来源于小麦的多效基因相关蛋白及其编码基因与应用

摘要

本发明公开了一种来源于小麦的多效基因相关蛋白及其编码基因与应用。该来源于小麦的多效基因相关蛋白，是如下a)或b)的蛋白质：a)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将序列表中序列3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与如下任一种性状相关的由(a)衍生的蛋白质：小麦的株高、穗发芽、株型、抽穗期及结实性。该蛋白的编码基因影响小麦的株高、穗发芽、株型、结实性及抽穗期。正是由于该基因的这种极强的多效性，该基因在小麦的育种生产中具有重要的意义。

权利要求

1.一种蛋白质，是由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.权利要求1所述蛋白质的编码基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述蛋白质的编码基因为序列表中序列2所示的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组载体。

5.含有权利要求2或3所述基因的表达盒。

6.含有权利要求2或3所述基因的重组菌。

7.含有权利要求2或3所述基因的重组病毒。

8.一种培育转基因植物的方法，是将权利要求2或3所述基因导入目的植物中，得到具有如下至少一种性状的转基因植物：1）株高低于所述目的植物；2）抽穗开花迟于所述目的植物：3）分蘖角度大于所述目的植物；4）穗发芽抗性高于所述目的植物； 所述目的植物为水稻。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：权利要求2或3所述基因通过含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体导入目的植物中，所述重组表达载体中，启动权利要求

2或3所述基因转录的启动子为35s启动子、或如下a）或b）的启动子：a）其核苷酸序列是序列表中序列4所示的DNA分子；b）其核苷酸序列是序列表中序列4第1-4213位所示的DNA分子。

10.辅助检测小麦中是否携带权利要求2或3所述基因的方法，是以待测小麦的基因组DNA为模板，用引物进行PCR扩增，如果得到489bp的扩增片段，则待测小麦为不携带权利要求2或3所述基因的候选小麦；如果得到2515bp的扩增片段，则待测小麦为携带权利要求2或3所述基因的候选小麦；所述引物为核苷酸序列分别是序列表中序列6和7的两个单链DNA。

11.一种DNA分子，其核苷酸序列是序列表中序列5所示的DNA分子。

12.一种DNA分子，其核苷酸序列是序列表中序列4所示的DNA分子。

说明书

来源于小麦的多效基因相关蛋白及其编码基因与应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种来源于小麦的多效基因相关蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

[0002] 矮化、半矮化植株的作用，不仅提高了作物耐肥、抗倒伏的作用，更重要的是降低了茎秆同化，将更多的光合作用产物转移到穗部，从而提高了收获指数，显著地增加了作物产量。发生于上世纪五、六十年代的农业绿色革命，正是由于小麦、水稻半矮秆品种的广泛推广以及相应栽培技术的采用，使得小麦、水稻产量有了大幅度的提高。迄今为止，已经鉴定并且统一编号的小麦降秆基因一共有21个，但目前生产中广泛应用并推广的矮秆基因仅有Rht1、Rht2、Rht8和Rht9，而其它大部分矮秆基因并未有效的应用于小麦的育种生产。小麦矮源的单一化严重的制约着小麦的育种生产，因此挖掘、研究小麦中其它重要的矮秆基因对于提高小麦的产量具有非常重要的意义。

发明内容

[0003] 本发明的目的是提供一种来源于小麦的多效基因相关蛋白。该蛋白质与小麦的株高、穗发芽、株型、抽穗期及结实性相关。

[0004] 本发明所提供的蛋白质，名称为Rht-Blc(Rht3)，来源于小麦，是如下a)或b)的蛋白质：

[0005] a)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

[0006] b)将序列表中序列3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与如下任一性状相关的由(a)衍生的蛋白质：小麦的株高、穗发芽抗性、株型、抽穗期及结实性。

[0007] 序列表中的序列3由651个氨基酸组成，。

[0008] 为了使上述(a)中的蛋白便于纯化，可在由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

[0009] 表1标签的序列

[0010]标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tagII 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL

[0011] 上述(b)中的蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的蛋白的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

[0012] 上述蛋白质的编码基因也属于本发明的保护范围。

[0013] 所述蛋白质的编码基因具体可为如下1)或2)或3)的基因：

[0014] 1)其核苷酸序列是序列表中序列1或序列2所示的DNA分子；

[0015] 2)与(1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码Rht-Blc的DNA分子；

[0016] 3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码Rht-Blc的DNA分子。

[0017] 序列表中的序列1由3892个脱氧核糖核苷酸组成，是小麦的Rht-Blc的基因组基因，序列表中的序列2由1956个脱氧核糖核苷酸组成，是小麦的Rht-Blc的cDNA基因。

[0018] 所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；
还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，
0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65C下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

[0019] 扩增上述任一所述基因全长或其任意片段的引物对也属于本发明的保护范围。

[0020] 所述引物对具体可以扩增序列表中序列1所示的DNA分子的一对引物对，其中的一条引物序列为5，-ATG CCG TCT ACA ACT ACT ACG CTG-3’另一条引物序列为5，-AGT CCGGCC CGT GCT TAT TTT G-3’(该引物用来扩增Rht-Blc基因的基因组DNA)。

[0021] 所述引物对具体可以扩增序列表中序列2所示的DNA分子的一个片段的一对引物对，其中的一条引物序列为，5’-ATG AAG CGC GAG TAC CAG GA-3’，另一条引物序列为：5’-TCA CGG CGC GGC CAG GCG CCA TGC-3’(该引物用来扩增Rht-Blc基因的cDNA序列)。

[0022] 含有所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒也属于本发明的保护范围。

[0023] 可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pROKII、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa 或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子(如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin))、组成型启动子或组织特异表达启动子(如种子特异表达的启动子)，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对methatrexate抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。

[0024] 含有Rht-Blc基因的重组载体具体可为由35s启动子启动Rht-Blc转录的重组表达载体p35s：Rht-Blc。p35s：Rht-Blc是在pCambia1300中插入35s启动子和序列1的第1-3892位核苷酸所示的Rht-Blc基因得到的由35s启动子启动Rht-Blc基因转录的重组表达载体。

[0025] 含有Rht-Blc基因的重组载体具体还可为pRht-Blc：Rht-Blc。pRht-Blc：Rht-Blc是在pCambia1300中插入序列表中序列4的第1-4213位核苷酸序列所示的Rht-Blc基因的启动子和序列1的第1-3892位核苷酸所示的Rht-Blc基因得到的重组表达载体，该重组表达载体中，Rht-Blc基因由Rht-Blc启动子启动转录。

[0026] 本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。

[0027] 本发明所提供的培育转基因植物的方法，是将Rht-Blc基因导入目的植物中，得到具有如下至少一种性状的转基因植物：1)株高低于所述目的植物；2)抽穗开花迟于所述目的植物：3)分蘖角度大于所述目的植物；4)穗发芽抗性高于所述目的植物。

[0028] 其中，Rht-Blc基因可通过含有Rht-Blc基因的重组表达载体导入目的植物中，所述重组表达载体中，启动Rht-Blc基因转录的启动子为35s启动子、或如下a)或b)的启动子：a)其核苷酸序列是序列表中序列4所示的DNA分子；b)其核苷酸序列是序列表中序列4第1-4213位所示的DNA分子。

[0029] 含有Rht-Blc基因的重组表达载体具体可为上述p35s：Rht-Blc或pRht-Blc：Rht-Blc。

[0030] 所述目的植物具体可为双子叶植物或单子叶植物，所述单子叶植物具体可为水稻。

[0031] 所述转基因植物理解为不仅包含将所述基因转化目的植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。

[0032] 所述基因可先进行如下修饰，再导入宿主中，以达到更好的表达效果：

[0033] 1)根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据受体植物所偏爱的密码子，在保持本发明所述核苷酸序列编码的氨基酸的同时改变其密码子以符合植物偏爱性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35％，优选为多于45％，更优选为多于50％，最优选多于约60％；

[0034] 2)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；

[0035] 3)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；

[0036] 4)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；

[0037] 5)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV，MCMV和AMV)；

[0038] 在实际操作中，也可以将本发明基因进行细胞靶向定位。可利用本领域现有的技术实现。例如，将来源于靶向细胞器的靶基因序列与本发明基因序列融合，再导入植物细胞中，就可定位了。

[0039] 本发明的另外一个目的是提供一种辅助检测小麦中是否携带Rht-Blc基因的方法。

[0040] 本发明所提供的辅助检测小麦中是否携带Rht-Blc基因的方法，是以待测小麦的基因组DNA为模板，用引物进行PCR扩增，如得到489bp的扩增片段，则待测小麦为不携带Rht-Blc基因的候选小麦；如得到2515bp的扩增片段，则待测小麦为携带Rht-Blc基因的候选小麦；所述引物为核苷酸序列分别是序列表中序列6和7的两个单链DNA。

[0041] 另外，名称为CAAS-TRIM-6B的转座子也属于本发明的保护范围。

[0042] 其中，CAAS-TRIM-6B的转座子是如下a)或b)的DNA分子：

[0043] a)其核苷酸序列是序列表中序列5所示的DNA分子；

[0044] b)与a)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且具有转座子活性的DNA分子。

[0045] Rht-Blc基因启动子是如下a)或b)的DNA分子：

[0046] a)其核苷酸序列是序列表中序列4所示的DNA分子；

[0047] b)与a)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且具有启动子活性的DNA分子。

[0048] 本发明辅助检测小麦中是否携带Rht-Blc基因的方法准确、可靠，可用于检测小麦发育早期的Rht-Blc多效基因所控制性状，对培育半矮杆、耐穗发芽、高产的小麦具有重要指导作用，从而优化杂交组合，加快育种速度，降低育种成本，具有操作简单，成本低廉，周期短等优点，非常适于推广应用，对小麦的遗传育种有重要的意义。本发明的发明人发现大拇指矮所携带的Rht-Blc基因是位于小麦4BS染色体短臂上的赤霉素不敏感的完全显性基因，主要影响小麦的株高、穗发芽、株型、结实性及抽穗期。正是由于Rht-Blc基因的这种极强的多效性，该基因在小麦的育种生产中具有重要的意义。

附图说明

[0049] 图1为Rht-Blc近等基因系的表型观察；

[0050] 图1中，c为20株的株高平均值±标准差；

[0051] d为20株的穗发芽的平均值±标准差；

[0052] e为20株的分蘖角度的平均值±标准差；

[0053] f为20株的抽穗期的平均值±标准差；

[0054] 图2为Rht-Blc基因的克隆及基因结构分析；

[0055] 图3为Rht-Blc基因功能的验证；

[0056] 其中，pRht-Blc：Rht-Blc和p35s：Rht-Blc分别表示转入相应载体的植株[0057] 图4为α-amylase含量测定以及酵母双杂交实验结果；

具体实施方式

[0058] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0059] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0060] 实施例1、Rht-Blc近等基因系的构建及表型分析

[0061] 首先我们用偃展一号(河南地方品种，以下称为NIL-Rht-Bla表示)作为轮回亲本，大拇指矮作为供体亲本回交7代，构建得到矮杆基因Rht-Blc的近等基因系(以NIL-Rht-Blc表示)，然后将其种植于长日照地区-河北，与短日照地区-云南，分别进行田间表型的观察，调查其株高、分蘖角度、抽穗期、穗发芽、籽粒饱满度等性状(图1，A为NIL-Rht-Bla，B为NIL-Rht-Blc)。田间调查结果表明构建得到的矮杆基因的近等基因系NIL-Rht-Blc平均株高仅为30cm，要明显低于NIL-Rht-Bla的株高(图1a、c)。收获后观察籽粒也存在有较为明显的差异，NIL-Rht-Blc的籽粒偏干瘪，而NIL-Rht-Bla的籽粒要饱满的多(图1b)。同样NIL-Rht-Blc在河北与云南的穗发芽率分别为13.7％和17.8％，要明显低于NIL-Rht-Bla在这两地的穗发芽率(64.7％和66.7％)(图1d)；在比较分蘖角度的时候发现NIL-Rht-Blc的植株明显呈现匍匐状，分蘖角度明显大于NIL-Rht-Bla的植株(图1e)。NIL-Rht-Bla与NIL-Rht-Blc植株的抽穗期也具有明显差异，在长日照地区河北NIL-Rht-Blc要比NIL-Rht-Bla晚5天左右，而在短日照地区云南差异更加明显，要晚10天左右(图1f)。在Rht-Blc重组自交系(RIL-Rht-Blc)与豫麦18的F2分离群体中也发现，较矮植株的都伴随有抵抗穗发芽、干瘪的籽粒、株型匍匐以及抽穗期较晚。以上这些结果都证实这些性状都是由同一个矮杆基因Rht-Blc(Rht3)所控制。

[0062] 其中，穗发芽率按照如下方法测定：采用脱拉种子直接发芽试验法，每品种各重复随机取混脱种子50粒，置培养皿中直接进行发芽试验，每天对每品种的各重复逐粒发芽检查，直到一周，计算其发芽率。

[0063] 分蘖角度按照如下方法测定：分蘖角度是在收获期时调查20株，最大角度的测量方法是在植株中轴距地面20厘米高处，以不同方向量取中轴与外围分蘖的水平距离3次，算平均值，再求出宽/高比值，并用反正切函数将其转换成该株的分蘖最大夹角。

[0064] 实施例2、小麦蛋白Rht-Blc及其编码基因Rht-Blc的获得

[0065] 一、小麦中Rht-Blc基因组DNA序列的获得

[0066] 首先设计跨越起始密码子和终止密码子扩增基因全长的引物：Rht-Blcp5’-ATGCCG TCT ACA ACT ACT ACG CTG-3’与5’-AGT CCG GCC CGT GCT TAT TTT G-3’。以中国春(Rht-Bla)、农林10号(Rht-Blb)、大拇指矮(Rht-Blc)基因组DNA为模板，用引物Rht-Blcp进行PCR扩增，PCR产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测，检测结果显示中国春与农林
10号中都得到了预期的2Kb扩增片段，而在大拇指矮中得到一个比中国春与农林10号明显大2Kb左右的新的扩增片段(图2中a)。将该片段克隆测序获得大拇指矮中Rht-Blc基因的基因组DNA序列，由3892bp组成(序列1)。

[0067] 二、小麦中Rht-Blc cDNA序列的获得

[0068] 同时也设计引物Rht-Blc-eDNAp(5’-ATG AAG CGC GAG TAC CAG GA-3’与5’-TCACGG CGC GGC CAG GCG CCA TGC-3’)，扩增中国春(Rht-Bla)、农林10号(Rht-Blb)、大拇指矮(Rht-Blc)的总mRNA反转录成的cDNA为模板，PCR产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测，凝胶电泳图如图2中a。将扩增得到的PCR产物进行克隆测序，获得大拇指矮中Rht-Blc基因的eDNA序列，由1956个核苷酸组成，其核苷酸序列如序列表中序列2所示，编码序列表中序列3的蛋白质。

[0069] 三、小麦中Rht-Blc基因启动子序列的获得

[0070] 我们设计引物扩增基因的启动子：Rht-Bp(5’-GCG GCG CTT TTC CTG CTT TGT C-3’与5’-GAT CTC GCC TCT CGC CTC CCT ACC-3’)。以中国春(Rht-B1a)、农林10号(Rht-Blb)、大拇指矮(Rht-Blc)基因组DNA为模板，用引物Rht-Bp进行PCR扩增，PCR产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测，凝胶电泳图如图2中b检测结果显示中国春与农林10号以及大拇指矮中都得到了预期的扩增片段4kb，将该片段克隆测序获得小麦中Rht-Blc基因的启动子DNA序列，其核苷酸序列如序列表中序列4所示，由4213个核苷酸组成。

[0071] 四、小麦中Rht-Blc基因组DNA与cDNA序列的比较

[0072] 将上述一、二中所得到的序列进行比较分析，结果表明Rht-Blc基因全长为3892bp，包含2个外显子和1个内含子，Exon1＝1～147bp；Intronl＝148～2083bp；
Exon2＝2084～3892bp；其开放读码框为1956bp，编码651个氨基酸，理论分子量为
68.0kD，等电点pI值为4.94。序列比较同时还发现，Rht-Blc基因组DNA序列是在Rht-Bla基因组DNA序列的ATG后147bp处插入2026个核苷酸(图2中c)。

[0073] cDNA序列比较发现Rht-Blc在DELLA区存在有90bp的插入，这90bp正好与2026-bp的插入的3’端的90bp序列相一致。Rht-Bla(Rht-Blb)均是是无内含子的基因，但是由于2026-bp序列的插入，使得基因结构发生改变，Rht-Blc基因包含有两个外显子与一个内含子。在内含子与外显子衔接处得序列也完全符合″GT-AG″规律，同时在转录水平
90-bp核苷酸序列的插入也导致了在Rht-Blc基因翻译蛋白质时在DELLA区域存在有30个氨基酸的插入(图2中d)。

[0074] 五、一个新的TRIMs转座子的认定

[0075] 2026bp的插入序列与其插入位点附近的5bp的核苷酸AG(位于插入序列5’端)GTG(位于插入序列3’端)组成一个完整的intact Terminal repeat retro-transposonsin miniature(TRIMs)。这个转座子序列长度为2031bp(序列表中的序列5)，其中包含两个503bp的terminal direct repeats(TDRs)，而且这两个TDRs之间非常的保守，没有任何的碱基差异。此外在两个TDRs之间的序列不编码任何蛋白，而在中间序列的两端具有
22bp(CGA ACC TTG TGG CTC TGA ATA C)的primer binding site(PBS)，以及15bp(TTT CCC CCC TTA ATC)的polypurine tract(PPT)，而且在序列的两端具有5bp(AGGTG)的target site duplications(TSD)，而这5bp的序列是在TRIMs转座到这一位置后形成的，这一序列具备有TRIMs元件的基本结构，可以认定这一插入序列是一个TRIMs元件(图2中e)。比对小麦重复序列数据库TREP Release 10(theTriticeae Repeat Sequence Database：http：
//wheat.pw.usda.gov/ITMI/Repeats/)结果显示，与已知的重复序列没有任何相似性，据此我们认为这是一个新的TRIMs。

[0076] 为了进一步研究这个新的TRIMs的起源，我们比对中国春测序数据库(http：//www.cerealsdb.uk.net/search_reads.htm.)经过电子拼接序列，我们得到了包含有插入序列在内的大约5Kb的序列，根据这一5Kb的序列我们设计了一对扩增2026bp序列的引物pTRIMs(5’-CCG GAC AAA TGG AGG AGA-3’与5’-CGC GCA TCA TCC CGA GTAT-3’)。

[0077] 为了将这一序列在小麦基因组上进行定位，我们首先用这一标记对小麦的AA基因组(T.urartu)AABB基因组(Langdon)DD基因组(粗山羊草Ae.tauchii)进行了扩增，PCR扩增结果显示只有在Longdon材料中能够扩增出目标片段，这一结果也说明这一插入序列位于小麦的B基因组(图2中f，A为T.urartu，AB为Langdon，D为粗山羊草Ae.tauchii，CS为中国春，H10为旱选10号，L14为鲁麦14)。为了更加详细的对其定位我们扩增了旱选10号与鲁麦14(DH作图群体的亲本)，在鲁麦14中扩增得到预期的片段2878bp，而在旱选10号中扩增片段大约为800bp，测序结果显示，旱选10号比鲁麦14缺失2026bp，恰好与在大拇指矮中插入的片段序列相一致。这种插入/缺失的的多样性标记用来扩增旱选10号×鲁麦14的DH群体的150个株系，结合这一群体的作图数据，利用Mapmaker3.0软件将这一插入序列定位于小麦6B染色体的SSR标记Wmc341与Wmc182之间，遗传距离分别为7.9和7.5cM(图2中g)。据此，我们将这一插入序列命名为CAAS-TRIM-6B(序列表中的序列5)。为了检测CAAS-TRIM-6B在小麦基因组中的分布，我们检测了一套多样性非常丰富的材料，检测结果表明仅有7份材料在小麦的6B染色体上检测到了CAAS-TRIM-6B，包括中国春、鲁麦14、台中23、晋麦2148、大粒半芒、Sunstar、温麦6号、和尚麦、白壳光头。而其它的大部分材料在小麦的6B染色体上没有检测到含有CAAS-TRIM-6B。包括大拇指矮、Langdon、
96S-226、红花麦、红冬麦、中农28、96S-223、成都光头、AM3、旱选10号、偃展1号、小白芒、品旱328、京红5号、内乡188、阿勃、白蒲、新克旱9号、欧柔、早穗30、长贡方形麦、内麦11、康定小麦、宁春13、W7984、红蜷芒、小口红、白麦子、白花麦、Opata85、GIAVA、望水白、六月黄、卡捷姆F71、豫麦18、郑引4号、上林小麦、木宗卓嘎、矮孟牛、阿特拉斯66、半截芒、换果香、藏冬4号、洋麦、农大311、白油麦、火球、抗锈10号、咸农39、宁春4号。这说明转座子CAAS-TRIM-6B已经从6B染色体转移到小麦基因组的其它位置，比如在大拇指矮中就是从小麦的6B染色体转移到小麦的4B染色体上的。以上这些实验结果说明CAAS-TRIM-6B在小麦基因组中是非常活跃的，并且这种转座子的跳跃具有随机性。

[0078] 实施例3Rht-Blc基因功能的验证

[0079] 为了验证我们所得到的基因序列的正确性，我们根据Rht-Blc基因组序列中2026个核苷酸的插入片段设计引物Rht-BlcM(5’-ATG CCG TCT ACA ACT ACT ACG CTG-3’5’-TAG TGC ACG GTG TCC GTG GCG A-3’)，该引物可直接用于特异的检测Rht-Blc基因。当含有Rht-Blc基因时，扩增片段为2515bp，否则扩增片段为489bp。在这里我们将引物Rht-BlcM用于检测实施例1中构建的矮杆基因的近等基因系(以NIL-Rht-Blc表示)，以及RIL-Rht-Blc的F2分离群体。检测结果都表明所有矮杆植株都含有Rht-Blc基因，相反在高杆材料中则检测不到Rht-Blc基因(图3中a，Rht-Blc为矮杆植株，Rht-bla为高杆植株)。这一检测结果说明了Rht-Blc基因与株高、穗发芽、分蘖角度、抽穗期以及结实性直接关联。

[0080] 为了进一步证实Rht-Blc基因的在植物中功能，我们构建了转基因表达载体转化水稻，具体表达载体构建及转化过程如下：

[0081] 其中，pCambia1300-35s按照如下方法构建：根据35s启动子引物序列设计引物F：5’-CCG GAA TTC ATG GTG GAG CAC GAC ACT CTC GTC T-3’(下划线序列为EcoRI为酶切位点)和R：5’-CGG GGT ACC CTG TCC TCT CCA AAT GAA ATG A-3’(下划线序列为KpnI酶切位点)，从质粒pCambia1300扩增35s启动子，将该35s启动子插入pCambia1300的限制性内切酶EcoRI和KpnI识别位点得到pCambia1300-35s。

[0082] 35s启动子表达载体p35s：Rht-Blc的构建：具体根据Rht-Blc的cDNA序列设计引物F：5’-CGG GGT ACC ATG AAG CGC GAG TAC CAG-3’(下划线序列为KpnI酶切位点)和R：5’-CTA GTC TAG ATC ACG GCG CGG CCA GGC G-3’(下划线序列为XbaI酶切位点)，扩增得到Rht-Blc的基因组DNA的ORF(具有序列1的第1-3892位核苷酸序列)，经KpnI/XbaI双酶切后，通过T4 DNA连接酶将基因插入到pCambia1300-35s载体的KpnI和XbaI位点得到重组载体p35s：Rht-Blc。

[0083] 自身启动子表达载体pRht-Blc：Rht-Blc的构建：具体根据Rht-Blc基因的启动子区域序列设计引物F：5’-GCA TCA ATT GGC GGC GCT TTT CCT GCT TTG TC-3’(下划线序列为MfeI位点)和R：5’-GGC GGT ACC GAT CTC GCC TCT CGC CTC CCT ACC-3’(下划线序列为KpnI酶切位点)，扩增得到Rht-Blc的启动子(具有序列表中序列4的第1-4213位核苷酸序列)，经MfeI/KpnI双酶切后，通过T4连接酶将启动子插入到p35s：Rht-Blc的MfeI和KpnI位点以替换35s启动子，得到重组载体pRht-Blc：Rht-Blc。

[0084] 表达载体构建完成后，经过酶切与测序验证其正确性后，取1μl构建好的表达载体质粒电击转化进入20μl EHA105农杆菌感受态细胞中，然后用1mlYEB液体培养基28℃250rpm恢复培养3h，取10μl菌液涂布于YEB抗性平板上(卡那霉素50mg/L，利福平Rif50mg/L)，于28℃培养2～3天。提取农杆菌的质粒进行目标基因的PCR检测，阳性菌液保存于-70℃超低温冰箱中备用。将阳性菌液扩大培养，然后侵染水稻品种日本晴(高秆且直立)的愈伤组织，用潮霉素抗性筛选愈伤，并进一步培养分化成幼苗，然后移栽大田。

[0085] pRht-Blc：Rht-Blc转基因植株的检测：实施例3中所设计的特异检测Rht-Blc基的引物：Rht-BlcM(5’-ATG CCG TCT ACA ACT ACT ACG CTG-3’与5’-TAG TGC ACG GTGTCC GTG GCG A-3’)可以用来检测pRht-Blc：Rht-Blc是否转入日本晴，如转入则有扩增，如无转入则没有扩增片段。

[0086] p35s：Rht-Blc转基因植株的检测：所用引物为5’-ACA GCA CCA GAC GCT CAC C-3’与5’-TTG GTA TTC AGA GCC ACA AGG-3’)，所扩增片段大小为606bp。如有扩增片段说明该植株有目标基因的转入，无扩增片段则认为该基因没有目标基因的转入。同时设转入pCambia1300-Rht-Blc(将pRht-Blc：Rht-Blc中的Rht-Blc的基因组DNA去除得到的重组载体)的转基因日本晴对照，转入pCambia1300-35s的转基因日本晴对照。

[0087] 经过PCR检测，共检测到72株转pRht-Blc：Rht-Blc的T0代的植株，其平均株高为8.6±0.8cm，降秆幅度为80.9％；检测到27株转p35s：Rht-Blc的T0代植株，其平均株高为4.6±0.4cm，其降秆幅度为89.8％。25株日本晴(Nipponbare)的平均株高为45±1.2cm。25株转pCambia1300-35s的T0代的植株上的平均株高为43.5±1.1cm；25株转pCambia1300-Rht-Blc(将pRht-Blc：Rht-Blc中的Rht-Blc的基因组DNA)去除得到的重组载体)的T0代的植株的平均株高为44.5±2.1cm。同时观察到p35s：Rht-Blc和pRht-Blc：
Rht-Blc的转基因植株明显要比空对照日本晴匍匐(图3中c)。同时田间调查抽穗期还可以看出p35s：Rht-Blc和pRht-Blc：Rht-Blc转基因植株的抽穗期要比日本晴以及对照的晚10天以上。田间调查结果都证实了Rht-Blc基因具有降低株高、延迟抽穗开花、增大分蘖角度的作用。RT-PCR分析结果说明这些转基因植株都是单拷贝基因，而且在转录水平具有相同的表达量，这一结果说明这些T0代植株的表型是由于插入片段所引起的(图3中b)。
RT-PCR分析所用引物为Actin引物为：5’-TGT GCC CCG TGC TGTTCT TAT G-3’与5’-CCC TTG GCC CAG TTG TTA CCC-3’。检测Rht-Blc表达量所用引物为5’-ATC TGG GGC GGC TGC TGC TCC TG-3’与5’-GTG TGC CAC CCC AGC GTC AGG CAG-3’。

[0088] 实施例4大拇指矮种子中α-amylase含量的测定

[0089] 由于糊粉层α-amylase的含量直接影响种子的发芽程度，所以我们对Rht-Bla与Rht-Blc种子的α-amylase的含量进行了测定。具体方法为：小麦种子去皮后，去掉有胚的一半，把无胚的一半用1.5％NaCl0表面灭菌30分钟，再用灭菌水清洗种子三次后，放在含有0.2％淀粉，2％琼脂粉，10mM醋酸钠和2mM CaCl2，pH值为5.3的平板上培养，其中加入1μM GA3，以不加GA3的作为阳性对照。当平板在30℃黑暗中放置大约60-72h后，取出置于碘蒸汽中检测α-淀粉酶活性。所用材料为：中国春(Rht-Bla)与大拇指矮(Rht-Blc)，检测结果如图4中a所示：在不含有GA3的平板中Rht-Bla与Rht-Blc均没有α-amylase的释放，而在含有1μM GA3的平板中观察到Rht-Bla有明显的较大白斑出现，说明Rht-Bla在外加GA3的条件下有较多的α-amylase的释放，而Rht-Blc几乎看不到白斑的出现，说明Rht-Blc仅释放微量的α-amylase。这一结果说明Rht-Blc种子中α-amylase含量要明显低于Rht-Bla，从而Rht-Blc表现出较强的抵抗穗发芽的能力。

[0090] 实施例5酵母双杂交实验验证GIDl与DELLA蛋白的相互作用

[0091] 根据已有的研究报道，GA的受体-GIDl在GA3存在的时候与DELLA蛋白是相互作用的，从而引起DELLA蛋白的降解。为了研究Rht-Blc与GIDl在小麦中的相互作用情况，我们根据clontech公司的实验操作流程，将TaGIDl利用NdeI与EcoRI酶切位点连接到pGADT7载体，同样利用NdeI与EcoRI酶切位点将Rht-Bla与Rht-Blc连接到pGBKT7载体。然后将携带有Rht-Bla与Rht-Blc及TaGIDl的共转化到酵母细胞中，最后在-Leu-Trp-Ade-His缺陷型培养基上观察酵母的生长情况。酵母双杂交结果如图4b：在缺乏GA3的培养基上Rht-Bla-TaGIDl与Rht-Blc-TaGIDl都没有观察到菌斑的生长，说明在缺乏GA3的情况下Rht-Bla-TaGIDl与Rht-Blc-TaGIDl都没有相互作用；而在外加GA3的-Leu-Trp-Ade-His的缺陷型培养基上Rht-Bla-TaGIDl出现明显的阳性克隆，说明Rht-Bla-TaGIDl在GA3存在的时候是发生相互作用的，而在同样条件的培养基上Rht-Blc-TaGIDl看不到任何阳性克隆，说明Rht-Blc-TaGIDl即使是在GA3存在的时候也不会发生相互作用，然后我们采用滤纸染色的方法验证了这一结果。以上酵母双杂交结果说明Rht-Blc基因由于在DELLA区域存在有的30AA的插入，导致了Rht-Blc与TaGIDl的相互作用消失，从而使得DELLA蛋白大量积累，抑制了植物体内GA的合成，DELLA蛋白调节下游的基因表达，进而引起多种表型的产生。