抗嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒DS10株的单克隆抗体转让专利
申请号 : CN201210204906.6
文献号 : CN102719406B
文献日 : 2014-02-05
发明人 : 陆吉虎 , 高峰 , 唐应华 , 杨维维 , 侯继波
申请人 : 江苏省农业科学院
摘要 :
本发明提供抗嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒DS10株的单克隆抗体，属于生物技术领域。本发明提供一种分泌抗嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒DS10株单克隆抗体的杂交瘤细胞株2G4，该杂交瘤细胞株的保藏号为CGMCCNo.6172。本发明提供所述杂交瘤细胞株分泌的抗嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒DS10株单克隆抗体。杂交瘤细胞株2G4能够高效、稳定分泌抗嗜肾型IBVDS10株单克隆抗体，效价高达为1:102000，经鉴定该单克隆抗体可以与嗜肾型IBVDS10株特异性结合，出现单一一条反应带，证明抗嗜肾型IBVDS10株单克隆抗体是嗜肾型IBVDS10株的特异性抗体。
权利要求 :
1.一种分泌抗嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒DS10株单克隆抗体的杂交瘤细胞株2G4，其保藏号为CGMCC No.6172。
2.一种由权利要求1所述杂交瘤细胞株分泌的抗嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒DS10株单克隆抗体。
3.一种用于检测嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求2所述的抗嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒DS10株单克隆抗体。
说明书 :
抗嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒DS10株的单克隆抗体
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及抗体工程技术，具体涉及抗嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒DS10株的单克隆抗体。
背景技术
[0002] 鸡传染性支气管炎（Avian Infectious Bronchitis，IB）是由冠状病毒属的传染性支气管炎病毒（Infectious Bronchitis Virus，IBV）引起的鸡的一种急性、高度接触性传染病，以引起鸡呼吸道感染、肾炎、产蛋下降为主要特征，可引起幼鸡死亡率高达40%，成年鸡感染后产蛋量下降10%-50%，给世界养鸡业带来重大的经济损失。
[0003] 鸡传染性支气管炎病毒（IBV）具有多种血清型和多组织嗜性，自1931年最早报道呼吸型IB以来，随后报道了肾型、肠型、生殖道型、腺胃型等传染性支气管炎，至今已经报道的血清型达30余种，近年来新的血清型和变异株仍不断出现，给流行病学的研究和防疫带来了极大地困难，也给养鸡业造成了严重的经济损失。我国的免疫鸡群和非免疫鸡群均易发生嗜肾型IBV的感染，其中已经报道的有嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒DS10株、HF2株等。
[0004] 嗜肾型鸡传染性支气管炎的控制关键之一在于建立快速诊断的方法，目前国内诊断IB的方法仍然是病毒的分离鉴定、血清学试验和分子生物学诊断方法（RT-PCR）等，但这些方法要么费时费力，要么操作过于繁琐，实验室条件要求高，不适于大量临床样品的诊断，难以推广应用。
发明内容
[0005] 本发明的目的是提供一种能够高效分泌抗嗜肾型IBV DS10株单克隆抗体的杂交瘤细胞株2G4。
[0006] 本发明的另一目的是提供杂交瘤细胞株2G4分泌的抗嗜肾型IBV DS10株单克隆抗体，该单克隆抗体能够特异性的识别嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒DS10株。
[0007] 本发明的再一目的是提供能够快速，简便，准确地检测嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒的试剂盒。
[0008] 本发明提供一种分泌抗嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒 DS10株单克隆抗体的杂交瘤细胞株2G4，该杂交瘤细胞株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院），其保藏号为CGMCC No.6172，保藏日期为：2012年5月28日，分类命名为分泌抗嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒 DS10株单克隆抗体的杂交瘤细胞2G4。
[0009] 本发明提供所述杂交瘤细胞株分泌的抗嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒 DS10株单克隆抗体。
[0010] 本发明还提供一种用于检测嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒的试剂盒，所述试剂盒包括所述抗嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒DS10株单克隆抗体。
[0011] 本发明嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒DS10株（缩写为嗜肾型IBV DS10株）抗原的纯化方式简便可行；杂交瘤细胞株2G4分泌的抗嗜肾型IBV DS10株单克隆抗体特异性强，制备方法简单；杂交瘤细胞株2G4能够高效、稳定分泌抗嗜肾型IBV DS10株单克隆抗体，效价高达为1:102000，经鉴定该单克隆抗体可以与嗜肾型IBV DS10株特异性结合，出现单一一条反应带，证明抗嗜肾型IBV DS10株单克隆抗体是嗜肾型IBV DS10株的特异性抗体。由于该杂交瘤细胞株2G4能够高效的分泌抗嗜肾型IBV DS10株单克隆抗体，使得后续的纯化步骤简单而且高效。本发明提供的抗嗜肾型IBV DS10株单克隆抗体为嗜肾型IBV的临床快速诊断以及嗜肾型IBV疫苗免疫的快速监测提供了保障。采用本发明的抗嗜肾型IBV DS10株单克隆抗体制备的试剂盒能够快速，简便，准确地检测鸡传染性支气管炎病毒。
附图说明
[0012] 图1表示间接ELISA实验检测杂交瘤细胞株2G4分泌的单克隆抗体的特异性结果。图1中，纵坐标为杂交瘤细胞株2G4分泌的单克隆抗体与不同病毒反应后酶标仪检测的OD450值，AIV（H9）为禽流感（H9亚型）病毒，IBDV为鸡传染性法氏囊病毒，EDSV为鸡减蛋综合征病毒，NDV为鸡新城疫病毒，IBV（DS10）为嗜肾型IBV DS10株病毒，阴性为阴性SPF尿囊液，PBS为PBS缓冲液对照。
具体实施方式
[0013] 实施例一 嗜肾型IBV DS10株的繁殖、纯化
[0014] 1、嗜肾型IBV DS10株
[0015] 嗜肾型IBV DS10株，2010年6月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏号为：CGMCC No.3957。
[0016] 2、嗜肾型IBV DS10株的繁殖
[0017] 取-70℃冻存的嗜肾型IBV DS10标准毒种于4℃融化，然后用PBS缓冲液按1:100倍稀释病毒，接种于11日龄SPF鸡胚（购自北京梅里亚维通实验动物科技有限公司种蛋，本实验室孵化）尿囊腔内，接种量为0.1 mL /胚。将接种后的SPF鸡胚置37℃培养。弃去24小时内死亡的胚。培养35小时后，收获死胚及未死胚，并将其放入4℃冰箱冷冻至全部胚死亡后，收集死胚尿囊液（含嗜肾型IBV DS10），检验无菌后分装冻存于-70℃冰箱备用。
[0018] 3、嗜肾型IBV DS10株抗原的纯化
[0019] （1）取-70℃冻存的含嗜肾型IBV DS10的尿囊液（本实施例中的标题2中方法制备所得）于4℃融化后，在4700×g、4℃条件下离心20 min, 取上清液；（2）将步骤（1）中获得的上清液以14000×g、4℃条件离心15 min，取上清液；（3）将步骤（2）获得的上清液在54000×g、4℃条件下离心1.5 h, 弃上清，在沉淀中加入适量TEN 缓冲液，并用无菌滴管吹打沉淀使其分散、溶解，所得纯化病毒溶液，添加β-丙内酯（终浓度0.5‰）4℃灭活24 h后作为嗜肾型IBV DS10株灭活纯化抗原（简称灭活纯化抗原），-70℃保存备用。
[0020] 实施例二 杂交瘤细胞株的建立
[0021] 1、小鼠免疫
[0022] 用嗜肾型IBV DS10株的灭活纯化抗原免疫6周龄的雌性BALB/c小鼠（购自扬州大学实验动物中心），共免疫4次。首次免疫，用灭活纯化抗原加等体积弗氏完全佐剂（购自Sigma公司）的乳化液，免疫剂量为200 μL/只；第二、三次免疫，均用灭活纯化抗原加等体积的弗氏不完全佐剂（购自Sigma公司）的乳化液，免疫剂量为100 μL/只（第一、二、三次免疫之间间隔14天）；第三次免疫后7天，尾静脉采血分离血清，用微量血凝抑制（HI）实验（钱晓佳等. 鸡传染性支气管炎病毒(M41)HI抗原的制备与初步应用[J]. 安徽农业科学，2007，35(30)：9545-9546，954.）检测血清抗体水平，选取血清抗体效价最高的小鼠采用灭活纯化抗原从尾静脉注射加强免疫（即第4次免疫），免疫剂量为50 μL/只。获得嗜肾型IBV DS10灭活纯化抗原对BALB/c小鼠三免后的血清HI效价达到1:256，该血清分装后-20℃保存，作为阳性参考血清备用。
[0023] 2、饲养细胞的制备
[0024] 进行细胞融合前24h，将一只约8周龄未免疫的BALB/c小鼠摘眼球采血分离血清，该血清作为阴性参考血清备用；将处死后的小鼠置于75%酒精浸泡10 min。之后转入超净工作台，使小鼠仰卧固定于消毒好的解剖板上，用无菌镊子在其上腹部的位置提起腹部皮肤并用无菌眼科剪将其剪开，钝性剥离暴露小鼠腹膜，用无菌玻璃注射器吸取10 mL含20%小牛血清的HAT培养液（Sigma公司，H0262）注入到小鼠腹腔内后，右手持注射器不动，左手用无菌镊子夹酒精棉球轻轻地按摩小鼠腹部两侧，然后右手注射器反复吸吹直至吸入注射器的含20%小牛血清的HAT培养液泛黄为止。把吸出的培养液注入无菌平皿中，置于显微5
镜下进行细胞计数，调整培养液体积使细胞密度约为10 个/mL。然后用移液器将细胞浓度
5
为10 个/mL的培养液加到5块96孔细胞培养板中，每孔100 μL，置于37℃，5% CO2的培养箱中，作为饲养细胞备用。
镜下进行细胞计数，调整培养液体积使细胞密度约为10 个/mL。然后用移液器将细胞浓度
5
为10 个/mL的培养液加到5块96孔细胞培养板中，每孔100 μL，置于37℃，5% CO2的培养箱中，作为饲养细胞备用。
[0025] 3、细胞融合
[0026] 细胞融合按照常规方法（刘秀梵，单克隆抗体在农业上的应用（第一版）[M]. 合肥：安徽科技技术出版社，1994: 18-30.）进行。取本实施例步骤1中进行第4次免疫三天后的BALB/c小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞（ATCC，北京中原合聚经贸有限公司）按5:1的比例混匀于50 mL刻度离心管，用20-30 mL的DMEM基础培养基（购自Sigma公司）洗涤2次，然后在1000 rpm、10 min条件下离心，弃上清，用手掌轻击管底，使沉淀细胞松散均匀；将此融合管移入37℃水浴中预热并轻轻旋转，在60 s内将1 mL预热至37℃的50% PEG-4000（购自南京生兴生物科技公司）沿管壁滴加到融合管中的沉淀细胞上；在5 min内将25 mL预热至37℃的DMEM基础培养基沿管壁滴加到融合管中，具体方法：第1 min加1 mL，第2 min加4 mL，第3-5 min加20 mL，边加边轻轻转动离心管；然后将融合管在37℃静置10 min，在1000 rpm下离心5 min，弃上清，加入50 mL含HAT（Sigma公司，H0262）的DMEM培养基重悬细胞；按每孔0.1mL加入已经培养有饲养细胞（见实施例二步骤2）的96孔培养板中，置37℃、5%的CO2培养箱中培养。5天后观察细胞生长状况，并用新鲜的含HAT的DMEM培养基换出培养板孔中1/2培养基；10天后，用含HT（Sigma公司，H0137）的DMEM培养基换出原含HAT的培养基；观察融合细胞生长情况，待其分布至孔底面积1/5以上时，吸出细胞培养上清液进行抗体检测。
[0027] 4、杂交瘤细胞的筛选
[0028] 通过检测各融合细胞培养上清液中的抗体来筛选杂交瘤细胞。当检测孔为阳性时，说明该孔的杂交瘤细胞分泌抗嗜肾型IBV DS10株单克隆抗体。
[0029] 采用如下方法检测融合细胞培养上清液中的抗体（间接ELISA检测）：取灭活纯化抗原用碳酸盐缓冲液以体积比1:200稀释，在96孔细胞板中每孔加入100 μL稀释后的灭活纯化抗原，4℃包被过夜；弃去液体，用PBST缓冲液（含0.5% Tween-20的PBS缓冲液）洗涤三次，5 min/次，最后用吸水纸拍干；用1% BSA-PBST（含1%牛血清白蛋白（BSA）（购自Sigma公司）的PBST缓冲液），100 μL /孔，37℃封闭1 h；再用PBST缓冲液洗涤3次，5 min/次，最后一次拍干；将细胞培养上清液（本实施例步骤3获得）、用0.5% BSA-PBST（含有质量浓度为0.5% BSA的PBST缓冲液）1:100倍稀释的阴性参考血清（实施例二步骤2制备）和阳性参考血清（实施例二步骤1制备）加入相应孔内（第一排第一列的孔加入PBS缓冲液作为空白对照），100 μL/孔，37℃作用1.5 h后，弃去液体用PBST缓冲液洗涤3次，5 min/次，最后一次拍干；加入用0.5% BSA-PBST按1:3500稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG（购自北京金杉生物科技有限公司），100 μL/孔，37℃作用1 h后，弃去液体，用PBST缓冲液洗涤3次，5 min/次，最后一次拍干；加入底物显色液（Biosharp公司，TMB-S-002），100 μL/孔，37℃避光显色10 min后加入终止液（2 mol/L 的H2SO4）终止反应；酶标仪测定OD450值。以空白对照调零，P为各孔的OD450值，N为加入阴性参考血清的孔的OD450值。当N≤0.1，加入阳性参考血清的孔的OD450值与加入阴性参考血清的孔的OD450值的比值（P/N）≥2.1，即阴、阳性对照成立的情况下，P/N≥2.1的检测孔判为阳性，1.5≤P/N＜2.1的检测孔判为可疑，P/N＜1.5的检测孔判为阴性。
[0030] 5、杂交瘤细胞的亚克隆
[0031] 将步骤4筛选所获得的分泌特异性单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，及时采用有限稀释法（刘秀梵，单克隆抗体在农业上的应用（第一版） [M]. 合肥：安徽科学技术出版社，1994：35-36）进行亚克隆。挑选阳性孔，采用有限稀释法连续进行2-3次的亚克隆。首先对杂交瘤细胞阳性孔中的活细胞进行染色计数，用DMEM完全培养基稀释成约10个细胞/mL，将稀释好的细胞悬液加入到96孔细胞培养板，每孔100 μL，37℃、5% CO2培养箱中培养
4-5天后，用倒置显微镜观察，标出所有单个克隆生长孔，培养至8-9天时取细胞上清做间接ELISA检测（实施例二步骤4方法）；选择阳性的单克隆细胞进行3次以上同样的亚克隆，直到亚克隆后所有细胞孔上清检测均为阳性，且各孔检测的OD值比较接近，将多次亚克隆后的阳性孔细胞株扩大培养后冻存。获得能稳定分泌抗嗜肾型IBV DS10株单克隆抗体的杂交瘤细胞株2G4。
4-5天后，用倒置显微镜观察，标出所有单个克隆生长孔，培养至8-9天时取细胞上清做间接ELISA检测（实施例二步骤4方法）；选择阳性的单克隆细胞进行3次以上同样的亚克隆，直到亚克隆后所有细胞孔上清检测均为阳性，且各孔检测的OD值比较接近，将多次亚克隆后的阳性孔细胞株扩大培养后冻存。获得能稳定分泌抗嗜肾型IBV DS10株单克隆抗体的杂交瘤细胞株2G4。
[0032] 实施例三 抗嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒DS10株单克隆抗体的制备[0033] 取7~8周龄健康BALB/c母鼠（购自扬州大学实验动物中心），腹腔注射液体石蜡（0.5 ml/只）一周后，将杂交瘤细胞株2G4以PBS缓冲液稀释后注入小鼠腹腔，每只小鼠注6
射0.2 mL ，约含1～2×10 个杂交瘤细胞。7-10天后当小鼠腹部明显膨大时采集腹水。
将采集的腹水在4000 rpm条件下离心5分钟，弃去油脂与沉淀后，所得上清液即为初步纯化的腹水。将初步纯化的腹水小量分装，于-70℃保存备用。
射0.2 mL ，约含1～2×10 个杂交瘤细胞。7-10天后当小鼠腹部明显膨大时采集腹水。
将采集的腹水在4000 rpm条件下离心5分钟，弃去油脂与沉淀后，所得上清液即为初步纯化的腹水。将初步纯化的腹水小量分装，于-70℃保存备用。
[0034] 实施例四 抗嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒DS10株单克隆抗体腹水效价的测定及亚类鉴定
[0035] 将初步纯化的腹水用PBS缓冲液以2倍倍比稀释，将各浓度的腹水加入到封闭好的包被有灭活纯化抗原（用碳酸盐缓冲液以1:200稀释）的96孔酶标板孔中（第一排第一列的孔加入PBS缓冲液作为空白对照），100 μL/孔，37℃，孵育90 min；用PBST缓冲液洗涤3次，5 min/次，最后一次拍干；加入1:3500稀释HRP标记的羊抗鼠IgG（购自北京金杉生物科技有限公司），100 μL/孔，37℃作用1 h，PBST洗涤3次，5 min/次，最后一次拍干；加入底物显色液（Biosharp公司，TMB-S-002），100 μL/孔，37℃避光显色10 min后加入终止液（2 mol/L H2SO4）终止反应；经酶标仪测定OD450nm值。以空白对照调零，P为各检测孔的值，N为加入阴性参考血清的孔的OD450值。当N≤0.1，加入阳性参考血清的孔的OD450值与N的比值（P/N）≥2.1，即阴、阳性对照成立的情况下，P/N≥2.1的检测孔判为阳性，以阳性孔的最大稀释度作为单克隆抗体的腹水效价。结果显示杂交瘤细胞株2G4分泌的抗嗜肾型IBV DS10株单克隆抗体腹水间接ELISA效价为1:102000。
[0036] 采用鼠单克隆抗体亚类鉴定试剂盒（Sigma公司，ISO2-1KT）对抗嗜肾型IBV DS10株单克隆抗体进行亚类鉴定，实验步骤按照试剂盒操作说明进行，结果表明：杂交瘤细胞株2G4分泌的抗嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒DS10株单克隆抗体属于IgG1亚类。
[0037] 实施例五 抗嗜肾型IBV DS10株单克隆抗体与嗜肾型IBV DS10株的反应原性与特异性鉴定
[0038] 用Western-blotting（J.萨姆布鲁克，D.W.拉赛尔. 分子克隆实验指南[M]. 第三版. 北京:科学出版社，1998，884-895.）鉴定杂交瘤细胞株2G4分泌的抗嗜肾型IBV DS10株单克隆抗体的反应原性与特异性。嗜肾型IBV DS10株尿囊液、阴性尿囊液（无菌采集自4℃致死的12日龄SPF鸡胚）经5％浓缩胶和10％分离胶中进行SDS-PAGE电泳分离2
后，以2 mA/cm，90 min，转移至PVDF膜上，用10% BSA（购自Sigma公司）溶液4℃封闭2 h；用PBST缓冲液洗膜3次，5 min/次；以抗嗜肾型IBV DS10株单克隆抗体为一抗， 以1：
2500稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG（购自北京金杉生物科技有限公司）为二抗；用增强型DAB显色试剂盒（购自武汉博士德生物工程有限公司）显色。结果显示，该单克隆抗体可以与嗜肾型IBV DS10株特异性结合，在14 KDa左右处有单一一条反应条带，而不与阴性尿囊液反应，证明该抗嗜肾型IBV DS10株单克隆抗体是嗜肾型IBV DS10株的特异性抗体。
后，以2 mA/cm，90 min，转移至PVDF膜上，用10% BSA（购自Sigma公司）溶液4℃封闭2 h；用PBST缓冲液洗膜3次，5 min/次；以抗嗜肾型IBV DS10株单克隆抗体为一抗， 以1：
2500稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG（购自北京金杉生物科技有限公司）为二抗；用增强型DAB显色试剂盒（购自武汉博士德生物工程有限公司）显色。结果显示，该单克隆抗体可以与嗜肾型IBV DS10株特异性结合，在14 KDa左右处有单一一条反应条带，而不与阴性尿囊液反应，证明该抗嗜肾型IBV DS10株单克隆抗体是嗜肾型IBV DS10株的特异性抗体。
[0039] 用碳酸盐缓冲液将含禽流感病毒(Avian Influenza Virus，AIV)H9亚型、鸡传染性法氏囊病毒（Infectious Bursal Disease Virus，IBDV）、鸡减蛋综合征病毒（Egg Drop Syndrome Virus，EDSV）、鸡新城疫病毒（New Castle Disease Virus，NDV）、嗜肾型IBV DS10株的SPF鸡胚尿囊液、阴性尿囊液1:200稀释后按实施例二步骤4的方法包被96孔酶标板，以杂交瘤细胞株2G4分泌的抗嗜肾型IBV DS10株单克隆抗体为一抗，同时设PBS缓冲液阴性对照进行间接ELISA实验（参见实施例二步骤4方法）。结果显示杂交瘤细胞株2G4分泌的抗嗜肾型IBV DS10株单克隆抗体仅与嗜肾型IBV DS10株尿囊液毒成强阳性反应，与阴性对照和其它鸡病毒尿囊液均为阴性反应（见图1），表明本发明获得的杂交瘤细胞株2G4分泌的抗嗜肾型IBV DS10株单克隆抗体具有很好的特异性。
[0040] 其中禽流感病毒(Avian Influenza Virus，AIV)H9亚型购自南京天邦生物科技有限公司，鸡传染性法氏囊病毒（Infectious Bursal Disease Virus，IBDV）、鸡减蛋综合征病毒（Egg Drop Syndrome Virus，EDSV）和鸡新城疫病毒（New Castle Disease Virus，NDV）购自中国兽医药品监察所。
[0041] 注：本发明中各实施例用到的试剂如下：
[0042] （1）PBS缓冲液： 氯化钠（NaCl）8.0 g，氯化钾（KCl ）0.2 g，磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）2.9 g，磷酸二氢钾（KH2PO4）0.2 g，加去离子水溶解后定容至1,000 mL，用1 M 氢氧化钠（NaOH）调pH值为7.4，121℃灭菌15 min，4℃保存。
[0043] （2）PBST缓冲液：含质量浓度为0.5% Tween-20的PBS缓冲液。
[0044] （3）碳酸盐缓冲液：含有0.05 mol/L Na2CO3和0.05 mol/L NaHCO3的水溶液，pH值为9.6。
[0045] （4）1% BSA-PBST：含质量浓度为1%牛血清白蛋白（BSA）的PBST缓冲液。
[0046] （5）0.5% BSA-PBST：含质量浓度为0.5% 牛血清白蛋白（BSA）的PBST缓冲液。
[0047] （6）TEN 缓冲液：50 mmol/L的Tris-HCL缓冲液中含有50 mmol/L的NaCl、5 mmol/L的Na2EDTA，pH7.4。