橡胶树胶乳小G蛋白Rop家族成员蛋白及其编码基因

摘要

本发明公开了一种小G蛋白Rop的编码基因与应用。该蛋白是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：1）序列表中的SEQ？ID？№.1的氨基酸残基序列；2）将序列表中的SEQ？ID？№.1氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有GTP结合功能的由SEQ？ID？№：1衍生的蛋白质。该蛋白具有GTP结合活性，可以调控活性氧ROS的生成与代谢，参与胁迫应答，具有调控林木次生木质部和韧皮部发育的特征，转基因作物或林木中，可提高其对逆境的抗性，从而提高产量。

权利要求

1.一种蛋白质，是由序列表中的SEQ ID №.1的氨基酸残基序列组成的蛋白质。

2.权利要求1所述的蛋白质的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因的核苷酸序列如下1)或2）所示：

1）序列表中SEQ ID №：2的核苷酸序列；

2）序列表中SEQ ID№：2自5′末端第94-723位核苷酸所示的核苷酸序列。

4.含有权利要求2或3所述的编码基因的重组表达载体。

5.含有权利要求2或3所述的编码基因的转基因重组菌。

6.权利要求1所述的蛋白质在结合鸟苷酸中的应用。

说明书

橡胶树胶乳小G蛋白Rop家族成员蛋白及其编码基因

技术领域

[0001] 本发明涉及一种橡胶树胶乳小G蛋白Rop家族成员蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

[0002] 小G蛋白是结合鸟苷酸的单体蛋白，在真核细胞中具有分子开关的作用（Zhenbiao Yang，Small GTPases:Versatile Signaling Switches in Plants.The Plant Cell，2002.14,p.S375-S388;V Vernoud,V.,et al.,Analysi s of the small GTPase gene superfamily of Arabidopsis.Plant physiology，2003.131(3):p.1191-1208;Nibaua,C.,Wu,HM.and Cheung,AY.,RAC/ROP GTPases:hubs’for signal integration and diversification in plants.Trends in Plant Science，11(6):p.309-315.）。许多研究证实，植物小G蛋白Rop亚家族成员是植物进化中形成的一类特有基因，它们广泛参与植物细胞内的多种生理活动，包括肌动蛋白细胞骨架的组织、细胞极性、细胞生长、分化和死亡、细-胞壁形成、细胞质内钙离子浓度的调控，O2 和H2O2生成，泛素依赖的蛋白降解系统，胁迫或激素诱导的信号转导等。随着科研工作的深入开展，人们发现小G蛋白Rop家族基因的功能更加多样化，在不同的植物中，表现出与不同经济生物学特性的相关性。例如，在棉花中，与棉纤维的发育密切相关；在豆科植物中，与根瘤菌的侵入和形成相关；在桉树中，参与桉树次生木质部的发生发育等（Foucart,C.,et al.,Overexpression of EgROP1,a Eucalyptus vascular-expressed Rac-like small GTPase,affects secondary xylem formation in Arabidopsis thaliana.New Phytol，2009.183(4):p.1014-29.）。那么在橡胶树中呢，到目前为止，未见任何有关橡胶胶乳小G蛋白Rop家族基因克隆的相关报道。

[0003] 天然橡胶（顺式-1，4-聚异戊二烯，橡胶烃）是一种重要的工业原料和不可或缺的战略物资，在世界经济发展中扮演重要角色。目前，巴西橡胶树是天然橡胶的主要来源。巴西橡胶树的乳管是天然橡胶生物合成和贮存的地方，也是橡胶树的一种防卫结构。天然橡胶生物合成是乳管细胞内的主要代谢活动，因为橡胶烃占其细胞质（胶乳）干重的90%以上。胶乳再生过程要求乳管细胞具有非常强的代谢活性，特别是能量再生代谢、蛋白质合成和运输。基于对植物小G蛋白Rop家族基因功能的分析，我们推测小G蛋白Rop成员，尤其是胶乳中的Rop成员，在橡胶树中也一定会具有重要的功能。最近李德军等（2010）报道活性氧的产生与清除很可能在橡胶树重要病害--死皮病（tapping panel dryness，TPD）发生中具有重要作用，而小G蛋白Rop成员参与调控ROS的产生，因此很可能参与调控死皮病的发生调控。（Li,D.,et al.,Identification and characterization of genes associated with tapping panel dryness from Hevea brasiliensis latex using suppression subtractive hybridization.BMC Plant Biol,2010.10:p.140.），他们只是报道了Rop成员的部分序列，没有克隆该成员基因，也没有更多深入研究，不过他们的研究足以证明我们推测的正确性。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供一种小G蛋白Rop家族成员蛋白的编码基因与应用。

[0005] 本发明所提供的小G蛋白Rop家族成员蛋白，来源于大戟科橡胶属的巴西橡胶树（Hevea brasiliensis），名称为HbRop5，是如下1）或2）的蛋白质：

[0006] 1）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

[0007] 2）将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与序列1所示蛋白具有相同活性的由1）衍生的蛋白质。

[0008] 序列表中的序列1由209个氨基酸残基组成。

[0009] 为了便于序列1编码的HbRop5纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

[0010] 表1标签的序列

[0011]标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6（通常为5个） RRRRR
Poly-His 2-10（通常为6个） HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL

[0012] 上述HbRop5可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述HbRop5的编码基因可通过将序列表中序列2自5′末端第94-723位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

[0013] 所述小G蛋白Rop家族成员蛋白（HbRop5）的编码基因也属于本发明的保护范围。

[0014] 所述小G蛋白Rop家族成员蛋白（HbRop5）的编码基因为如下1）或2）或3）或4）的DNA分子：

[0015] 1）序列表中序列2所示的DNA分子；

[0016] 2）序列表中序列2自5′末端第94-723位核苷酸所示的DNA分子；

[0017] 3）在严格条件下与1）或2）限定的DNA序列杂交且编码所述小G蛋白Rop成员的DNA分子；

[0018] 4）与序列表中SEQ ID №：2的核苷酸序列具有80％以上的同源性的且编码蛋白具有蔗糖转化酶功能的核苷酸序列。

[0019] 序列表中的序列2由891个核苷酸组成。序列表中序列1全长为891个核苷酸（nt），包含一个长度为630个核苷酸的开放阅读框（ORF，自序列2的5＇端第94-723位核苷酸序列）、93nt的5’-UTR（自序列2的5＇端第1-93位核苷酸序列）和167nt的3’-UTR（自序列2的5＇端第724-891位核苷酸序列）。编码一个长度为209个氨基酸（序列表中序列1）。

[0020] 所述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1%SDS的溶液中，在65°C下杂交并洗膜。

[0021] 含有所述小G蛋白Rop家族成员编码基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。

[0022] 本发明的HbRop5具有GTP结合活性，调控ROS生成，转入植物中，可使植物具有广泛的抗病特性，并促进植物茎的径向发育。本发明的HbRop5蛋白具有GTP结合活性，可以调控活性氧ROS的生成与代谢，参与胁迫应答，具有调控林木次生木质部和韧皮部发育的特征，转基因作物或林木中，可提高其对逆境的抗性，从而提高产量。

附图说明

[0023] 图1为HbRop5的系统进化分析；HbRop5与16个同源基因的功能聚类分析图，其中，开头两个字母的意义为：At(拟南芥)；Os(水稻)；Gh(陆地棉)；Hv(大麦)；Nt(烟草)；Zm(玉米)；Hb(橡胶树)；其余字母为基因名称。

[0024] 图2为HbRop5氨基酸序列和17个来自其它植物中抗病Rop蛋白的功能域分析；其中，开头两个字母的意义为：At(拟南芥)；Os(水稻)；Gh(陆地棉)；Hv(大麦)；Nt(烟草)；Zm(玉米)；Hb(橡胶树)；其余字母为蛋白名称。

[0025] 图3为HbRop5基因在不同死皮程度橡胶树中的表达情况

[0026] 图4为HbRop5基因的组织特异性表达分析

[0027] 图5为割胶对HbRop5基因表达的影响

[0028] 图6为乙烯利处理对HbRop5基因表达的影响

[0029] 图7为短时间机械伤害对HbRop5基因表达的影响

[0030] 图8为长时间机械伤害对橡胶树次生乳管的诱导和对HbRop5基因表达的影响[0031] 图9为甲基茉莉酸对HbRop5基因表达的影响

[0032] 图10为细胞分裂素（6-BA）HbRop5基因表达的影响

[0033] 图11为HbRop5的原核表达分析.箭头所示条带为受IPTG诱导后所产生的特异表达的目标蛋白。

具体实施方式

[0034] 下述实施例中所述的方法，如无特别说明，均为常规方法。

[0035] 实施例1、小G蛋白Rop成员HbRop5编码基因的获得及其效果验证

[0036] 我们首次克隆了橡胶树胶乳中小G蛋白Rop家族成员蛋白编码基因HbRop5的全长cDNA，并进行了序列分析和功能研究。

[0037] 1.小G蛋白Rop成员蛋白及其编码基因HbRop5的获得

[0038] 我们建立了橡胶树胶乳EST序列数据库，发现小G蛋白Rop成员编码基因HbRop5的EST片段，进一步利用cDNA末端的快速扩增技术（3’RACE），最终获得包含完整读码框的cDNA序列。

[0039] 具体方法如下：

[0040] <1>保守片段获得

[0041] 通过搜索我们建立的已经注释好的橡胶树胶乳EST序列数据库，发现一段399bp上下的小G蛋白Rop成员编码基因HbRop5的EST片段。根据Genetyx软件分析，该EST片段已经包括完整的5’末端序列，3’末端序列尚不完全。

[0042] <2>3’端RACE

[0043] 根据小G蛋白Rop成员编码基因HbRop5的EST片段设计3’RACE引物（第一轮:5’GTGCTAATGTGGCTGTGGAT3’;第二轮:5’GCAGATTGAGGCCACTGAGTTAC3’），通用引物QT，Q0和Q1的序列及RACE操作流程参照文献（迪芬巴赫C W，德维克斯勒G S.PCR技术实验指南.黄培堂译.北京：科学出版社，1998：268~277）。进行3’RACE时，以Random primer反转录进行cDNA第一链合成，反应产物经乙醇沉淀去除多余dNTP和引物后。第一轮扩增以巴西橡胶树热研7-33-97（中国热带农业科学院橡胶研究所培育，中国热带农业科学院橡胶研究所长期有种苗出售）第一链cDNA为模板，使用引物QT、Q0和第一轮引物（5’-GTGCTAATGTGGCTGTGGAT-3’），终浓度分别为0.04μmol/L、0.4μmol/L和0.4μmol/L，在25μl反应体系中进行PCR扩增。扩增程序为：首先，94℃变性5min，50℃退火2min，72℃延伸40min；然后，94℃变性1min，54℃退火1min，72℃延伸1min，共30次循环；最后，72℃延伸10min。PCR产物稀释100倍后，取1μl稀释产物作为模板，使用终浓度均为0.4μmol/L的Q1和第二轮引物（5’-GCAGATTGAGGCCACTGAGTTAC-3’）进行第二轮嵌套扩增，PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸1min，共30次循环；72℃延伸10min。获得595bp左右的核苷酸片段。

[0044] 根据测序结果和拼接分析，已经获得了3’端的完整序列。

[0045] <4>HbRop5 cDNA全长克隆

[0046] 根据上述所得到的巴西橡胶树HbRop5基因的cDNA部分片段和3’端序列，利用SECentral软件进行序列拼接，得到HbRop5基因全长cDNA的拼接序列。根据拼接序列，分别在5’末端和3’末端各设计一条引物（5-F（正义链引物）:5’-TTGACTTTTTGGGGGAGTTC-3’;5-891R（反义链引物）5’-CCTGGTTAATGGGGCTACAA-3’）。以巴西橡胶树热研7-33-97的第一链cDNA为模板，使用Taq plus polymerase进行PCR扩增，引物终浓度均为0.4μmol/L，扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸1.5min，共30次循环；72℃延伸10min。将该PCR获得的片段克隆到pMD18-T载体进行测序,经测序表明获得获得片段大小为891bp的cDNA全长序列。该获得的片段即为本发明的小G蛋白Rop成员编码基因HbRop5基因，该片段具有序列表中序列1的核苷酸序列，序列表中序列1全长为891个核苷酸（nt），包含一个长度为630个核苷酸的开放阅读框（ORF，自序列2的5＇端第94-723位核苷酸序列）、93nt的5’-UTR（自序列2的5＇端第1-93位核苷酸序列）和167nt的3’-UTR（自序列2的5＇端第724-891位核苷酸序列），推测编码一个长度为209个氨基酸（序列表中序列1）、分子量为23.11KDa的蛋白，即为Rop蛋白成员HbRop5，将该小G蛋白Rop基因命名为HbRop5。将PCR获得的片段克隆到pMD18-T载体获得的含有序列2的核苷酸的pMD18-T重组载体命名为pMD18-HbRop5。

[0047] 根据小G蛋白基因参与植物抗病的相关文献报道，我们挑选来自其它模式植物或重要经济作物（拟南芥、烟草、水稻、大麦、玉米和棉花）中具有代表性的16个抗病相关的Rop基因和1个橡胶树胶乳中的Rop家族成员HbRop5的氨基酸进行比较聚类分析，来了解HbRop5的系统功能进化地位。利用Clustal X(version1.81)软件对这17个小G蛋白Rop成员基因序列进行多重比对，并用TreeView[Win32]（version1.6.6）构建系统进化树（图1）。从聚类结果可以看出（图1），所克隆的HbRop5基因与OsRac1聚类在一起。OsRac1被证明在水稻稻瘟病和枯萎病的抗性信号传导途径中具有的正调控功能(Agrawal,G.K.,H.Iwahashi and R.Rakwal,Small GTPase'Rop':molecular switch for plant defense responses.FEBS Lett,2003.546(2-3):p.173-80)。这初步聚类分析的结果进一步证明了我们的推测，Rop成员一定在橡胶树胶乳中具有重要的功能。因为在橡胶树中，人们一直认为橡胶树胶乳具有防御的生理功能，只是分子生物学机理还不清楚。

[0048] 同时，我们也分析了橡胶树胶乳中HbRop5基因所编码的氨基酸序列与所选择同源基因的氨基酸的多重比对结果。结果表明：所克隆的HbRop5具有植物Rop基因的所有保守的结构域和多样的羧基末端膜定位信号，这包括（I和III，GTPase区；II,效应因子互作区；IV和VI，GDP/GTP结合区；V，植物ROP蛋白特异的插入序列区），而且根据C末端的变化，可以分为3组“CXX”，“CXXS”和“CXXL”（图2），这也说明我们克隆到的HbRop5具有完整的功能结构域，具有GTP结合活性。

[0049] 利用不同在线软件（Predotar,Target P和PSORT）分析了这个橡胶树小G蛋白Rop成员HbRop5的亚细胞定位，结果显示它可能定位在除叶绿体和线粒体的其它细胞器，只有PSORT预测定位在细胞核中。同时，比较分析了水稻的OsRac1，PSORT预测定位在线粒体而和大麦的HvRacB软件PSORT预测也是定位在细胞核中，而其它两个软件的预测结果是它们同样是定位在除叶绿体和线粒体的其它细胞器中（表2）。可见软件的预测结果只能起到参考的作用，具体的亚细胞定位还需要具体检测。

[0050] 表2.HbRop5亚细胞定位的预测

[0051]

[0052] 2.HbRop5基因的表达研究

[0053] <1>HbRop5基因在不同死皮病发生程度的橡胶树中的表达分析验证[0054] 橡胶树割面干涸病（TPD，tapping panel dryness）是目前影响橡胶树产量最大的综合性生理病害，其分子机制最近才开始研究(刘惠芳,吴继林与郝秉中,茉莉酸和其它激素对巴西橡胶树乳管分化的协同作用.热带作物学报,2001(3))，根据对HbRop5功能聚类分析结果，推测该基因有可能参与胶乳中对该疾病的应答。因此，我们选用热研7-33-97品系中3组不同死皮程度的橡胶树（死皮程度﹤30%;30%﹤死皮程度﹤60%；60%﹤死皮程度﹤90%）和其周围的健康树作为对照材料，检测该基因是否参与TPD的应答调控。TPD发生程度的计算是根据停流胶的割线长度与割线全长的比值，即TPD=停流胶割线的长度/割线全长(%)。该基因的表达分析表明，该基因与该疾病的发展是相关的，因为它的转录水平随着TPD发展程度的不同而有表达上调（图3）。

[0055] <2>HbRop5基因的组织功能表达验证

[0056] 以巴西橡胶树热研7-33-97叶片、树皮和胶乳RNA随机反转录的cDNA为模板，用Ct(YLS8)-Ct(HbRop5)HbRop5基因特异引物进行实时荧光定量PCR，根据各自对应的Qr值（Qr=E ，E-常数10；Ct-每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数）的大小，同时乘以相同的倍数，即得到不同处理的相对表达丰度。结果显示：HbRop5主要在胶乳、花和顶芽中表达，在胶乳中表达最多，在成熟叶片、种子和树皮中的表达丰度相比要低的多（图
4），表明它具有明显的组织表达特异性，并且可能是乳管细胞中发挥重要功能的Rop编码基因。

[0057] <2>割胶对HbRop5基因的表达影响

[0058] 割胶可刺激胶乳生产，在未开割橡胶树中这种效果更明显。未开割树茎干部树皮中的乳管代谢活性低，随着割胶次数的增加，乳管代谢活性增强，最终胶乳产量也增加了。未开割树的这种特性使其成为一个鉴定和研究胶乳再生相关基因的理想材料。

[0059] 以未开割巴西橡胶树热研7-33-97不同刀次的胶乳RNA随机反转录的cDNA为模板，用HbRop5基因特异引物（rRop5-F：GCGAGCATAATGTGTGGA（正义链引物，对应序列表中序列2的第691-708位核苷酸），rRop5-R：GCAACTGGCTGTCAGGA（反义链引物，对应序列表中序列2的第826-842位核苷酸））进行实时荧光定量PCR，内参基因是选用适合橡胶树胶乳分析的基因有丝分裂蛋白YLS8（GENBANK accession number是：HQ323250），其特异的实时定量引物是（rYLS8-F：CCTCGTCGTCATCCGATTC，rYLS8-R：CAGGCACCTCAGTGATGTC）。结果如图5(在未开割橡胶树中，随着开割连续前8个割次对HbRop5基因表达的影响)所示，结果表明割胶影响HbRop5基因的表达——显著上调HbRop5基因的表达。

[0060] <3>机械伤害处理对割胶树胶乳中HbRop5基因的表达影响

[0061] 因为割胶的橡胶树来说是一种不可避免的机械伤害，那么机械伤害是否影响HbRop5基因的表达呢？我们用机械伤害但是不外流胶乳的处理方法，来检测该基因的表达情况。结果表明：机械伤害处理能上调HbRop5基因的表达，但是上调的幅度不很大，说明伤害处理仅能部分影响HbRop5的表达（图7,纵坐标作为HbRop5基因相对表达量，以0小时的表达量为1.0，其余机械伤害时间表达量与0小时的表达量的比值为相对表达量）。

[0062] <4>激素处理对HbRop5基因的表达影响

[0063] 有研究认为，一些植物激素（如生长素和乙烯）可调控小G蛋白Rop成员基因表达和调控其活性，并且这种调控作用在某些激素调控植物生长发育中发挥核心作用(Moshkov,I.E.,et al.,Ethylene regulates monomeric GTP-binding protein gene expression and activity in Arabidopsis.Plant Physiol,2003.131(4):p.1705-17；Zheng,Z.L.,et al.,Plasma membrane-associated ROP10small GTPase is a specific negative regulator of abscisic acid responses in Arabidopsis.Plant Cell,2002.14(11):p.2787-97)。在橡胶树生产中，在割线或割面上施用乙烯利（乙烯缓释剂）可刺激胶乳产量，已成为现代割胶制度不可或缺的组成部分。

[0064] 本研究选取七种植物激素或生长调节剂（乙烯利、茉莉酸和细胞分裂素6-苄基嘌呤6-BA、生长素、脱落酸、赤霉素和水杨酸），分别涂于橡胶树割线以及割线上方1cm割面处刺激橡胶树（0h、3h、12h，24h）。实时荧光定量PCR结果显示（结果分析同上）：在所测定的三种植物激素（或生长调节剂）中，HbRop5基因的表达显著受细胞分裂素（CTK，6-BA）（图10）的诱导，但是乙烯利（ET）和茉莉酸（JA）对HbRop5基因的表达影响不大（图6和图9）。
其它四种激素处理对HbRop5基因的表达影响不大（图略）。图6、图9、图10中，纵坐标均为HbRop5基因相对表达量，以处理0小时的表达量为1.0，其余处理时间表达量与0小时的表达量的比值为相对表达量。

[0065] <5>机械伤害处理诱导苗期橡胶树次生乳管再生过程中，HbRop5基因的表达变化分析

[0066] 根据参考文献和实际验证，伤害处理可以诱导次生乳管的发生(田维敏,史敏晶,于凤义,吴继林,郝秉中,崔克明:机械伤害和外施茉莉酸对巴西橡胶树次生乳管分化的局部效应及其与茉莉酸分布的关系(英文).Acta Botanica Sinica2003(11):1366-1372；中国热带农业科学院橡胶研究所专利:一种苗期预测橡胶树次生乳管分化能力的方法.2008；J-L,W.和H-B，Z.,Laticifer Differentiation in Hevea brasiliensis:Induction by Exogenous Jasmonic Acid and Linolenic Acid.Annals of Botany,2000.85(1):p.37)。本实验中，利用热研8-79品系（品种审定编号：国审热作
2001001，中国热带农业科学院橡胶研究所培育；中国热带农业科学院橡胶研究所长期有种苗出售）一年生的枝条，用伤害处理的办法诱导次生乳管的形成。该实验分别选取5组枝条，每3株为一组。选取第一蓬叶是古铜期或淡绿期的比较一致的枝条，在第二蓬叶上面的
2
茎段上进行刮伤处理。每株枝条在对称的位置，各相隔1cm刮伤4个1×1cm 的处理面积，共8块处理。分别收集在伤害处理的0天、3天、5天、7天、13天时间后的刮伤处的树皮，提取树皮的RNA，考察这些树皮中五个基因随着wounding处理后在次生乳管分化的同段时间内基因的动态表达变化；并取部分树皮做I-Br处理，跟踪橡胶树次生乳管的诱导情况。结果表明这五个HbRops基因都在伤害处理3天、5天、7天时间内表达水平与处理前相比显著下调，但其表达都是随着时间而递增的，在第13天的表达水平显著增加，超过了处理前的表达水平（图8,随着机械损伤诱导次生乳管的分化过程，HbRop5基因的表达分析，纵坐标作为HbRop5基因相对表达量，以未刮伤处理对照的表达量为1.0，其余机械伤害时间表达量与未刮伤处理对照的表达量的比值为相对表达量）。实践证明，在一年生枝条伤害处理后的第五天或第七天，次生乳管陆续被诱导出来。因此可以认为这些基因的表达随次生乳管的发生而表达增强。

[0067] 根据报道文献可知植物形成层的活动受生长素、细胞分裂素、赤霉素和乙烯利等激素的影响，但是最近的研究结果表明只有细胞分裂素直接影响形成层细胞的径向分化 (Nieminen,K.,et al.,Cytokinin Signaling Regulates Cambial Development in Poplar.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2008.105(50):p.20032-20037)。橡胶树的次生乳管是树皮内形成层细胞随着季节的变化有节奏向外分化形成的，对次生乳管发生影响最大的植物激素是甲基茉莉酸，但是甲基茉莉酸处理并不能加快形成层细胞的分裂(J-L,W.和H-B，Z.,Laticifer Differentiation in Hevea brasiliensis:Induction by Exogenous Jasmonic Acid and Linolenic Acid.Annals of Botany,2000.85(1):p.37)，具体的分子机制还没有人研究过，尽管在2001年刘惠芳等的实验已经证明细胞分裂素对次生乳管的分化也具有协同调控作用(刘惠芳,吴继林与郝秉中,茉莉酸和其它激素对巴西橡胶树乳管分化的协同作用.热带作物学报,2001(3))。

[0068] 从检测HbRop5基因受JA、6-BA、SA和GA等激素的影响的研究结果可以看出，甲基茉莉酸处理对HbRop5基因的表达影响不大（图9）。但是细胞分裂素（6-BA）能显著上调HbRop5基因的表达活性（图10）。通过跟踪观察和分析次生乳管的分化规律以及基因的表达情况，我们可以推测HbRop5基因是很可能是通过调控细胞分裂素的作用而参与橡胶树次生乳管的形成。

[0069] 3.原核表达与重组蛋白的活性分析

[0070] 利用pET28a（刘术金等.橡胶树两个胶乳转化酶基因的原核表达载体构建和表达条件优化热带作物学报.2010年.第7期）构建了HbRop5基因的原核表达载体，具体方法如下：

[0071] <1>含巴西橡胶树HbRop5基因编码区重组载体的获得

[0072] 通过Genetyx软件分析HbRop5基因的编码区限制性内切酶酶切位点，确定两个HbRop5基因编码区修饰用的限制性内切酶（BamHI和HindIII）。设计HbRop5基因编码区引物（5-N:C ATGAGTGCTTCAAAGTTCATTAAA（正义链引物,斜体标注的是BamHI酶切位点),5-S:C CTAAGCAACACAACCTCCACAC（反义链引物,斜体标注的是HindIII酶切位点），以pMD18-HbRop5为模板，进行PCR扩增，扩增程序为：95℃预变性3min；94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸1.5min，共30次循环；72℃延伸10min。该引物对扩增的片段的序列为序列表中序列2的第94-723位核苷酸序列。

[0073] 扩增得到627bp的产物,测序表明该片段的序列为序列表中序列2的第94-723位核苷酸序列。将该片段用与pMD18-T连接，获得pMD-HbNIN2重组质粒，经测序确认扩增序列的正确性。在37℃水浴中，用BamHI和HindIII双切重组质粒，电泳回收627bp左右的目的条带。将该目的片段插入到pET28a质粒（上海佳和生物科技有限公司）的BamHI和HindIII限制性内切酶位点之间，得到重组载体，将重组载体进行酶切和测序鉴定，将鉴定表明正确的含有序列表中序列2的第94-723位核苷酸序列的重组载体命名为pET28a-HbRop5。

[0074] <2>本发明的HbRop5的表达和其功能验证

[0075] 将获得的重组载体pET28a-HbRop5导入E.coli BL21(DE3)中（陆海等.大肠杆菌BL21（DE3）中表达重组蛋白的研究.北京林业大学学报.2001年第23卷第6期），得到重组表达菌，将鉴定正确的重组菌在含50μg/ml卡那霉素的LB培养基中培养至OD600=0.4~0.6,添加IPTG至终浓度为1mM，37℃下诱导培养,2h、4h或7h，以未加IPTG的培养基培养的同样重组菌为对照，离心收集菌体，菌体蛋白进行12%SDS-PAGE电泳检测。结果表明，在IPTG诱导下这个HbRop5基因实现了高效异源表达，并且蛋白在上清液和包涵体中都有表达，表达蛋白的表观分子量与理论分子量相近，大约25.11kDa，（图11A和B），我们利用His标签亲和纯化的方法得到了具有GTP活性的蛋白HbRop5。

[0076] 蛋白表达产物经镍柱纯化后（具体方法参照Clontech公司的 resin产32
品说明书），用 P-标记GTP进行GTP结合活性分析，具体方法参考文献（Yunxia Qin,Feng Shi,Chaorong Tang*.Molecular characterization and expression analysis of cDNAs encoding.four Rab and two Arf GTPases in the latex of Hevea brasiliensis.Plant Physiology and Biochemistry2011，49p：729-737）进行：

[0077] 1）将纯化的目的蛋白点至硝酸纤维素膜上（0.45μm）。膜晾干后，首先用预杂交液（50mM Tris-HCl，5mM MgCl，0.3%（体积百分浓度）Tween20，0.5mM EDTA，5m M DTT，0.3%32
（体积百分浓度）BSA，pH7.5；），30℃预杂交30min。更换预杂交液，加入0.9μl（α－ P）-9
GTP（3000μCimM）（约含10 M GTP），30℃杂交30min。最后以不含BSA的预杂交液30℃洗膜三次，每次5～10min，适当晾干后放射自显影。

[0078] 2）将纯化的目的蛋白点至硝酸纤维素膜上（0.45μm），按照上述方法进行GTP、32 -9
ATP竞争结合试验，试验操作同上。其中（α－ P）GTP终浓度均为10 M,GTP竞争试验中-8 -7 2
分别再加入终浓度为10 、10 M的非同位素标记GTP，即10倍、10 倍的竞争GTP；ATP竞争-7 -6 2 3
试验则分别再加入终浓度为10 、10 M的非同位素标记ATP，即10 倍、10 倍的竞争ATP。我们的定性实验结果表明所表达的重组蛋白HbRop5具有特异的GTP结合活性，因为在存在10倍量的非同位素标记的竞争性GTP的实验条件下，HbRop5对同位素标记的GTP的结合量明显减少；100倍量的非同位素标记的竞争性GTP几乎完全抑制HbRop5对同位素标记的GTP的结合；相反，100倍量和1000倍量的非同位素标记的ATP丝毫不能影响HbRop5对同位素标记的GTP的结合，可见HbRop5是特异地结合GTP，而不结合ATP。因此我们所克隆的这个HbRop5基因编码功能性GTP结合蛋白。

[0079] 4.结论

[0080] 我们首次从橡胶树胶乳中克隆了一个小G蛋白Rop家族成员基因HbRop5的全长cDNA；它具有植物Rop家族基因中典型的结构域特征；表达分析也初步显示它在橡胶树胶乳中会具有多重功能（参与乳管细胞的胁迫抗性应答以及促进橡胶树茎部次生乳管的发生等）。

[0081] 该基因可作为橡胶树转基因育种的重要靶标基因，有望通过调控这个基因的表达来合理调节乳管中活性氧ROS的代谢和调控，增强对TPD等疾病的抗性，促进橡胶树茎干的径向发育，协调橡胶树的营养生长和橡胶生产，从而最大潜力的挖掘橡胶树生产潜力。此外，该基因可作为重要的基因资源，还可能在橡胶树以外的其他木材的高产或抗逆基因工程中得到应用。