一种微生物催化不对称水解制备(-)γ-内酰胺的方法

摘要

本发明公开了一种微生物催化不对称水解制备(-)γ-内酰胺的方法，属于生物工程技术领域。外消旋体2-氮杂二环-[2.2.1]-庚烷-5-烯-3-酮（以下简称(±)γ-内酰胺）。本发明方法利用从土壤中筛选获得的具有高对映选择性的(+)γ-内酰胺酶的微生物菌株，鉴定为戴尔福特菌（Delftiasp.），保藏号为CGMCCNo.5755；在水相体系中立体选择性水解(±)γ-内酰胺，制备(-)γ-内酰胺。在200g/L底物浓度条件下，产物(-)γ-内酰胺经萃取、蒸发浓缩、冷却结晶得到产物(-)γ-内酰胺的光学纯度95.0%－99.9%，化学纯度为95%－99%。该微生物催化不对称水解(±)γ-内酰胺制备(-)γ-内酰胺的方法具有高立体选择性、高反应产率和高产物浓度的特点。

权利要求

1.一株产高对映选择性(+)γ-内酰胺酶酶活的菌株，其分类命名为戴尔福特菌（Delftia sp.）JNU-GL，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5755。

2.一种用权利要求1所述菌株微生物立体选择性水解外消旋(±)γ-内酰胺，制备(-)γ-内酰胺的方法，其特征在于，采用具有立体选择性(+)γ-内酰胺酶酶活的微生物菌株，在水相体系中，以(±)γ-内酰胺为底物，进行不对称水解拆分制备(-)γ-内酰胺，步骤如下：（1）微生物菌株：戴尔福特菌（Delftia sp.）CGMCC No.5755；

（2）微生物发酵培养条件：优化的培养基组成以g/L计为：蔗糖 5－100，蛋白胨 5－

50，牛肉膏 5－50，乙酰胺 5－150，MgSO4 0.5－5，NaH2PO4 1－10，Na2HPO4 1－10，pH

7；培养温度20－40℃；培养时间1－3天，将发酵液离心获得湿菌体；

（3）反应体系的配制：以(±)γ-内酰胺为底物，用pH 7、0.01－0.5 M磷酸盐缓冲液水相反应体系，底物浓度为2 g/L－600 g/L；

（4）全细胞生物催化反应：在步骤（3）的单一水相反应体系中，加入5 g/L－100 g/L湿菌体，反应温度为25－45℃，反应时间为2－24 h，摇床转速为100－300 rpm；

（5）转化液的处理和分析：微生物催化反应之后的转化液，离心除去菌体，上清液采用乙酸乙酯萃取，加适量无水硫酸镁干燥后，进行手性HPLC检测；

（6）产物的分离提取：采用乙酸乙酯萃取产物，无水硫酸镁干燥，在30－80℃下蒸发浓缩，-20－4℃下冷却结晶，得到高纯度的(-)γ-内酰胺，光学纯度95.0%－99.9%，化学纯度为95%－99%。

说明书

一种微生物催化不对称水解制备(-)γ-内酰胺的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种利用微生物立体选择性水解外消旋体(±) γ-内酰胺制备(-)γ-内酰胺的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

[0002] 光学纯(-)-γ-内酰胺是重要的医药中间体。抗艾滋病药(-)abacavir和(-)carbovir均能以(-)-γ-内酰胺为原料进行合成，以(-)-γ-内酰胺为光学中间体，还可以合成抗流感药物帕拉米韦[王建军等：微生物学报，50(8):988-994,2010]。由于上述手性药物的需求量不断增加，作为重要手性中间体的光学纯(-)-γ-内酰胺制备研究越来越受到人们的关注。目前已有的制备方法包括化学合成法和生物拆分法。化学法制备(-)γ-内酰胺的主要问题为副产物多、产率低、制备成本高、步骤繁琐等，从而使得最终的产品含量低，不能满足制药要求。生物拆分(±) γ-内酰胺主要是利用具有立体选择性的酶对(±) γ-内酰胺选择性拆分而得到(-)γ-内酰胺，具有反应条件温和，立体选择性好，产物光学纯度高，且不污染环境等诸多优点，有广泛的应用前景。有关该方法的研究主要集中在筛选高对映选择性的(+)γ-内酰胺酶的产生菌株。Brabban 和Mahmoudian 等以N-乙酰苯丙氨酸为唯一碳源，筛选得到了产(+)γ-内酰胺酶菌株荧光假单胞菌，将来源于该菌的(+)γ-内酰胺酶进行了分离纯化[Mahmoudian M, et al,:Tetrahedron:Asymmetry10,1201-1206,1999;AD Brabban et al,:Journal of industrial Microbiology
16,8-14,1996]；Toogood等在超高温古菌Sulfolobus solfatarius中分离出了(+)γ-内酰胺酶，该酶的热稳定性较好，具有绝对选择性，只专一性水解(+)γ-内酰胺，而不会水解(-)γ-内酰胺 [Toogood,et al,:Tetrahedron 60,711–716,2004]。国内相关研究较少，李海泉等以N-乙酰苯丙氨酸为唯一碳源，筛选出了一株产γ-内酰胺酶的微杆菌氧化烃微杆菌(Microbacterium hydrocarbonoxydans) [李海泉等：微生物学报，46(4)：
57l-575，2006]；但该菌株能耐受的底物浓度较低(0.5 g/L－20 g/L) [郑国钧等：CN
101113423A]，尚未达到工业化生产的要求；后来他们对该菌种进行了诱变 [郑国钧等：CN
101240257A]，使酶活提高了11倍。并对诱变菌株进行了细胞固定化研究，提高了细胞的稳定性，可重复使用[郑国钧等：CN 101285059A]，尽管酶活有了很大的提高，但是能耐受的底物浓度仍不高，不利于工业化生产的应用。

发明内容

[0003] 本发明的目的是提供一种微生物立体选择性水解外消旋体2-氮杂二环-[2.2.1]-庚烷-5-烯-3-酮（以下简称(±) γ-内酰胺），制备(-)γ-内酰胺的方法。

[0004] 为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：从土壤中筛选获得具有高对映选择性(+)γ-内酰胺酶酶活的菌株－戴尔福特菌（Delftia sp.）CGMCC No.5755，利用该微生物菌株立体选择性水解外消旋底物(±) γ-内酰胺，制备(-)γ-内酰胺。步骤如下：

[0005] （1）微生物菌株的筛选：

[0006] 将从本地化工厂附近采集的20多份土样，用无菌水稀释静置后取上清接种于富集培养基，将富集培养后的菌液涂布于平板筛选培养基，20-30℃培养2－3天，挑取单菌落，进行活性测定。

[0007] 将筛选获得的单菌落接入发酵培养基中，在20－40℃、50－250 r/min下培养48 h后，将离心获得的湿菌体悬浮于磷酸盐缓冲溶液 (0.01－0.5 mol/L，pH 4－10)中，添加终浓度为5－20 g/L的(±) γ-内酰胺底物，在20－40℃，100－300 r/min下反应12－48 h，取样进行HPLC分析。

[0008] 富集培养基（g/L）：酵母提取物 0.05－2，(±) γ-内酰胺 0.2－10，NH4Cl0.2－10，NaH2PO4 0.01－0.5，Na2HPO4 0.01－0.5，MgSO4 0.01－0.5，pH 4－10。

[0009] 平板筛选培养基（g/L）：酵母提取物0.01－2，N-乙酰-L-苯丙氨酸0.2－10，NH4Cl 0.2－10，NaH2PO4 0.01－0.5，Na2HPO4 0.01－0.5，MgSO4 0.01－0.5，琼脂粉10－30，pH 4－10。

[0010] 发酵培养基（g/L）：牛肉膏0.3－20，蛋白胨2－50，NaCl 1－25，pH 4－10。在以上培养基50 mL装于250 mL的三角瓶中，121℃、0.15 Mpa灭菌20 min。

[0011] 筛选得到一株具有较高(+)γ-内酰胺酶活性的微生物菌株JNU-GL,该菌株经鉴定为戴尔福特菌Delftia sp.，现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5755。

[0012] （2）一种用所述菌株微生物立体选择性水解外消旋(±) γ-内酰胺，制备(-)γ-内酰胺的方法，采用具有立体选择性(+)γ-内酰胺酶酶活的微生物菌株，在水相体系中，以(±) γ-内酰胺为底物，进行不对称水解拆分制备(-)γ-内酰胺，步骤如下：

[0013] 微生物菌株：戴尔福特菌（Delftia sp.）CGMCC No.5755；

[0014] 微生物菌株Delftia sp.的发酵培养条件：优化的培养基组成为（g/L）：蔗糖 5－100，蛋白胨 5－50，牛肉膏 5－50，乙酰胺 5－150，MgSO4 0.5－5，NaH2PO4 1－10，Na2HPO4 1－10，pH 4－10；培养温度20－40℃；培养时间1－3天，将发酵液离心获得湿菌体；

[0015] 反应体系的配制：以(±) γ-内酰胺为底物，用pH 4－10、0.01－0.5 M磷酸盐缓冲液水相反应体系，底物浓度为2 g/L－600 g/L；

[0016] 全细胞生物催化反应：在上述的单一水相反应体系中，加入5 g/L－100 g/L湿菌体，反应温度为25－45℃，反应时间为2－24 h，摇床转速为100－300 rpm；

[0017] 转化液的处理和分析：微生物催化反应之后的转化液，离心除去菌体，上清液采用乙酸乙酯萃取，加适量无水硫酸镁干燥后，进行手性HPLC检测；

[0018] 产物的分离提取：采用乙酸乙酯萃取产物，无水硫酸镁干燥，在30－80℃下蒸发浓缩，-20－4℃下冷却结晶，得到高纯度的(-)γ-内酰胺，光学纯度95.0%－99.9%，化学纯度为95%－99%。

[0019] 分析方法：

[0020] (-)γ-内酰胺的对映体过量值(ee)采用手性高效液相色谱法。色谱柱型号为Daicel公司CHIRALPAK AS-H；流动相为异丙醇/乙腈(v/v)=80/20；流速0.5mL/min；检测波长230nm。

[0021] 本发明的有益效果：本发明利用筛选获得的具有高对映选择性的(+)γ-内酰胺酶产生菌株戴尔福特菌Delftia sp. CGMCC No.5755，在水相体系中选择性水解外消旋γ-内酰胺得到(-)γ-内酰胺，在200 g/L底物浓度条件下，产物(-)γ-内酰胺的光学纯度（ee值）达到100%，产物经萃取、蒸发浓缩、冷却结晶得到光学纯的(-)γ-内酰胺，产物光学纯度为95.0%－99.9%，化学纯度为95%－99%。该微生物催化不对称水解制备(-)γ-内酰胺的方法具有高立体选择性、高反应产率、高产物浓度的特点。

[0022] 生物材料样品保藏：一株产高对映选择性(+)γ-内酰胺酶酶活的菌株，其分类命名为戴尔福特菌（Delftia sp.）JNU-GL，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.5755，保藏日期2012年2月14日。

具体实施方式

[0023] 下面对本发明的具体实施方式做一个详细的说明。

[0024] 实施例1：具有内酰胺酶活性的微生物菌株筛选

[0025] 将从本地化工厂附近采集的20多份土样，用无菌水稀释静置后取上清接种于富集培养基，将富集培养后的菌液涂布于平板筛选培养基，30℃培养2－3天，挑取单菌落，进行活性测定。

[0026] 将筛选获得的单菌落接入发酵培养基中，30℃、110 r/min培养48 h。然后将离心获得的湿菌体悬浮于磷酸盐缓冲溶液(0.05 mol/L，pH 7.0)中，湿菌体浓度50 g/L，底物(±) γ-内酰胺浓度为10 g/L，在30℃、180 r/min下反应，在48 h内取样，转化液经离心除去菌体，取上清液采用乙酸乙酯萃取，加适量无水硫酸镁干燥后，进行手性HPLC检测。筛选获得一株微生物菌株JNU-GL，表现出较高的立体选择性和转化率，产物的光学纯度（ee值）大于99.5%。该菌株经鉴定为戴尔福特菌Delftia sp.，现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为CGMCC No.5755。

[0027] 富集培养基（g/L）：酵母提取物0.1，(±) γ-内酰胺2，NH4Cl 2，NaH2PO4 0.1，Na2HPO4 0.1，MgSO4 0.1，调节pH 7.0。

[0028] 平板筛选培养基（g/L）：酵母提取物0.1，N-乙酰-L-苯丙氨酸2，NH4Cl 2，NaH2PO40.1，Na2HPO4 0.1，MgSO4 0.1，琼脂粉20，调节pH 7.0。

[0029] 实施例2：不同碳源对发酵产酶的影响

[0030] 以蛋白胨( 10 %)、酵母膏(5 %)为氮源，按3%浓度分别添加下列碳源：葡萄糖、α-乳糖、菊糖、蔗糖、可溶性淀粉、柠檬酸、柠檬酸三钠、甘油、玉米浆，作为发酵培养基，并用于外消旋γ-内酰胺的水解反应。微生物催化反应之后的转化液，离心分离菌体，取上清以乙酸乙酯萃取，加适量无水硫酸镁干燥后，进行手性HPLC检测。考察不同碳源对菌株Delftia sp. CGMCC 5755发酵产酶和产物光学纯度的影响。

[0031] 由表2可以看出：碳源对菌体的生物量影响不大，对ee有较大影响。采用甘油、蔗糖、可溶性淀粉、α-乳糖的ee值可以达到99.5%以上。

[0032] 表2 碳源对发酵产酶的影响

[0033]

[0034] 实施例3：不同氮源对发酵产酶的影响

[0035] 在以蔗糖为碳源的培养基上，分别以30 g/L的浓度添加酵母浸提物、玉米浆、牛肉浸提物、尿素、蛋白胨、碳酸氢铵、柠檬酸氢二铵、氯化铵、乙酸铵、磷酸氢二铵作为发酵培养基的氮源，对Delftia sp. CGMCC 5755菌株的生物量和产酶情况进行研究。结果见表3，采用单一氮源时与对照(牛肉浸取物3 g/L，蛋白胨10 g/L)相比，ee值均较低。因此菌体发酵产酶选择牛肉浸提物和蛋白胨作为复合氮源。

[0036] 表3 氮源对发酵产酶的影响

[0037]

[0038] “－”表示因生物量太低，未测定ee值和酶活

[0039] 实施例4：复合氮源的筛选

[0040] 使用两种或多种的氮源对Delftia sp. CGMCC 5755菌株的菌体生长和发酵产酶可能更有利。以含有牛肉浸取物和蛋白胨的培养基为对照，向其中添加其他氮源进行复配，保持氮源总量不变，结果见表4，综合生物量、酶活和ee值，最佳复合氮源为乙酰胺。

[0041] 表4 复合氮源对发酵产酶的影响

[0042]

[0043] 实施例5：培养温度对发酵产酶的影响

[0044] 温度是影响细胞生长和发酵产酶的一个重要因素，考察了不同发酵温度对Delftia sp. CGMCC 5755菌株的菌体产量及酶活的影响（底物浓度50 g/L），结果见表5。可以看出温度对生物量和酶活均有一定的影响，当菌体培养温度为32 ℃时，生物量和酶活最高，故以32℃为最适发酵温度。

[0045] 表5 菌体培养温度对菌体生长和产酶的影响

[0046]

[0047] 实施例6：培养基初始pH对发酵产酶的影响

[0048] 细胞生长以及菌体各种酶的活性都会受到培养基的初始pH的调节作用。为考察初始pH对Delftia sp. CGMCC 5755菌株产酶的影响，将发酵培养基调至不同的pH，对培养获得的菌体进行(±) γ-内酰胺的转化，并对酶活进行测定。结果如表6所示，当培养基的初始pH值为7.0时酶活最高。确定菌体生长的最适pH值为7.0。

[0049] 表6 培养基初始pH对菌体生长和产酶的影响

[0050]

[0051] 实施例7：转化时间对水解拆分反应的影响

[0052] 用不同的转化时间进行Delftia sp. CGMCC 5755菌株的γ-内酰胺转化反应，反应温度为35 ℃，摇床转速180 rpm，缓冲液pH 7，底物浓度为200 g/L，湿菌体浓度为150 g/L，微生物催化反应之后的转化液，离心除去菌体，取上清以乙酸乙酯萃取，加适量无水硫酸镁干燥后，进行手性HPLC检测，并计算转化率和ee值。

[0053] 由表7可以看出：菌株Delftia sp. CGMCC 5755反应8 h之后，ee值和转化率趋于稳定，反应基本达到平衡，ee值最高可达99.7%，转化率68.9%。

[0054] 表7 转化时间对转化的影响

[0055]

[0056] 实施例8：温度对水解拆分反应的影响

[0057] Delftia sp. CGMCC 5755湿菌体浓度为50 g/L、底物浓度为50 g/L，在不同的温度、缓冲液pH为7.0、220 rpm转化，转化约10 h。测定转化率和ee值。

[0058] 由表8可知，在25℃至35℃温度范围内，随着温度的升高，ee值和转化率也在增加；产物的光学纯度在35℃达到最高，为99.9%，转化率为56.8%。而当温度继续升高至45℃时，光学纯度和转化率几乎没有变化。

[0059] 表8 不同的温度对转化率和ee值的影响

[0060]

[0061] 实施例9：底物浓度对水解拆分反应初速度的影响

[0062] 在不同不同底物浓度条件下，Delftia sp. CGMCC 5755湿菌体浓度为50 g/L，温度35 ℃，pH为7，180 rpm转化约10 h，微生物催化反应之后的转化液，离心除去菌体，取上清以乙酸乙酯萃取，加适量无水硫酸镁干燥后，进行手性HPLC检测，计算转化率和ee值。

[0063] 由表9可以看出，由此可以看出，当底物浓度<200 g/L时，酶活随着底物浓度的增加而增加，当底物浓度>225 g/L时，随着底物浓度的增加，酶促反应初速度显著下降。

[0064] 表9 底物浓度对水解拆分反应初速度的影响

[0065]

[0066] 实施例10：菌体浓度对水解拆分反应的影响

[0067] 不同Delftia sp. CGMCC 5755菌体浓度，温度35 ℃、缓冲液pH为7.0，摇床转速为180 rpm，底物浓度100 g/L的10 ml反应体系中反应8 h。微生物催化反应之后的转化液，离心除去菌体，取上清以乙酸乙酯萃取，加适量无水硫酸镁干燥后，进行手性HPLC检测。测定转化率和ee值。

[0068] 由表10可以看出，菌体量小于150 g/L时，转化指标随菌体量的增加而快速增长，随后产物的光学纯度基本不再变化。此时，转化率有所上升，说明(-)γ-内酰胺开始被水解。

[0069] 表10 菌体浓度对水解拆分反应的影响

[0070]

[0071] 实施例11：缓冲液pH对水解拆分反应的影响

[0072] 不同pH的缓冲液中，温度35℃、pH7.2、180rpm，Delftia sp. CGMCC 5755湿菌体浓度为50 g/L，底物浓度50 g/L的10ml反应体系中反应8h。微生物催化反应之后的转化液，离心除去菌体，取上清以乙酸乙酯萃取，加适量无水硫酸镁干燥后，进行手性HPLC检测。测定转化率和ee值。

[0073] 由表11可以看出：水解拆分(+)γ-lactam的最适pH为7左右，中性和略偏碱性的条件下催化效果最好。过高或过低pH都对转化不利。当pH<6时，ee值几乎为零，此时酶的立体选择性非常差，酶的活力极低。在pH为8－10范围内，ee值由96.7%急剧下降至11.6%，转化率由52.9%大幅下降至6.2%。这说明酶对强酸和强碱环境非常敏感。

[0074] 表11 缓冲液pH对水解拆分反应的影响

[0075]

[0076] 实施例12：产物的分离提取

[0077] Delftia sp. CGMCC No.5755湿菌体浓度为20 g/L，底物浓度为100 g/L，反应体系为500 ml，在1L的反应釜中进行不对称水解拆分反应。水解拆分反应的温度35 ℃、pH7.0、180 rpm。微生物催化反应之后的转化液，离心除去菌体，以等体积的乙酸乙酯混合