重组灵芝免疫调节蛋白单甲氧基聚乙二醇丙酸琥珀酰亚胺酯修饰物、制备方法和用途

摘要

重组灵芝免疫调节蛋白单甲氧基聚乙二醇丙酸琥珀酰亚胺酯修饰物、制备方法和用途。重组灵芝免疫调节蛋白和单甲氧基聚乙二醇丙酸琥珀酰亚胺酯修饰物；该修饰物制备方法：在0.1M pH 5.0-pH 8.0磷酸盐缓冲液的反应体系中将rLZ-8二聚体与mPEG-SPA以摩尔比为1∶1-1∶6进行投料，室温下磁力搅拌，避光条件下反应1.0-2.5小时，经纯化得到纯度达到98％的修饰产物；该修饰物在制备治疗化疗药所致白细胞减少症的药物中的应用。本发明效果在于制备方法步骤简单，产物单一；该修饰物其体内半衰期较修饰前rLZ-8出现显著延长(见图2)；在治疗白细胞减少症研究中的最低给药剂量和起效时间均优于修饰前rLZ-8。

权利要求

1.重组灵芝免疫调节蛋白rLZ-8的单甲氧基聚乙二醇丙酸琥珀酰亚胺酯修饰物，其特征在于单甲氧基聚乙二醇丙酸琥珀酰亚胺酯单一修饰于重组灵芝免疫调节蛋白rLZ-8二聚体的N末端，修饰物分子中重组灵芝免疫调节蛋白rLZ-8二聚体分子和单甲氧基聚乙二醇丙酸琥珀酰亚胺酯分子比为1：1，其中单甲氧基聚乙二醇丙酸琥珀酰亚胺酯的结构式如图所示：结构式中n值分别为7、109、223、450；对应的单甲氧基聚乙二醇丙酸琥珀酰亚胺酯分别为500Da、5000Da、10000Da和20000Da。

2.如权利要求1所述的重组灵芝免疫调节蛋白rLZ-8的单甲氧基聚乙二醇丙酸琥珀酰亚胺酯修饰物的制备方法，其特征在于按以下步骤进行：A.在0.1MpH5.0-pH8.0磷酸盐缓冲液的反应体系中将rLZ-8二聚体与单甲氧基聚乙二醇丙酸琥珀酰亚胺酯以分子比为1：1-1：6进行投料，置于西林瓶中，在锡纸包裹避光，室温下磁力搅拌反应1-2.5小时；

B.以SDS-PAGE电泳将反应后的产物进行鉴定，对胶体进行碘化钡染色，目的是观察单甲氧基聚乙二醇丙酸琥珀酰亚胺酯组分；

TM

C.将样品进行纯化回收，以Superdex 75prep grade色谱手段对产物进行纯化，以含有0.15MNaCl的0.05M磷酸盐为流动相，pH值为7.0，流速1mL／min，等浓度洗脱，检测波长280nm、254nm、215nm，固定体积收集及峰收集相结合的方式收集样品；

D.将纯化回收的样品进行SDS-PAGE电泳进行分析，对胶体进行碘化钡染色，经过质谱检测分析，表明PEG只修饰在蛋白rLZ-8N-末端，并未与其他的位点结合，因此进一步说明，通过本方法得到的rLZ-8的蛋白单甲氧基聚乙二醇丙酸琥珀酰亚胺酯修饰产物，为单一的修饰产物，经纯化得到纯度达到98％的修饰产物。

3.如权利要求1所述的重组灵芝免疫调节蛋白rLZ-8的单甲氧基聚乙二醇丙酸琥珀酰亚胺酯修饰物在制备治疗化疗药所致白细胞减少症的药物中的应用。

说明书

重组灵芝免疫调节蛋白单甲氧基聚乙二醇丙酸琥珀酰亚胺

酯修饰物、制备方法和用途

技术领域

[0001] 本发明涉及蛋白质单甲氧基聚乙二醇丙酸琥珀酰亚胺酯修饰，尤其涉及重组灵芝免疫调节蛋白rLZ-8的单甲氧基聚乙二醇丙酸琥珀酰亚胺酯修饰物及其制备方法。 背景技术

[0002] 重组灵芝免疫调节蛋白(rLZ-8)源自于松杉灵芝的菌丝体，其结构特征如下：包括一个N-端的形成二聚体所需的重要结构域和一个C端的FNIII结构域，rLZ-8的N-端结构域由一个α-helix和一个β-strand组成，rLZ-8单体上的N端α-helix和β-strand与另一单体上相同的结构域通过空间交换形成了重要的二聚体结合结构域，呈哑铃状。已有文献报道rLZ-8具有免疫调节和杀伤肿瘤细胞的生物学活性，但由于二聚体分子量不足26kDa，体内清除率高，半衰期短，药代动力学参数难以满足其新药开发的要求，只有通过化学修饰等技术手段延长rLZ-8在体内的作用时间，为其在临床治疗中的应用奠定坚实的基础。

[0003] 目前通常采用单甲氧基聚乙二醇(methoxypolyethyleneglycol，mPEG)作为修饰剂的合成原料，化学通式为：CH3O(CH2CH2O)nCH2CH2OH，其一端以惰性基团甲氧基封闭，可有效避免修饰过程中发生交联或团聚。第一代PEG衍生物PEG-二硫醚(PEG-SS)骨架含有一个酯基，体内易水解，而且其在蛋白质上留下的琥珀酸酯片段具有免疫原性。第二代PEG衍生物mPEG-丙酸琥珀酰亚胺酯(mPEG-SPA)和PEG-丁酸琥珀酰亚胺酯(PEG-SBA)，骨架上没有酯键，能够和蛋白质或多肽形成稳定的连接键，现已得到广泛应用。但由于修饰反应是一个不定向的反应，mPEG-SPA会与蛋白链上的不同位置的相同基团相结合，必将产生大量的同分异构体和副产物。蛋白质药物经mPEG修饰后虽然可延长体内半衰期，但反应产物中既存在单点修饰产物，又存在多点修饰产物的特点，已成为困扰相关新药质量研究的主要技术瓶颈。

[0004] 往往为得到特定的、单一的修饰物会在修饰反应前期对蛋白结构进行处理，把蛋白链上的可能会参与修饰的基团进行置换或保护，修饰反应后再把这些基团置换回米或去保护，大大增加了修饰反应的周期和成本，并可能影响蛋白质药物作用活性。如能有效地控制条件，得到已知结构的单一产物，将大大的提升药物的安全性和可控性，更加符合当前新药开发的指导原则。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供重组灵芝免疫调节蛋白rLZ-8的单甲氧基聚乙二醇丙酸琥珀酰亚胺酯(mPEG-SPA)修饰物，提供其制备方法以及在制备治疗化疗药所致白细胞减少症的药物中的应用。

[0006] 本发明的重组灵芝免疫调节蛋白rLZ-8的单甲氧基聚乙二醇丙酸琥珀酰亚胺酯修饰物，其特征在于单甲氧基聚乙二醇丙酸琥珀酰亚胺酯单一修饰于重组灵芝免疫调节蛋白rLZ-8二聚体的N末端，修饰物分子中重组灵芝免疫调节蛋白rLZ-8的二聚体分子和单甲氧基聚乙二醇丙酸琥珀酰亚胺酯结合，二者的分子摩尔比为1∶1。

[0007] 上述的单甲氧基聚乙二醇丙酸琥珀酰亚胺酯，其结构式如图：

[0008]

[0009] 结构式中n值分别为7、109、223、450；对应的单甲氧基聚乙二醇丙酸琥珀酰亚胺酯分别为500Da、5000Da、10000Da和20000Da。

[0010] 重组灵芝免疫调节蛋白rLZ-8的单甲氧基聚乙二醇丙酸琥珀酰亚胺酯修饰物的制备方法，其中单甲氧基聚乙二醇丙酸琥珀酰亚胺酯分子量分别为500Da、5000Da、10000Da和20000Da。其特征在于按以下步骤进行：

[0011] A.在0.1M pH5.0-pH8.0磷酸盐缓冲液的反应体系中将rLZ-8二聚体与单甲氧基聚乙二醇丙酸琥珀酰亚胺酯以分子比为1∶1-1∶6进行投料，置于西林瓶中，在锡纸包裹避光，室温下磁力搅拌反应1-2.5小时；

[0012] B.以SDS-PAGE电泳将反应后的产物进行鉴定，对胶体进行碘化钡染色，目的是观察单甲氧基聚乙二醇丙酸琥珀酰亚胺酯组分；TM

[0013] C.将样品进行纯化回收，以Superdex 75prep grade色谱手段对产物进行纯化，以含有0.15M NaCl的0.05M磷酸盐为流动相，pH值为7.0，流速1mL/min，等浓度洗脱，检测波长280nm、254nm、215nm，固定体积收集及峰收集相结合 的方式收集样品； [0014] D.将纯化回收的样品进行SDS-PAGE电泳进行分析，对胶体进行碘化钡染色，经过质谱检测分析，表明PEG只修饰在蛋白rLZ-8N-末端，并未与其他的位点结合，因此进一步说明，通过本方法得到的rLZ-8的蛋白mPEG-SPA修饰产物，为单一的修饰产物，经纯化得到纯度达到98％的修饰产物。

[0015] 将修饰物与原样作对照进行半衰期实验，经过ELISA法检测得出结论，说明mPEG-SPA修饰物的半衰期约为修饰前rLZ-8二聚体的2倍。

[0016] 本发明将修饰物与原样作对照进行治疗白细胞减少症实验，经过细胞分析仪检测白细胞数，结果表明重组灵芝免疫调节蛋白rLZ-8和它的mPEG-SPA修饰物在治疗白细胞减少症疗效明显差异。其中，在同一剂量下，rLZ-8二聚体的mPEG-SPA修饰物促进白细胞生长周期更短，在同一治疗周期下，rLZ-8二聚体的mPEG-SPA修饰物促进白细胞生长数量更多。进而说明经mPEG-SPA修饰后的rLZ-8蛋白在治疗白细胞减少症疗效明显增强。 [0017] 本发明有益效果如下：本发明中提供的rLZ-8的单甲氧基聚乙二醇丙酸琥珀酰亚胺酯修饰物，其体内半衰期较修饰前rLZ-8出现显著延长；本发明的rLZ-8的单甲氧基聚乙二醇丙酸琥珀酰亚胺酯修饰物制备方法步骤简单，产物单一；一般条件下，单甲氧基聚乙二醇丙酸琥珀酰亚胺酯极易修饰于赖氨酸残基上，而rLZ-8一级结构中含有6个赖氨酸，即rLZ-8二聚体中存在12个潜在的修饰位点，有产生大量、多种不同位点修饰产物的可能，本发明通过控制反应条件，在不采用任何基团置换和保护以及其他措施的条件下，得到单一的修饰产物，反应步骤简单，避免了多种多位点修饰产物的生成；本发明中的药学试验证明rLZ-8的单甲氧基聚乙二醇丙酸琥珀酰亚胺酯修饰物其体内半衰期较修饰前rLZ-8出现显著延长同时在治疗白细胞减少症研究中的最低给药剂量和起效时间均优于修饰前rLZ-8。 附图说明

[0018] 附图1rLZ-8与mPEG-SPA以摩尔比1∶1反应并纯化后产物电泳结果 [0019] 图注：泳道1样品为蛋白Marker；泳道2样品为.rLZ-8；泳道3样品为mPEG-SPA；泳道4样品为反应后混合液；泳道5样品为1号收集峰前半部分；泳道6样品为1号收集峰后半部分；泳道7样品为2号收集峰；泳道8样品为3号收集峰。

[0020] 附图2rLZ-8的mPEG-SPA修饰物与蛋白原样的半衰期实验检测结果 具体实施方式

[0021] 下面通过具体实施例对本发明进行进一步说明。

[0022] 以下实施例中，重组灵芝免疫调节蛋白rLZ-8由吉林大学提供，单甲氧基聚乙二醇丙酸琥珀酰亚胺mPEG-SPA购自上海炎怡生物科技有限公司。

[0023] 实施例1rLZ-8的mPEG-SPA修饰物制备反应及产物鉴定

[0024] 将rLZ-8二聚体与mPEG-SPA(分子量500Da)按摩尔比1∶1反应，即按照质量分别为50mg和1mg投料，反应的缓冲体系为pH值为8.0，0.1M的磷酸盐缓冲溶液，置于西林瓶中，锡纸避光并搅拌，室温反应0.5h，反应后溶液进行SDS-PAGE检测，电泳胶进行碘化钡染色及凝胶成像仪进行分析，由于碘化钡染色技术能够针对mPEG-SPA进行特异性染色，而mPEG-SPA分子量相对较小，当采用该技术对SDS-PAGE电泳胶进行染色时(见图1)，mPEG-SPA的条带出现在较低的位置(见图1中3号泳道)，接近胶底部边缘，而修饰后的产物相对分子量增加，故条带向上迁移(见图1中4号泳道)，且只有一条带出现，说明产物成分比较单一。

[0025] 采用SuperdexTM75 prep grade色谱手段对产物进行纯化，纯化条件：SuperdexTM75 prep grade(GE Healthcare)装柱(色谱柱型号是XK16/70)以0.05M磷酸盐-0.15M NaCl(pH 7.0)为流动相，流速1mL/min，等浓度洗脱，检测波长280nm、254nm、215nm。固定体积收集及峰收集相结合的方式收集样品。该纯化条件得到纯度达到98％的修饰产物，得到修饰产物40mg。

[0026] rLZ-8的单甲氧基聚乙二醇丙酸琥珀酰亚胺酯修饰物修饰位点的质谱鉴定方法如下：样品的酶切：取样品干粉，加入50mM NH4HCO3溶解至样品浓度为1mg/ml。取20ul样品溶液，加入100mM DTT至终浓度10mM，56℃反应1h。冷却至室温后，加入250mM IAA至终浓度25mM，避光反应1h。加入0.5ug Trypsin，37℃反应12小时。加入1ul 10％TFA终止反应。

[0027] 肽质量指纹谱测定(PMF)：采用美国AB公司，MALDI TOF/TOF 5800型质谱分析仪，将样品的酶切产物与基质按1∶3混合点于靶上，自然晾干后，反射正离子模式下测定m/z500-m/z 4000，线性正离子模式下测定 m/z 1000-m/z 10000。肽质量指纹图谱分析：在修饰样本的肽指纹图谱中被匹配的肽段一般表示没有被PEG化；PEG修饰肽的序列在肽质量指纹谱中不会被匹配；其次，该样品中的PEG修饰位点一般为N-末端或赖氨酸的侧链；再者，赖氨酸被PEG化后，一般难以被酶切，因此，修饰位点为赖氨酸的PEG修饰肽段应该包含至少1个漏切位点，PEG修饰肽与PEG分子量差值应该与肽段理论质量数接近，而且被PEG修饰的肽段的质谱峰形应该与PEG的质谱峰形基本一致。

[0028] 鉴定实验结果表明：PEG修饰蛋白中所有的赖氨酸均被匹配，可以判断该蛋白中PEG的修饰位点不为赖氨酸；PEG修饰肽的分子量测定结果与PEG原料极为接近，说明PEG的修饰位点不可能在未被匹配的75-111位氨基酸上；在PEG修饰蛋白的肽谱检测中，发现蛋白N末端既含有存在甲硫氨酸的片段，也存在甲硫氨酸缺失的片段，这可能表明该蛋白的PEG部分修饰位点为蛋白的N末端，而在蛋白酶解过程中，有部分甲硫氨酸脱落，导致缺失甲硫氨酸的肽段被匹配；而且PEG修饰肽的分子量测定结果与PEG原料的分子量差值与甲硫氨酸的分子量比较接近，进一步证明了PEG的修饰位点在蛋白的N-末端。 [0029] 实施例2rLZ-8的mPEG-SPA修饰物制备反应及产物鉴定

[0030] 在0.1M pH 7.0磷酸盐缓冲液的反应体系中，将rLZ-8二聚体与mPEG-SPA(分子量5000Da)按摩尔比1∶2进行反应，即按照质量分别为2.5mg和1mg投料，置于西林瓶中，锡纸避光并搅拌，室温反应1h取样进行分析与纯化，纯化与鉴定方法同实施例1，得到98％的修饰产物2.4mg。鉴定结果同实施例1。

[0031] 实施例3rLZ-8的mPEG-SPA修饰物制备反应及产物鉴定

[0032] 在0.1M pH 6.0磷酸盐缓冲液的反应体系中，将rLZ-8二聚体与mPEG-SPA(分子量10000Da)以摩尔比为1∶4进行反应，即按照质量分别为5mg和8mg投料，置于西林瓶中，锡纸避光并搅拌，室温反应1.5h，反应后溶液进行SDS-PAGE检测，电泳胶进行碘化钡染色及凝胶成像仪进行分析。纯化与鉴定方法同实施例1，得到98％的修饰产物5.6mg。鉴定结果同实施例1。

[0033] 实施例4rLZ-8的mPEG-SPA修饰物制备反应及产物鉴定

[0034] 分别将rLZ-8二聚体与mPEG-SPA(分子量20000Da)按摩尔比为1∶6反应进行修饰，即按照质量分别为5mg和24mg投料，缓冲体系为0.1M pH 8.0磷酸盐缓冲液，置于西林瓶中，锡纸避光并搅拌，室温反应2h，反应后溶液进行SDS-PAGE检测，电泳胶进行碘化钡染色及凝胶成像仪进行分析。纯化与鉴定方法同实施1，得到98％的修饰产物7.2mg。鉴定结果同实施例1。

[0035] 实施例5.rLZ-8蛋白mPEG-SPA修饰物半衰期检测

[0036] 采用体重在18-22g左右的BALB/c小鼠作为实验鼠，以rLZ-8蛋白mPEG-SPA(分子量10000Da)修饰物100g/kg的剂量静脉注射给药，设计时间段为2、4、6、8、10小时后在不同时间段进行采血检测，得出结果，做出药物浓度与时间的曲线图(见图2)由实验结果可以看出，经过修饰后的蛋白产物的半衰期有明显的增加。

[0037] 实施例6：rLZ-8蛋白mPEG-SPA修饰物对大鼠白细胞的影响

[0038] 采用Wistar大鼠作为实验动物，共18只，体重100g左右。试剂配制方法如下：rLZ-8用无菌生理盐水配制。分为60μg/kg、30μg/kg、15μg/kg剂量组；rLZ-8蛋白mPEG-SPA(分子量10000Da)修饰物用无菌生理盐水配制。分为60μg/kg、30μg/kg、15μg/kg剂量组；金磊赛强【重组人粒细胞集落刺激因子注射液(rhG-CSF)】，生产批号：
20060403；75μg/支，用无菌生理盐水配制成13.5μg/mL，0.1mL/只，注射用环磷酰胺(CP)，生产批号050216；200mg/支。用无菌生理盐水配制：20mg/mL，0.1mL/只，即20mg/kg。 [0039] 正常对照组，蛋白低剂量组，蛋白中剂量组，蛋白高剂量组，rLZ-8蛋白mPEG-SPA修饰物低剂量组，rLZ-8蛋白mPEG-SPA修饰物中剂量组，rLZ-8蛋白mPEG-SPA修饰物高剂量组，阳性对照组(金磊赛强)。除正常对照组(给予等量生理盐水)外，每组大鼠均给予环磷酰胺尾静脉注射，20mg/mL，0.1mL/只，连续3天。于第三天，大鼠尾静脉取血，细胞分析仪检测白细胞数。造模成功后按上述分组分别给予相应剂量rLZ-8、rLZ-8的mPEG-SPA修饰物、阳性药(金磊赛强)治疗，正常对照组和CP组给予等量生理盐水，于治疗第1天，第
3天和第7天分别大鼠尾静脉取血，检测白细胞数。对比治疗前后白细胞数变化，分析药物疗效。

[0040] 由表1可以看出，与CP对照组比较，在给药第1天rLZ-8蛋白mPEG-SPA修饰物组已明显升高大鼠白细胞，差异及其显著，在给药第7天基本达到正常。与金磊赛强比较，在给药给药第1天，rLZ-8蛋白mPEG-SPA修饰物组对大鼠的白细胞数量增加作用明显，当给药第7天时，rLZ-8蛋白mPEG-SPA修饰物组的大鼠白细胞数量基本达到正常。重点是rLZ-8蛋白mPEG-SPA修饰物组和rLZ-8蛋白组相比较，可以看出，在相同给药剂量条件下，rLZ-8蛋白修饰物在给药后第一天，就有明显的白细胞增值作用，从数值上看大约为rLZ-8蛋白增值数量的2倍左右，在相同的给药时间上，rLZ-8蛋白修饰物低剂量组的白细胞增值作用明显高于rLZ-8蛋白高剂量组，都明显优于rLZ-8蛋白组对大鼠白细胞增长的促进作用。 [0041] 表1rLZ-8对白细胞低下大鼠模型的影响(x±s，n＝10)

[0042]

[0043] 与CP对照组比较，＊p＜0.01