d 收集的鸡蛋进行效价测定；用微量凝集法初步测定免疫鸡血清和卵黄中抗体的有无；
[0012] （3）卵黄液的预处理：收集第四次免疫后鸡蛋，用清水刷拭干净后浸于0.5%新洁尔灭中消毒、凉干，于无菌条件下分离出卵黄，加入1.5倍体积的生理盐水，高速匀浆制备乳浊液；
[0013] （4）卵黄粉的制备：将经步骤（3）预处理的卵黄液进行喷雾干燥，制得卵黄粉，其中IgY即抗暗纹东方鲀源致病性维氏气单胞菌卵黄抗体。
[0014] 步骤（2）对免疫后每间隔7d 收集的鸡蛋，无菌条件下分离出卵黄，80 g/L聚乙二醇-8 000（PEG-8 000）一步法提纯卵黄抗体，ELISA测定抗体效价，第四次免疫后ELISA测定的卵黄抗体效价为1：12560。
[0015] 步骤（4）中喷雾干燥的进风温度为120℃-140℃，出风温度为68℃-72℃。
[0016] 步骤（3）中高速匀浆转速为9500r/min，时间为10-20 min。
[0017] 保藏编号为CCTCC No：M2012154的暗纹东方鲀源致病性维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）SY-R2通过下列步骤的选育方法得到：取具有典型症状、死亡后一小时内的暗纹东方鲀的心脏、肝脏病灶进行细菌分离培养，所用培养基为大豆酪蛋白琼脂培养基平板，30℃培养24h，选取优势菌在TSA平板上进行纯培养直至菌落纯，获得致病菌株；所述典型症状为：腹部膨大，肛门红肿，体表及胸鳍、腹鳍和臀鳍残缺、基部充血、出血、解剖时有大量淡黄色带血的水样腹水；肝脏肿大，呈土黄色，有大小不一的出血斑块；胆囊膨大；肠道无食，充满泡沫状粘液，肠粘膜出血。
[0018] 本发明易操作，效果好，第四次免疫后ELISA测定的卵黄抗体效价为1：12560。，进一步制成的卵黄抗体粉效价不变。与其他技术相比本发明的独特之处还在于：首先，抗原来自于暗纹东方鲀，维氏气单胞菌引起的暗纹东方鲀疾病在国内外从未见过报道，是暗纹东方鲀一种全新的疾病。第二，以维氏气单胞菌为抗原制备的卵黄抗体在国内外同样未见过报道。第三，该发明中所述的卵黄抗体液的预处理使卵黄抗体形成乳浊液，这在卵黄抗体粉的制备过程中未见过报道。
[0019] 下面结合实施例对本发明作进一步说明。
[0020] 暗纹东方鲀源致病性维氏气单胞菌，保藏编号为CCTCC No：M2012154；分类命名：灵芝，拉丁文学名：Aeromonas veronii SY-R2，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：中国武汉大学，保藏日期：2012年5月3日。
具体实施方式
[0021] 一种抗暗纹东方鲀源致病性维氏气单胞菌卵黄抗体的制备方法，包括下列步骤：
[0022] （1）将保藏编号为CCTCC No：M2012154的暗纹东方鲀源致病性维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）SY-R2划线接种大豆酪蛋白琼脂培养基（Tryptose Soya Agar,TSA）平板，37℃培养24 h，挑取单菌落涂布于直径15 cm的TSA平板，于37 ℃培养20 h；用无菌10
PBS（0.01M，pH 7.2）洗下菌苔，测定并调整菌液浓度为2.5 ×10 CFU/ mL ；纯检合格后按0.5%（V/V）福尔马林液37 ℃灭活24 h，无菌检验合格后供制备抗原；每5重量份灭活菌液加入灭菌的氢氧化铝胶1重量份，加入相当于灭活菌液和氢氧化铝胶总重量0.01%的硫柳汞防腐，得到菌苗；
PBS（0.01M，pH 7.2）洗下菌苔，测定并调整菌液浓度为2.5 ×10 CFU/ mL ；纯检合格后按0.5%（V/V）福尔马林液37 ℃灭活24 h，无菌检验合格后供制备抗原；每5重量份灭活菌液加入灭菌的氢氧化铝胶1重量份，加入相当于灭活菌液和氢氧化铝胶总重量0.01%的硫柳汞防腐，得到菌苗；
[0023] （2）免疫程序：28周龄罗曼蛋鸡进行翅静脉采血作为对照血清，开产后收集鸡蛋作为实验对照；开产后第3天，用步骤（1）制备的菌苗胸肌多点注射免疫，剂量0.5mL/只；首次免疫后1周进行第二次免疫，免疫剂量 1.0mL/只；第二次免疫后每隔20d加强免疫，连续免疫2次，免疫剂量均为1.0mL/只；第四次免疫后40d，再进行免疫，免疫剂量为