一种防治松墨天牛的胞外全蛋白提取液的制备方法

摘要

一种防治松墨天牛的胞外全蛋白提取液的制备方法，属于林业害虫生物防治技术领域。其特征在于具体包括以下步骤：1）将球孢白僵菌菌株接种培养得发酵液；2）发酵液分离，收集上清液，除去菌丝，滤液为胞外全蛋白粗提液；3）胞外全蛋白粗提液，加入乙二胺四乙酸，并在冰浴条件下加入硫酸铵粉末，搅拌溶解后静置过夜，沉淀用磷酸缓冲液溶解，即得胞外全蛋白粗提浓缩液；4）胞外全蛋白粗提透析，浓缩液分离，上清液过滤除菌，即为胞外全蛋白提取液。上述一种防治松墨天牛的胞外全蛋白提取液的制备方法，制得的胞外全蛋白提取液具有强烈的杀虫活性，能防治松墨天牛，使用安全高效，无污染，防治效果较好，是良好的生物防治药剂。

权利要求

1.一种防治松墨天牛的胞外全蛋白提取液的制备方法，其特征在于具体包括以下步骤：

1）将球孢白僵菌菌株接种在PPDA培养基上，于23-24℃培养箱中培养15-16d后，刮下分生孢子，用无菌水稀释成1×108个·mL- 1的孢子悬浮液，按孢子悬浮液:发酵培养基体积比为0.5-1.5:100的比例接种于发酵培养基上,再将其置于23-24℃、140-150rpm的恒温振荡培养箱里培养6-7d，备用；

2）取步骤1）发酵液，3-5℃、3500-4500rpm离心10-15min，收集上清液，用3层滤纸真空抽滤，除去发酵液中悬浮的菌丝，收集的滤液得胞外全蛋白粗提液，备用；

3）取步骤2）胞外全蛋白粗提液，每100mL中加入10pL乙二胺四乙酸，并在冰浴条件下加入硫酸铵粉末至其饱和度达85-95％；同时用磁力搅拌器不断搅拌以加速硫酸铵的溶解，控制加入速度使不起泡沫；最后，3-5℃下静置过夜，而后将该粗提液3-5℃、9500-10000rpm离- 1心10-15min, 弃上清液，将沉淀用其重量4-5%的0.04mol·L ，pH =6.6的磷酸缓冲液溶解，即得胞外全蛋白粗提浓缩液，备用；

4）取步骤3）胞外全蛋白粗提浓缩液装入透析袋中，4.5-5℃下透析17-18h，透析液为稀释3.5-4.5倍的0.04mol·L- 1，pH =6.6的磷酸缓冲液，透析后的浓缩液，经3-5℃、5000-

6000rpm离心10-15min，弃沉淀，收集上清液，并经0.21-0.26μm细菌过滤器过滤除菌，最终所得滤液即为胞外全蛋白提取液。

2.如权利要求1所述的一种防治松墨天牛的胞外全蛋白提取液的制备方法，其特征在于：步骤2）中离心转速为3800-4000rpm，离心时间为12-13min。

3.如权利要求1所述的一种防治松墨天牛的胞外全蛋白提取液的制备方法，其特征在于：步骤3）中离心转速为9700-9900rpm，离心时间为12-13min。

说明书

一种防治松墨天牛的胞外全蛋白提取液的制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于林业害虫生物防治技术领域，具体为一种防治松墨天牛的胞外全蛋白提取液的制备方法。

背景技术

[0002] 松墨天牛及其传播的松材线虫病对我国松林造成了非常严重的危害，防治松墨天牛和持续控制松材线虫是林业工作者当前急需解决的一大难题。目前防治松墨天牛的方法主要有以下三种：化学防治、利用引诱剂防治天牛成虫与生物防治。化学防治存在较大的负面影响。生物防治是一种环境友好型的植保技术，寻找可传染并降低害虫种群数量的病原微生物等生态控制因子显得尤为重要。

[0003] 关于松墨天牛的防治研究，国内外做了大量的工作，归纳起来有以下几条防治途径。（1）化学防治：飞机空中施药(成片林分面积在3万hm2以上适用)和地面机械喷药方式杀灭松墨天牛。日本于70年代始采用杀螟松（MEP）、倍硫磷（MPP）、西维因（NAC）等飞机喷洒，一天内可杀死80％天牛成虫。江苏采用3％杀螟松连续几年喷洒，但效果不明显。近些年来我国研究开发了长效缓剂型，先后有21％灭杀毙微胶囊，30％敌一马微胶囊，DFM－21（溴氰菊酯一倍硫磷）与FFM－20（氰戊菊酯一倍硫磷）微胶囊等。南京林业大学曾开发出触雷式微胶囊剂型，经小面积和飞防试验效果较好。(2)利用引诱剂防治天牛成虫：日本已开发天牛引诱剂商品以及不育剂商品，效果较好。广东省和浙江省也开展了研究，并开发出自产的引诱剂，效果比日产的好,目前已在生产上使用。(3)生物防治：日本与我国采用球孢白僵菌和管氏肿腿蜂防治天牛幼虫，取得了较好的成果。

[0004] 自然界中，松墨天牛往往还受到病原微生物的侵染而得病死亡。松墨天牛的天敌微生物资源比较丰富，主要有真菌、细菌和寄生性线虫，其中最重要的是真菌类。利用微生物防治害虫具有以下独特的优点：(1)害虫不易产生抗药性，由于微生物杀虫是多种因素和成分发挥作用，同时在与害虫长期共同生活的过程中适应了昆虫的防卫体系，昆虫对病原微生物的免疫力长期保持低水平；(2)具有良好的环境安全性，对寄主有较强的选择性，不杀害天敌和有益生物，一般对脊椎动物无害，有利于保护天敌，保持生态平衡；(3)昆虫是各类病原体理想的培养基，病原体在昆虫体内增殖，可通过病虫或虫尸扩散传播，在时间和空间上具有扩散蔓延能力，通过再侵染，形成不同程度的流行病，便于引种定殖，达到持续控制害虫的效果；(4)易于通过基因工程改造获得致病力强的品系。因此，利用微生物控制松墨天牛越来越受到人们的关注和重视。

发明内容

[0005] 针对现有技术中存在的上述问题，本发明的目的在于设计提供一种防治松墨天牛的胞外全蛋白提取液的制备方法的技术方案，其生产成本低，杀虫和驱虫效果好，且对环境影响小，对人体安全可靠。

[0006] 所述的一种防治松墨天牛的胞外全蛋白提取液的制备方法，其特征在于具体包括以下步骤：

[0007] 1）将球孢白僵菌菌株接种在PPDA培养基上，于22-25℃培养箱中培养14-18d后，刮下分生孢子，用无菌水稀释成0.8-1.2×108个·mL- 1 的孢子悬浮液，按孢子悬浮液:发酵培养基体积比为0.5-1.5:100的比例接种于发酵培养基上,再将其置于23-26℃、120-150rpm的恒温振荡培养箱里培养5.5-8d，备用；

[0008] 2）取步骤1）发酵液，3-5℃、3500-4500rpm离心10-15min，收集上清液，用3层滤纸真空抽滤，除去发酵液中悬浮的菌丝，收集的滤液得胞外全蛋白粗提液，备用；

[0009] 3）取步骤2）胞外全蛋白粗提液，每100mL中加入10pL乙二胺四乙酸，并在冰浴条件下加入硫酸铵粉末至其饱和度达85-95％；同时用磁力搅拌器不断搅拌以加速硫酸铵的溶解，控制加入速度使不起泡沫；最后，3-5℃下静置过夜，而后将该粗提液3-5℃、9500-10000rpm离心10-15min, 弃上清液，将沉淀用其重量4-5%的0.04mol·L- 1，pH =6.6的磷酸缓冲液溶解，即得胞外全蛋白粗提浓缩液，备用；

[0010] 4）取步骤3）胞外全蛋白粗提浓缩液装入透析袋中，3-5℃下透析15-18h，透析液为稀释3.5-4.5倍的0.04mol·L- 1，pH =6.6的磷酸缓冲液，透析后的浓缩液，经3-5℃、5000-6000rpm离心10-15min，弃沉淀，收集上清液，并经0.21-0.26μm细菌过滤器过滤除菌，最终所得滤液即为胞外全蛋白提取液。

[0011] 所述的一种防治松墨天牛的胞外全蛋白提取液的制备方法，其特征在于：步骤1）中培养箱中的培养温度为23-24℃，培养时间为15-16d，孢子悬浮液的浓度为1×108个·mL- 1，恒温振荡培养箱的培养温度为24-25℃，转速为130-140rpm，培养时间6-7d。

[0012] 所述的一种防治松墨天牛的胞外全蛋白提取液的制备方法，其特征在于：步骤2）中离心转速为3800-4000rpm，离心时间为12-13min。

[0013] 所述的一种防治松墨天牛的胞外全蛋白提取液的制备方法，其特征在于：步骤3）中离心转速为9700-9900rpm，离心时间为12-13min，

[0014] 所述的一种防治松墨天牛的胞外全蛋白提取液的制备方法，其特征在于：步骤4）中透析温度为4-4.5℃，透析时间为16-17h，离心转速5500-5800rpm，离心时间12-13min。

[0015] 上述PPDA培养基可以从市场上直接购得。

[0016] 上述一种防治松墨天牛的胞外全蛋白提取液的制备方法，以硫酸铵沉淀法提取了球孢白僵菌中对松墨天牛具有高毒力的胞外全蛋白提取液，具有强烈的杀虫活性，能防治松墨天牛，保护松林免受破坏，解决了目前松墨天牛传播松材线虫的防治难题，该药剂即使长期使用也不会使害虫产生抗药性。其在环境中能自动降解，使用安全高效，不会对环境造成污染，防治效果较好，是良好的生物防治药剂。

[0017] 本申请文件中涉及的百分含量除另有说明外，其它的均为纯物质的重量百分含量。

具体实施方式

[0018] 现结合本发明的药效试验，进一步说明本发明的有益效果。

[0019] 该防治松墨天牛的胞外全蛋白提取液的制备方法，包括以下步骤：

[0020] 1）将球孢白僵菌菌株接种在PPDA培养基上，于23℃培养箱中培养16d后，刮下分生孢子，用无菌水稀释成1.0×108个·mL- 1 的孢子悬浮液，按孢子悬浮液:发酵培养基体积比为1:100接种于发酵培养基上,再将其置于25℃、130rpm的恒温振荡培养箱里培养7d，备用；

[0021] 2）取步骤1）发酵液，4℃、4000rpm离心13min，收集上清液，用3层滤纸真空抽滤，除去发酵液中悬浮的菌丝，收集的滤液得胞外全蛋白粗提液，备用；

[0022] 3）取步骤2）胞外全蛋白粗提液，每100mL中加入10pL乙二胺四乙酸，并在冰浴条件下加入硫酸铵粉末至其饱和度达90％，同时用磁力搅拌器不断搅拌以加速硫酸铵的溶解，控制加入速度使不起泡沫；最后，4℃下静置过夜，而后将该粗提液4℃、9500rpm离心13min, - 1弃上清液，将沉淀用其重量4%的0.04mol·L ，pH =6.6的磷酸缓冲液溶解，即得胞外全蛋白粗提浓缩液，备用；

[0023] 4）取步骤3）胞外全蛋白粗提浓缩液装入透析袋中，4℃下透析16h，透析液为稀释4倍的0.04mol·L- 1，pH =6.6的磷酸缓冲液，透析后的浓缩液，经4℃、5500rpm离心13min，弃沉淀，收集上清液，并经0.24μm细菌过滤器过滤除菌，最终所得滤液即为胞外全蛋白提取液。

[0024] 上述步骤1）中培养箱中的培养温度为22℃或25℃，培养时间为14 d或18d，孢子悬浮液的浓度为1×108个·mL- 1，恒温振荡培养箱的培养温度为23℃或26℃，转速为120或150rpm，培养时间5.5或8d；步骤2）中离心转速为3500或4500rpm，离心时间为10或15min；胞外全蛋白粗提液在冰浴条件下加入硫酸铵粉末至其饱和度达85或95％；步骤3）中离心转速为9500或10000rpm，离心时间为10或15min；步骤4）中透析温度为3或5℃，透析时间为15或
18h，离心转速5000或6000rpm，离心时间10或15min；其它同上，也能取得本发明所述的技术效果。

[0025] 试验一：

[0026] 将10µL样品通过100µL注射器从4龄松墨天牛腹部第四腹节处注入其血腔，然后将天牛单头单瓶饲养，设空白对照组，。每天定时观察记录松墨天牛幼虫死亡与症状情况。胞外全蛋白提取液，如从菌株B1得到的胞外全蛋白提取液即记为“B1”。采用血腔注射法测定14个菌株的全蛋白提取液对松墨天牛4龄幼虫的毒力，计算处理后的校正死亡率，结果见表
1。根据每天的校正死亡率计算LT50，结果见表2。

[0027]

[0028]

[0029] 表一、表二数据表明，来自于14个不同菌株的全蛋白提取液对松墨天牛4龄幼虫的毒力差异较大，在0.01极显著差异性水平上，样品被分成A→F 5个等级，而在0.05显著差异性水平上，样品被分成9个等级。证实多种菌株的全蛋白提取液对松墨天牛的毒力较强，具有较高的防效。