结核菌核糖体蛋白L12和L10相互作用阻断剂筛选模型及应用

摘要

本发明属于生物学和药学领域，涉及结核菌核糖体蛋白L12和L10相互作用阻断剂筛选模型及应用。具体地，本发明涉及一种细胞，其表达结核杆菌的L12蛋白和L10蛋白，其中，L12的编码基因与转录因子的转录激活结构域位于一个表达载体，L10的编码基因与转录因子的DNA结合结构域位于另一个表达载体。本发明还涉及式I或式II所示的化合物在制备结核杆菌L12蛋白和L10蛋白相互作用阻断剂、抗结核杆菌药物、或者治疗和/或预防结核病的药物中的用途。本发明的细胞模型能够有效地用于抗结核杆菌药物的筛选。

权利要求

1.如下的细胞或者细胞模型在筛选结核杆菌L12蛋白和L10蛋白相互作用阻断剂、抗结核杆菌药物或者治疗和/或预防结核病的药物中的用途，其中，所述阻断剂或抗结核杆菌药物或治疗和/或预防结核病的药物均为如下的式I化合物：所述的细胞为AH109酵母细胞，其含有表达结核杆菌核糖体蛋白L12和L10的表达载体，其中，L12的编码基因与转录因子GAL4的转录激活结构域位于pGADT7表达载体，L10的编码基因与转录因子GAL4的转录结合结构域位于pGBKT7表达载体；

所述的细胞模型包含上述细胞。

2.根据权利要求1所述的用途，其满足如下的(1)－(2)中的一项或者多项：(1)所述转录因子为GAL4；

(2)L12蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，L10蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.根据权利要求1所述的用途，其中，L12蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：

3所示，L10蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

4.根据权利要求1所述的用途，其中，所述细胞能够在缺陷性培养基SD/-Trp-Leu-His-Ade上生长。

5.根据权利要求1所述的用途，其中，所述细胞模型还包含空白对照细胞和/或阴性对照细胞。

6.根据权利要求5所述的用途，其中，所述空白对照细胞为不转染有任何载体的空白AH109酵母细胞，所述阴性对照细胞为转染有两个不同的表达载体的AH109酵母细胞，两个表达载体中各插入有不同的基因，该两个不同的基因表达的蛋白能够相互结合，并且表达的蛋白不是L12和L10。

7.一种筛选结核杆菌L12蛋白和L10蛋白相互作用阻断剂、抗结核杆菌药物或者治疗和/或预防结核病的药物的方法，包括下述步骤：

1)将如下的细胞或者细胞模型接种并进行培养；

2)分别向步骤1)中培养的细胞中加入待测化合物或组合物，使化合物或组合物的终浓度为10μg/ml，继续进行培养12－36小时；

3)观察细胞的生长情况，找出对模型细胞具有抑制作用的化合物或组合物，得到初筛阳性的化合物或组合物；

4)将初筛阳性的化合物或组合物进行β-半乳糖苷酶活性抑制检测；

其中，所述阻断剂或抗结核杆菌药物或治疗和/或预防结核病的药物均为如下的式I化合物：所述的细胞为AH109酵母细胞，其含有表达结核杆菌核糖体蛋白 L12和L10的表达载体，其中，L12的编码基因与转录因子GAL4的转录激活结构域位于pGADT7表达载体，L10的编码基因与转录因子GAL4的转录结合结构域位于pGBKT7表达载体；

所述的细胞模型包含上述细胞。

8.根据权利要求7所述的方法，其满足如下的(1)－(2)中的一项或者多项：(1)所述转录因子为GAL4；

(2)L12蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，L10蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

9.根据权利要求7所述的方法，其中，L12蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：

3所示，L10蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

10.根据权利要求7所述的方法，其中，所述细胞能够在缺陷性培养基SD/-Trp-Leu-His-Ade上生长。

11.根据权利要求7所述的方法，其中，所述细胞模型还包含空白对照细胞和/或阴性对照细胞。

12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述空白对照细胞为不转染有任何载体的空白AH109酵母细胞，所述阴性对照细胞为转染有两个不同的表达载体的AH109酵母细胞，两个表达载体中各插入有不同的基因，该两个不同的基因表达的蛋白能够相互结合，并且表达的蛋白不是L12和L10。

说明书

结核菌核糖体蛋白L12和L10相互作用阻断剂筛选模型及

应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物学和药学领域，涉及结核菌核糖体蛋白L12和L10相互作用阻断剂筛选模型及应用。

[0002] 背景技术

[0003] 近年来结核病在全球范围内卷土重来，结核菌的耐药成为当前结核病治疗中所面临的最严重问题。筛选、发现和验证抗结核药物的分子靶标，从靶标上实施突破，是获得新型高效低毒抗结核药物、解决结核治疗特别是耐药结核治疗问题的关键所在。

[0004] 核糖体是细胞内蛋白质合成的场所，而细胞生命的维持依赖于蛋白质功能的正常行使，因此核糖体成为药物研发的重要靶标(Huntington K M，et al.Synthesis and antibacterial activityof peptide deformylase inhibitors.Biochemistry，2000，39(15)：4543-4551；Sinha R R，et al.Thiazoleand oxazole peptides：biosynthesis and molecular machinery.NatProd Rep，1999，16(2)：249-263.)。蛋白-蛋白的相互作用是生命活动中广泛而重要的相互作用，是蛋白质正常行使其功能的重要条件，因此蛋白-蛋白相互作用是药物靶标研究的另一重要方向。微生物核糖体蛋白由50S大亚基和30S小亚基组成，大亚单位含有23SrRNA，5SrRNA与30多种蛋白质，小亚单位含有16SrRNA与20多种蛋白质。这些蛋白复合并与核糖组成核糖体正常行使其功能。在微生物核糖体组成蛋白中，众多蛋白作为组成型或功能型亚基协同发挥作用。

[0005] 目前，已经发现多个蛋白间的相互作用机制，如通过共结晶方法证实E.coli核糖体大亚基组成蛋白L12和L10存在相互作用(Gudkov，A.T.The L7/L12 ribosomal domain of the ribosome：structural and functional studies.FEBS Lett，1997，407：253-256.)。L12(L7/L12)(编码基因是rplL)是核糖体组成蛋白中唯一的多拷贝蛋白，其中L12是正常的，L7是N末端丝氨酸氨酰化的蛋白，二者以4∶1比例的二聚体形式存在，简称L12。
在核糖体中L12对于转录的有效性和精确性是重要的，并能够激发转录因子的GTP激酶活性。在L12的N末端有两个与L10结合的部位，L12功能的发挥依赖L10(编码基因是rplJ)将其锚定于大亚基(Mihaela Diacnu，et al.Structural Basis for the Functionof the Ribosome L7/L12 Stalk in Factor Binding and GTPaseActivation.Cell，2005，121：
991-1004；Griaznova O，Traut RR.Deletion of C-terminal residues of Escherichia coli ribosomalprotein L10 causes the loss of binding of one L7/L12 dimer：ribosomes with one L7/L12 dimer are active.Biochemistry，2000，39(14)：4075-4081.)。

[0006] L12和L10在结核杆菌中与E.coli中具有高度的保守性，S.T.Cole的研究也表明结核杆菌中的L12与L10具有相互作用(S.T.Cole，R.Brosch，J.Parkhill，et al.Deciphering the biology ofMycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence.Nature，1998，393，537-544.)。L12与L10相互作用的正常进行是结核杆菌正常生长所必须的；而L12和L10的编码基因在结核杆菌内具有保守性并且与人类基因具有很低的同源性，因此具备作为抗结核药物靶标的基本条件。

[0007] 尽管L12和L10的相互作用已经通过共结晶方法进行验证，但是能否能在生物模型中验证结核杆菌的L12和L10相互作用，这种相互作用能否用于新型抗结核药物筛选，仍需要进一步的研究。

发明内容

[0008] 本发明人经过创造性的劳动和大量的试验，首次利用酵母双杂交的方法(Fields S，Song O.A novel genetic system to detect protein-protein interaction.Nature，1989，340：245-246；M Yang，Z Wu，and Fields S.Protein-peptide interactions analyzed with he yeast two-hybrid System.Nucleic Acids Res，1995，23：1152-1156.)证明了结核杆菌L12和L10之间的相互作用。并且惊奇地发现，L12和L10在酵母细胞中能够相互作用，使得酵母双杂交系统载体中的真核转录因子的DNA结合结构域和转录激活结构域在空间上也相互接近，形成完整的转录因子，从而激活宿主菌报告基因的表达。本发明人基于此建立了L12和L10相互作用阻断剂的体外高通量筛选模型(图1)，并利用此模型对4000个化合物进行筛选，成功发现了具有体外抗结核活性的阳性候选化合物。由此提供了下述发明：

[0009] 本发明的一个方面涉及一种细胞，其表达结核杆菌核糖体蛋白L12和L10，其中，L12的编码基因与转录因子的转录激活结构域(AD)位于一个表达载体，L10的编码基因与转录因子的DNA结合结构域(BD)位于另一个表达载体。所述的两个表达载体是不同的。

[0010] 具体地，所述载体可以是pGBKT7、pGADT7等。

[0011] 根据本发明任一项所述的细胞，其为酵母细胞。

[0012] 根据本发明任一项所述的细胞，其中，所述转录因子为GAL4。

[0013] 根据本发明任一项所述的细胞，其中，L12蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，L10蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

[0014] MAKLSTDELLDAFKEMTLLELSDFVKKFEETFEVTAAAPVAVAAAGAAPAGAAVEAAEEQSEFDVILEAAGDKKIGVIKVVREIVSGLGLKEAKDLVDGAPKPLLEKVAKEAADEAKAKLEAAGATVTVK(SEQ ID NO：1)[0015] MARADKATAVADIAAQFKESTATLITEYRGLTVANLAELRRSLTGSATYAVAKNTLIKRAASEAGIEGLDELFVGPTAIAFVTGEPVDAAKAIKTFAKEHKALVIKGGYMDGHPLTVAEVERIADLESREVLLAKLAGAMKGNLAKAAGLFNAPASQLARLAAALQEKKACPGPDSAE(SEQ ID NO：2)

[0016] 根据本发明任一项所述的细胞，其中，L12蛋白的编码基因的核苷酸序列序列如SEQ ID NO：3(rplL，GeneID：888078)所示，L10蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：4(rplJ，GeneID：888049) 所示。

[0017] ATGGCAAAGCTCTCCACCGACGAACTGCTGGACGCGTTCAAGGAAATGACCCTGTTGGAGCTCTCCGACTTCGTCAAGAAGTTCGAGGAGACCTTCGAGGTCACCGCCGCCGCTCCAGTCGCCGTCGCCGCCGCCGGTGCCGCCCCGGCCGGTGCCGCCGTCGAGGCTGCCGAGGAGCAGTCCGAGTTCGACGTGATCCTTGAGGCCGCCGGCGACAAGAAGATCGGCGTCATCAAGGTGGTCCGGGAGATCGTTTCCGGCCTGGGCCTCAAGGAGGCCAAGGACCTGGTCGACGGCGCGCCCAAGCCGCTGCTGGAGAAGGTCGCCAAGGAGGCCGCCGACGAGGCCAAGGCCAAGCTGGAGGCCGCCGGCGCCACCGTCACCGTCAAGTAG(SEQ ID NO：3)

[0018] ATGGCCAGGGCTGACAAGGCCACCGCCGTCGCAGACATCGCAGCGCAGTTCAAGGAGTCGACCGCGACGTTGATCACCGAATACCGCGGCTTGACGGTGGCCAACCTGGCCGAGCTACGCAGGTCTCTGACGGGGTCGGCGACCTACGCGGTGGCCAAAAACACACTCATCAAGCGGGCGGCCTCCGAGGCCGGCATCGAGGGCCTCGACGAACTGTTTGTGGGCCCCACCGCGATCGCGTTCGTCACCGGTGAGCCGGTCGACGCCGCCAAGGCCATCAAGACCTTCGCCAAGGAGCACAAGGCGCTGGTCATCAAGGGCGGCTACATGGACGGCCACCCATTGACCGTGGCCGAAGTCGAGCGCATCGCCGACCTGGAGTCCCGCGAGGTGTTACTGGCCAAGCTGGCCGGTGCGATGAAGGGCAACCTGGCCAAGGCGGCCGGGTTGTTCAACGCGCCGGCCTCGCAGCTGGCCCGGCTCGCGGCCGCCCTGCAGGAAAAGAAGGCCTGCCCAGGCCCAGACTCAGCCGAGTAG(SEQ ID NO：4)

[0019] 根据本发明任一项所述的细胞，其中，所述细胞能够在缺陷性培养基SD/-Trp-Leu-His-Ade上生长。

[0020] 在本发明的一个实施方案中，所述细胞为经共转化能表达L10和L12蛋白并且能检测此二者相互作用的酵母菌AH109(AD-L12+BD-L10)。

[0021] 在本发明的一个实施方案中，所述的筛选模型中能共表达L10和L12蛋白并且能检测这两个蛋白相互作用的重组酵母菌AH109(AD-L12+BD-L10)是通过如下方法制备的：使用酵母菌AH109、GAL4DNA结合域表达载体pGBKT7(BD)，GAL4DNA激活域表达载体pGADT7(AD)(均购自clontech酵母双杂交系统)。将重组质粒AD-L12+BD-L10通过 LiAc方法共转化入感受态酵母菌AH109中，在缺陷性培养基SD/-Trp-Leu上培养。挑取阳性克隆进行L12和L10相互作用的验证：将阳性克隆转接到缺陷性培养基SD/-Trp-Leu-His-Ade上，能够正常生长。通过β-半乳糖苷酶活性检测，进一步验证了L12和L10的相互作用，将此阳性克隆命名为AH109(AD-L12+BD-L10)，可以加上筛选阴性对照AH109(AD-T+BD-53)(购自clontech酵母双杂交系统)以及筛选空白对照AH109一起作为高通量筛选的模型。

[0022] 本发明的另一方面涉及一种用于筛选结核杆菌L12蛋白和L10蛋白相互作用阻断剂、抗结核杆菌药物、或者治疗和/或预防结核病的药物的细胞模型，其包含本发明中任一项所述的细胞。

[0023] 根据本发明任一项所述的细胞模型，其还包含空白对照细胞和/或阴性对照细胞；优选地，所述空白对照细胞为不转染有任何载体的空白酵母细胞，所述阴性对照细胞为染有两个不同的表达载体(可以与本发明的细胞中的两个表达载体相同)的酵母细胞，两个表达载体中各插入有不同的基因，该两个不同的基因表达的蛋白能够相互结合，并且表达的蛋白不是L12和L10；更优选地，所述细胞模型包含AH109(AD-L12+BD-L10)、AH109(AD-T+BD-53)(阴性对照)以及AH109(空白对照)。

[0024] 本发明的还一方面涉及本发明中任一项所述的细胞或者细胞模型在筛选结核杆菌L12蛋白和L10蛋白相互作用阻断剂、抗结核杆菌药物、或者治疗和/或预防结核病的药物中，或者测定抗结核杆菌活性中的用途。

[0025] 本发明的还一方面涉及一种筛选结核杆菌L12蛋白和L10蛋白相互作用阻断剂、抗结核杆菌药物、或者治疗和/或预防结核病的药物的方法，一种或者测定抗结核杆菌活性的方法，包括下述步骤：

[0026] 1)将本发明的任一项所述的细胞或者细胞模型接种并进行培养；

[0027] 2)分别向步骤1)中培养的细胞中加入待测化合物或组合物，使化合物或组合物的终浓度为10μg/m，继续进行培养12-36小时；

[0028] 3)观察细胞的生长情况，找出对模型细胞具有抑制作用的化合物或组合物，得到初筛阳性的化合物或组合物。

[0029] 具体地，当加入的化合物或组合物后，通过与不加入待测化合物或者组合物的对照组的生长情况相比较，可将化合物的作用分为三类(图2)：

[0030] 特异性阻断作用：只有本发明的细胞例如生长受到抑制；

[0031] 非特异性阻断作用：只有本发明的细胞和阴性对照受到抑制；

[0032] 潜在的抗真菌作用：本发明的细胞、阴性对照、空白对照都受到抑制。阴性对照、空白对照的定义如前面所描述。

[0033] 在一个具体的实施方案中，本发明的细胞为AH109(AD-L12+BD-L10)，阴性对照为AH109(AD-T+BD-53)，空白对照为AH109。

[0034] 根据本发明的任一项所述的方法，其还包括下述步骤：

[0035] 4)将初筛阳性的化合物或组合物进行β-半乳糖苷酶活性抑制检测。

[0036] 在本发明的一个实施方案中，所述方法包括下述步骤：

[0037] 1)收集对数生长期的细胞AH109(AD-L12+BD-L10)、AH109(AD-T+BD-53)以及AH109，用缺陷性培养基SD/-Trp-Leu-His-Ade将筛选模型AH109(AD-L12+BD-L10)、筛选阴性对照AH109(AD-T+BD-53)以1∶100转接入96孔板，用培养基YPD将筛选空白对照AH109同样以1∶100接种至96孔板。每孔加入细胞培养液198μl；

[0038] 2)将筛选模型AH109(AD-L12+BD-L10)、筛选阴性对照AH109(AD-T+BD-53)、筛选空白对照AH109孔中，加入2μl(1mg/ml)化合物或组合物，使化合物或组合物的终浓度为10μg/m。同时设立对照组，每孔中含有198μl细胞培养液，加入2μl相应的培养基。将
96孔板放入30℃培养箱中培养；

[0039] 3)24h后，取出96孔板观察每孔中细胞的生长情况；

[0040] 4)将初筛阳性的化合物或组合物，做β-半乳糖苷酶活性抑制检测。 将筛选模型AH109(AD-L12+BD-L10)、筛选阴性对照AH109(AD-T+BD-53)在缺陷性培养基SD/-Trp-Leu-His-Ade中30℃过夜培养至对数生长期。之后，将50μl过夜培养细胞以1∶100比例转接至5ml缺陷性培养基SD/-Leu/-Trp中，同时，加入相应浓度(终浓度为
50、10、5、1、0.5、0.1μg/ml)的化合物，继续培养。24h后收集细胞，做β-半乳糖苷酶活性定量检测。

[0041] 本发明的还一方面涉及式I或式II所示的化合物或其药学上可接受的盐在制备结核杆菌L12蛋白和L10蛋白相互作用阻断剂、抗结核杆菌药物、或者治疗和/或预防结核病的药物中的用途。

[0042]

[0043] 本发明的还一方面涉及一种抑制结核杆菌的方法，包括使用有效量的式I或式II化合物或其药学上可接受的盐的步骤。

[0044] 本发明的还一方面涉及一种治疗或预防结核病发方法，包括给予有效量的式I或式II化合物或其药学上可接受的盐的步骤。

[0045] 在本发明中，L12和L10的相互作用是指L12的N端与L10的C端能够结合。

[0046] 术语“DNA结合结构域”是指DNA特异性结合功能域。GAL4的DNA结合结构域靠近羧基端，含有至少一个锌指结构，可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位点(UAS)。

[0047] 术语“转录激活结构域”是指与其他调控蛋白相互作用的激活功能域。GAL4的转录激活结构域可与RNA聚合酶或转录因子TFIID相互作 用，提高RNA聚合酶的活性。

[0048] 发明的有益效果

[0049] 本发明的细胞或者细胞模型能够有效地用于筛选结核杆菌L12蛋白和L10蛋白相互作用阻断剂、抗结核杆菌药物、或者治疗和/或预防结核病的药物，并且省去了相互作用蛋白的纯化，筛选过程简单、经济，适合于高通量筛选。

附图说明

[0050] 图1：模型筛选策略示意图。

[0051] 图2：用筛选模型筛选化合物的结果。其中，+指的是加入待测化合物，-指的是没有加入待测化合物

[0052] 图3：rplL(L12的编码基因)、rplJ(L10的编码基因)基因的PCR扩增结果。其中，泳道1：rplL的PCR产物；泳道2：rplL的空白对照；泳道3，rplJ的PCR产物；泳道4，rplJ的空白对照，泳道M，分子量marker。

[0053] 图4：从左至右依次是AD-L12，BD-L10，AD-L10，BD-L12质粒的NdeI，BamHI双酶切结果。泳道1：AD-L12的双酶切；泳道2：AD-L10的双酶切；泳道3：BD-L12的双酶切；泳道4：BD-L10的双酶切；泳道M为分子量marker。

[0054] 图5：筛选模型酵母菌AH109(AD-L12+BD-L10)，筛选阳性对照AH109(AD-T+BD-53)以及酵母双杂 交假阴性菌AH109(AD-L10+BD-L12)，酵母 双杂交自激活检 测AH109(AD+BD-L10)、AH109(AD-L12+BD)，酵母双杂交阴性对照AH109(AD-T+BD-53)在缺陷性培养基SD/-Trp-Leu-His-Ade上的生长情况。图中A代表AD-T+BD-53；B代表AD-L12+BD-L10；C代 表AD-L10+BD-L12；D 代 表AD-L12+BD；E代 表AD+BD-L10；F代 表AD-T+BD-lam。

[0055] 图6：筛选模型酵母菌AH109(AD-L12+BD-L10)，筛选阳性对照AH109(AD-T+BD-53)以及酵母双杂交假阴性菌AH109(AD-L10+ BD-L12)，酵母双杂交自激活检测AH109(AD+BD-L10)、AH109(AD-L12+BD)，酵母双杂交阴性对照AH109(AD-T+BD-53)的β-半乳糖苷酶活性定性检测。

[0056] 图7：筛选模型酵母菌AH109(AD-L12+BD-L10)，筛选阳性对照AH109(AD-T+BD-53)以及酵母双杂 交假阴性菌AH109(AD-L10+BD-L12)，酵母 双杂交自激活检 测AH109(AD+BD-L10)、AH109(AD-L12+BD)，酵母双杂交阴性对照AH109(AD-T+BD-53)的β-半乳糖苷酶活性定量检测。

[0057] 图8：阳性化合物T766和T054的β-半乳糖苷酶活性抑制检测。图8A，T766；图8B，T054。

[0058] 图9：蛋白His-L10及His-L12的表达及纯化。His-L10的SDS-PAGE检测以及Western blotting分析。图9A，His-L10的SDS-PAGE检测以及Western blotting分析，其中泳道M，marker；泳道1，经诱导的pET-16b(+)全菌蛋白上清；泳道2，经诱导的pET16b-L10全菌蛋白上清；泳道3，纯化的His-L10蛋白。图9B，His-L12的SDS-PAGE检测以及Western blotting分析，其中泳道M，marker；泳道1，经诱导的pET-16b(+)全菌蛋白上清；泳道2，经诱导的pET16b-L12全菌蛋白上清；泳道3，纯化的His-L12蛋白。

[0059] 图10：图10A，蛋白His-L12与His-L10相互作用的Biacore检测结果；图10B，蛋白His-L12与化合物T766相互作用的Biacore检测结果(从上往下每条曲线以此对应于加入如下的化合物T766的量情形：40μM、20μM、10μM、5μM、2.5μM、0μM)；图10C，蛋白His-L12与化合物T054相互作用的Biacore检测结果(从上往下每条曲线以此对应于加入如下的化合物T054的量情形：40μM、20μM、10μM、5μM、2.5μM、0μM)；图10D，化合物T766和T054对蛋白His-L12与His-L10相互作用的阻断。图10A-D中，纵坐标中的RU(response unit)表示反应单位，1个RU相当于1个反应单位。

具体实施方式

[0060] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

[0061] 实施例1：酵母双杂交系统的构建

[0062] 1.rplL(L12编码基因)、rplJ(L10编码基因)基因的制备

[0063] 以结核杆菌H37Rv总cDNA(本室保存；也可商购菌株然后用本领域人员熟知的方法例如cDNA提取试剂盒制备得到结核杆菌H37Rv总cDNA)为模板，设计引物1和2，引物3和4，使用TaKaRa公司的高保真PrimeSTAR HS DNA聚合酶，通过PCR方法得到rplL(L12的编码基因)、rplJ(L10的编码基因)。具体克隆方法及引物如下：

[0064] 1)扩增rplL(L12的编码基因)的引物：

[0065] 引物1：5’-TCCATATGGCAAAGCTCTCCACCGACG-3’(SEQ ID NO：5)(下划线部分为Nde I酶切位点)

[0066] 引物2：5’-GCGGATCCACACGCTGGGCAGAGCTAC-3’(SEQ ID NO：6)(下划线部分为BamH I酶切位点)

[0067] 2)扩增rplJ(L10的编码基因)的引物：

[0068] 引物3：5’-TCCATATGGCCAGGGCTGACAAG-3’(SEQ ID NO：7)(下划线部分为Nde I酶切位点)

[0069] 引物4：5’-GCGGATCCTGGGTGACTACTCGG-3’(SEQ ID NO：8)(下划线部分为BamH I酶切位点)

[0070] PCR方法按照TaKaRa公司的高保真PrimeSTAR HS DNA聚合酶的说明书推荐的步骤进行。将一部分PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳验证，电泳结果如图3所示，大小与预期一致。PCR产物回收后，与pEASY-Blunt simple载体连接后测序鉴定，测序结果正确。

[0071] 2.重组表达载体的构建

[0072] 上述各片段经酶切后，回收酶切产物。BD、AD载体经Nde I，BamHI双酶切后，回收线性载体，并分别与rplL(L12的编码基因)、rplJ(L10的编码基因)各片段连接，成功构建表达载体AD-L12，BD-L10，AD-L10，BD-L12，Nde I，BamH I的酶切鉴定(琼脂糖凝胶电泳)结果见图4，大小与预期一致。其中：

[0073] 酶切体系如下：

[0074]

[0075] 连接体系如下：

[0076]

[0077] 3.酵母感受态细胞的制备

[0078] 1)将6ml酵母培养液在室温下5,000g离心5min。

[0079] 2)弃上清，用1.5ml超纯水浮起洗涤，室温6,000g离心5min。

[0080] 3)弃上清，沉淀溶于20μl 10×TE、20μl 1×LiAc、160μl超纯水吹起弹起，即为酵母感受态细胞(1h内用完)。

[0081] 4.共转化

[0082] 在1.5ml离心管中加入0.1μg上面构建的AD质粒DNA和0.1μgBD质粒DNA、以及100μg鲑精DNA(鲑精DNA使用前用沸水煮20min后快速置于冰浴)，混匀，加入0.1ml酵母感受态细胞，混匀，再加入0.6ml灭菌的PEG/LiAc溶液(体积比10×TE∶10×LiAc∶50％PEG4000＝1∶1∶8)，高速振荡10s以混匀，之后，30℃，200rpm培养30min，42℃热激
15min，再置于冰上冷却1-2min，14,000rpm室温离心5s，去上清。沉淀用200μl灭菌水重悬后涂布在SD/-Leu-Trp(DO/-Trp-Leu 0.64g，YNB 6.7g，葡萄糖20g，加超纯水定容至
1000ml，112℃灭菌20min。固体培养基含Difco Agar20g/L。)平板上，30℃倒置培养。把在SD/-Leu-Trp平板上生长的阳性克隆接种在SD/-Leu-Trp-His-Ade(DO/-Trp-Leu-His-Ade0.6g，YNB 6.7g，葡萄糖20g，加超纯水定容至1000ml，112℃灭菌20min。固体培养基含Difco Agar 20g/L。)上，如果在SD/-Leu-Trp-His-Ade平板上酵母菌能够生长，则说明L12和L10蛋白有相互作用(图5)。

[0083] 5.β-半乳糖苷酶活性检测

[0084] 1)β-半乳糖苷酶活性定性检测

[0085] 将在SD/-Leu-Trp-His-Ade上生长的酵母菌落用无菌牙签挑到一张干净的滤纸上，菌落面朝上，置于液氮中10s，室温解冻后，将滤纸放入事先浸泡于Z buffer/X-gal溶液中的另一张干净的滤纸上，30℃孵育，观察菌落是否出现蓝色，以8h之内出现蓝色为阳性，没有颜色变化的为阴性(图6)。由图6可见，AD-L10+BD-L12的菌落没有变蓝色(因此不能够作为本发明的细胞模型)，只有AD-L12+BD-L10的菌落变蓝。

[0086] 2)β-半乳糖苷酶活性定量检测

[0087] a)收集在液体培养基SD/-Leu-Trp-His-Ade中生长的酵母菌，漩涡混匀测量OD600值。

[0088] b)将每一管菌液转移至3个1.5ml的EP管中，14,000rpm离 心30s。弃去上清，在每个EP管中加入1.5ml Z buffer(0.1M Na2HPO4，35mM NaH2PO4，10mM KCl，and 1mM MgSO4，pH 7.0)，重悬细胞。再次14,000rpm离心30s，弃去上清。用300μl Z buffer重悬细胞。

[0089] c)将0.1ml细胞悬液重新置于另一个干净的EP管中。并将此EP管放入液氮0.5-1min，之后37℃水浴0.5-1min。反复冻融2次以上，确保细胞完全裂解。用100μl Z buffer设置一空白对照。

[0090] d)在每一个EP管中(包括空白对照)加入0.7ml Z buffer(含有0.27％的β-巯基乙醇)。

[0091] e)迅速加入160μl ONPG(用Z buffer溶解，4mg/ml)至每个EP管中，并将EP管放入30℃。开始计时。当EP管中出现黄色后，在每管中加入0.4ml 1M Na2CO3，终止反应。记录所用的时间t。

[0092] f)将EP管中的液体14,000rpm离心10min，之后，将上清转移至干净的比色皿中(不要吸入沉淀，以免影响比色)，测量OD420(与空白对照管相对比)。OD420应在0.02-1.0之间。

[0093] g)计算β-半乳糖苷酶活性。

[0094] β-gal units＝1000×OD420/(t×V×OD600)V＝0.1ml×5

[0095] h)如图7为AH109(AD-L12+BD-L10)的β-半乳糖苷酶活性定量检测。

[0096] 实施例2：初筛阳性化合物的β-半乳糖苷酶活性抑制检测

[0097] 1.将筛选模型AH109(AD-L12+BD-L10)、筛选阴性对照AH109(AD-T+BD-53)在缺陷性培养基SD/-Trp-Leu-His-Ade中30℃过夜培养至对数生长期。

[0098] 2.将50μl过夜培养细胞以1∶100比例转接至5ml缺陷性培养基SD/-Leu/-Trp中，同时，加入相应浓度(终浓度为50、10、5、1、0.5、0.1μg/ml)的化合物，继续培养。

[0099] 3.24h后收集细胞，做β-半乳糖苷酶活性定量检测。方法参照实施例1中所述。求得β-gal units。

[0100] 4.将没有加阳性化合物的筛选模型AH109(AD-L12+BD-L10)、筛选阴性对照AH109(AD-T+BD-53)求得的β-gal units(0)值作为100％，加入不同浓度化合物的筛选模型AH109(AD-L12+BD-L10)、筛选阴性对照AH109(AD-T+BD-53)求得的β-gal units(50、10、5、1、0.5、0.1)值分别与β-gal units(0)相除，得到β-gal units％(50、10、5、1、0.5、
0.1)，进行统计学分析。

[0101] 其中筛选的化合物为4000种(本实验室的化合物库，也可以使用商购的化合物库或者任何待测的样品，例如化合物或组合物)。

[0102] 初筛阳性化合物T766和T054的结构式分别如下面的式I和式II所示：

[0103]

[0104] 如图8A为T766的β-半乳糖苷酶活性抑制检测结果，图8B为T054的β-半乳糖苷酶活性抑制检测结果。结果说明这两个化合物都能够有效地阻断L12和L10的相互作用。

[0105] 实施例3：阳性化合物的抗结核杆菌活性检测

[0106] 基于96孔板，200μl培养体系，7H9培养基，结核杆菌标准菌株H37Rv浓度：106CFU/ml。初始浓度为40μg/ml，二倍稀释，成为MIC实验用浓度40μg/ml、20μg/ml、
10μg/ml、5μg/ml、2.5μg/ml、1.25μg/ml、0.625μg/ml、0.312μg/ml、0.156μg/ml。
37℃孵育7d，加入20μl 10×Alamar blue和5％Tween80 50μl混合液，37℃再孵育24h后，应用多功能酶标仪测定，定量得到MIC数据。T766的MIC测定值为0.312μg/ml，T054的MIC测定值为1.25μg/ml。结果说明这两个化合物都能够有效地抑制结核杆菌。

[0107] 实施例4：L10、L12蛋白的表达纯化

[0108] 1.将实施例1中构建好的pEASY-Blunt-L10、pEASY-Blunt-L12用Nde I、BamH I双酶切之后，与用Nde I、BamH I双酶切的pET-16b(+)载体相连接。成功构建质粒pET16b-L10、pET16b-L12，并将其转入BL21(DE3)，用于L10、L12蛋白的表达。

[0109] 2.将BL21(DE3)/pET16b-L10、BL21(DE3)/pET16b-L12菌接种于含有100μg/ml Amp的LB液体培养基，200rpm，37℃过夜培养。

[0110] 3.将BL21(DE3)/pET16b-L12过夜培养物按1∶100的比例接种于含有100μg/ml Amp的新鲜LB液体培养基中，200rpm，37℃培养至菌体OD600＝0.6。在培养物中加入IPTG至终浓度为0.5mM，30℃培养8h。

[0111] 将BL21(DE 3)/pET16b-L10过夜培养物按1∶100的比例接种于含有100μg/ml Amp的新鲜ZYM-5052(1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，0.5％甘油，0.05％葡萄糖，0.2％乳糖，25mM Na2HPO4，25mM KH2PO4，50mMNH4Cl，5mM Na2SO4，2mM Mg2SO4，0.2×微量元素)液体培养基中，200rpm，37℃培养至菌体OD600＝1.0。然后20℃培养过夜。

[0112] 4.收集诱导蛋白表达的菌体BL21(DE3)/pET16b-L10、BL21(DE3)/pET16b-L12，1000×g离心10min，弃上清。

[0113] 5.用Binding buffer(20mM Na3PO4，0.5M NaCl，30mM咪唑)悬浮菌体细胞，每100ml菌液离心所得的菌体加入40ml Bindingbuffer。

[0114] 6.超声破碎菌体细胞，冰浴，400W，5s/10s，100次。

[0115] 7.离心去除细胞碎片，4℃，12,000rpm离心15min，弃沉淀，收集上清。

[0116] 8.使用 层析系统及His bind亲和柱，用上样缓冲液binding buffer平衡柱子，上样。之后用洗脱缓冲液Elution buffer(20mM Na3PO4，0.5M NaCl，500mM咪唑)进行梯度洗脱。至洗脱缓冲液洗至出峰，每管收集1ml洗脱液。

[0117] 9.超滤、脱盐：将经过洗脱收集到的样品加入Millipore超滤离 心管(10K)。4℃，12,000rpm离心15min，至样品量小于2.5ml。使用PD-10脱盐柱和脱盐缓冲液将超滤后的样品脱盐。使用Thermo蛋白定量试剂盒测定脱盐后蛋白的含量。-80℃保存。

[0118] 使用SDS-PAGE电泳以及Western blotting分析(His-tag抗体)，检测纯化的蛋白。

[0119] 结果如图9所示。图9A为His-L10蛋白的SDS-PAGE及Westernblotting，显示蛋白在15kD-25kD之间，符合预期。图9B为His-L12蛋白的SDS-PAGE及Western blotting)，显示蛋白在25kD-35kD之间，符合预期。

[0120] 实施例5：Biacore实验

[0121] 本实验均在PBST(PBS，0.05％吐温20，1％DMSO)缓冲液体系中进行，缓冲液使用前要过滤(0.22μm)脱气，使用Biacore 3000(Biacore AB，sweden)仪器完成。

[0122] 1.芯片表面预处理

[0123] 1)开机，等待 温度 稳定后，打开Biacore 3000 control software，取 出maintenance芯片，更换为新的CM5芯片，以PBST缓冲液进行Prime。

[0124] 2)Normalize，采用Biacore标准化试剂(BIA normalizingsolution 70％)对CM5芯片进行标准化处理。

[0125] 3)选择芯片通道，选择PH＝4.0的醋酸-醋酸钠溶液对His-L12进行包被检测。用PH＝4.0的醋酸-醋酸钠将His-L10蛋白稀释至50μg/ml，设置流速为10μl/min，结合时间为2min，最后以50mM NaOH冲洗芯片表面20s去除残留His-L12蛋白。

[0126] 2.His-L12包被于芯片CM5的表面

[0127] 1)将EDC/NHS等体积混合，以5μl/min的流速进样10min，对CM5芯片表面羧基进行活化。

[0128] 2)选择PH值为4.0的醋酸-错酸钠将His-L12蛋白稀释至50μg/ml，流速设置为10μl/min，结合时间为20min，并通过氨基偶 联作用将其包被在CM5芯片表面，同时设定一个空白通道作为对照。

[0129] 3)进样结束后加入乙醇胺，流速设置为10μl/min，结合时间为10min，以封闭芯片表面未结合氨基的活性羧基位点。

[0130] 4)将5mM NaOH以10μl/min的流速冲洗芯片表面3次，每次20s，以去除残留的以静电效应结合于芯片表面的His-L12蛋白，最终获得以最大偶联量包被His-L12蛋白的CM5芯片。将该芯片于4℃保存，备用。

[0131] 3.加入His-L10蛋白进行相互作用反应

[0132] 将不同浓度的His-L10蛋白(PBST缓冲液溶解)依次进样流经芯片表面，浓度分别为0，0.03，0.06，0.12，0.23，0.46，0.93μM，流速设置为10μl/min，结合时间设置为125s。

[0133] 4.对芯片表面进行再生

[0134] 每次结合反应结束后，通过摸索最适的再生条件对芯片进行再生。对于His-L12蛋白与His-L10蛋白的结合，选用50mM NaOH进样30s对芯片进行再生。

[0135] 5.结果分析

[0136] 得到的结合解离曲线均由BIAevaluation software 4.1软件进行分析。

[0137] 6.加入化合物T766、T054进行相互作用反应、再生以及分析

[0138] 将不同浓度的化合物T766、T054流经芯片表面，流速设置为10μl/min，结合时间设置为125s。再生条件选用50mM NaOH进样30s。结果分析同上。

[0139] 7.化合物T766、T054阻断His-L12与His-L10的相互作用

[0140] 将40μM的化合物T766注入芯片，设置流速10μl/min，结合时间330s，使包被His-L12的芯片表面达到饱和。之后注入His-L10蛋白，设置流速10μl/min，结合时间330s。同时设立阴性对照组。在阴性对照组中，先以同样的方式注入PBST缓冲液，之后注入His-L10蛋白。

[0141] 对于化合物T054采用与T766相同的方法进行阻断实验研究。

[0142] 结果如图10所示。结果显示，将纯化得到的His-L12包被CM5芯片，分别将纯化得到的His-L10以及阳性化合物(T766和T054)做为流动相检测时，发现His-L12与His-L10(图10A)、His-L12与阳性化合物T766(图10B)和T054(图10C)均有相互作用。之后，将阳性化合物先与包被His-L12的CM5芯片结合，并多次注入使之饱和，然后再检测His-L12与His-L10的结合，发现二者相互作用明显减弱(图10D)。

[0143] 而在对照中，以相同条件多次注入系统缓冲液，然后再检测His-L12与His-L10的结合，发现His-L12与His-L10的相互作用不受影响。

[0144] 因此，化合物T766和T054能够有效地阻断蛋白His-L12与His-L10的相互作用。

[0145] 尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。