一种阿维菌素农药残留降解菌及其生产的菌剂转让专利
申请号 : CN201210181069.X
文献号 : CN102732455B
文献日 : 2013-04-24
发明人 : 魏艳丽 , 李纪顺 , 陈凯 , 周红姿 , 李红梅 , 杨合同
申请人 : 山东省科学院生物研究所
摘要 :
本发明为一种阿维菌素农药残留降解菌及其生产的菌剂，涉及嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus stearothermophilus）AZ11的分离、筛选及用其发酵生产的菌剂及应用。所述菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,保藏号为CGMCC No.6119。使用所述菌株AZ11发酵生产的阿维菌素农药残留降解菌剂可广泛用于土壤、水体中阿维菌素残留污染的修复，也可用于阿维菌素发酵废渣及其他有机肥料原料中的阿维菌素残留的降解，还可以在农业生产中直接喷洒于土壤或植物表面，可有效降解去除阿维菌素农药残留，使用方便，成本低，还可以直接用于阿维菌素废渣的发酵生产过程中，使废渣发酵产品达到无害化、资源化利用。
权利要求 :
1.一种阿维菌素农药残留降解菌株，该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）保藏, 名称为嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus stearothermophilus）AZ11，保藏号为CGMCC NO.6119，保藏日期为2012年5月17日。
2.应用权利要求1所述的阿维菌素农药残留降解菌株AZ11生产阿维菌素残留降解菌剂的方法，其特征在于生产过程如下：斜面、摇瓶种子培养；种子发酵罐发酵培养；生产发酵罐发酵生产；产品剂型加工、分装；具体生产步骤和工艺条件为：
1）将阿维菌素降解菌AZ11斜面保存试管种子，接种至LB液体培养基中，40-45℃振荡培养至对数生长期；
2）将培养好的菌液以10%的接种量接种到10L种子发酵罐中，40-45℃培养至对数生长期，种子发酵罐的培养及配方为：玉米粉2%；豆饼粉1%；葡萄糖0.5%；K2HPO4 0.4%；
MgSO4·7H2O 0.02%；CaCO3 0.2%；pH 7.2-7.5；
3）将种子发酵罐的发酵液以10%的接种量接种到生产发酵罐中发酵生产，发酵生产中使用的培养基配方为：玉米粉3%；豆饼粉2%；CaCO3 0.5%；K2HPO4 0.2%；ZnSO4·5H2O 0.05%；
MgSO4·7H2O 0.05%；pH值7.2；
发酵生产的工艺条件为：培养温度40—45℃，搅拌速度150r/min，罐压为0.04—8
0.06Mpa，无菌空气通气量1:0.8-1，培养48小时菌数达到35×10cfu/mL；
4）发酵完成后，发酵液直接稀释为液体菌剂或用草炭或硅藻土吸附，形成固体菌剂。
3. 如权利要求2所述生产方法制备的阿维菌素残留降解菌剂的应用，其特征在于用于土壤、水体中阿维菌素残留污染的修复。
4. 如权利要求2所述生产方法制备的阿维菌素残留降解菌剂的应用，其特征在于用于阿维菌素发酵废渣及其他有机肥料原料中的阿维菌素残留的降解。
5. 如权利要求2所述生产方法制备的阿维菌素残留降解菌剂的应用，其特征在于在农业生产中直接喷洒于土壤，降解去除阿维菌素农药残留。
说明书 :
一种阿维菌素农药残留降解菌及其生产的菌剂
技术领域
[0001] 本发明涉及一种阿维菌素农药残留降解菌及其生产的菌剂，属于生物技术领域，适用于现代农业生产中绿色无公害农产品的生产与加工。
背景技术
[0002] 农药在农业生产过程中对防治病虫害、提高农作物产量必不可少，然而，农药在广泛使用的同时也给环境造成了严重的污染，使得农业产量和环境质量之间的矛盾日益突出，许多农药对人和非靶动物具有干扰内分泌作用和“三致”作用(致癌、致畸和致突变)。
[0003] 阿维菌素（Avermectins简称AVMs）是由放线菌(Streptomyces avermitilis)产生的一组大环内酯类抗生素，已在很多国家登记使用，在我国已成为甲胺磷等高毒农药的替代品，其单剂和混剂产品在害虫防治工作中发挥着重要作用，广泛适用于蔬菜、果树、棉花和花卉等。
[0004] 近年来，阿维菌素及其复配农药品种和使用量不断增长，但是，由于其被公认属于生物源农药，致使其对土壤和环境的残留污染隐患，一直未被公众重视。但是，按世界卫生组织(WHO)五级分级标准，AVMs仍属高毒化合物，会对环境或生物直接造成影响，而且进入到环境中的药物可能在生物体内富集，并通过食物链的传递而影响到人类的安全，因此AVMS在生物组织中的残留必须引起我们的重视。目前，阿维菌素类药物在农产品或畜产品中的最高残留限量(MRLs)已有规定，欧盟规定AVMs在果蔬产品、谷物等农产品中MRLs为10ug/kg。然而，目前学术界对AVMs残留降解问题研究报道甚少，市场上也没有可以工业化生产和大面积使用的阿维菌素残留降解剂产品问世。
发明内容
[0005] 本发明的目的旨在提供一种阿维菌素农药残留降解菌及用其生产的菌剂。
[0006] 研究表明，微生物对土壤和水环境中残留农药的降解有重要的作用，从自然环境中驯化和筛选出来的土著微生物，对农药有一定的降解作用。本发明人从长期堆放的阿维菌素发酵废渣中，分离、筛选到一株可降解阿维菌素的菌株，经鉴定为嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus stearothermophilus），菌株命名为AZ11。该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）保藏, 名称为嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus stearothermophilus）AZ11，保藏号为CGMCC NO.6119，保藏日期为2012年5月17日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
[0007] 本发明人使用上述嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus stearothermophilus）菌株8
AZ11，经工业化发酵生产过程，制备了阿维菌素农药残留降解菌剂（含菌量30×10cfu/g），该菌剂对阿维菌素残留的降解率达到90%以上，可广泛用于土壤、水体中阿维菌素污染的修复及阿维菌素发酵废渣中残留的降解。
AZ11，经工业化发酵生产过程，制备了阿维菌素农药残留降解菌剂（含菌量30×10cfu/g），该菌剂对阿维菌素残留的降解率达到90%以上，可广泛用于土壤、水体中阿维菌素污染的修复及阿维菌素发酵废渣中残留的降解。
[0008] 本发明的技术方案包括以下方面：
[0009] 本发明提供了一种阿维菌素农药残留降解菌株，该菌株是从长期堆放的阿维菌素发酵废渣中，分离、筛选获得的一株可降解阿维菌素的菌株AZ11，经鉴定为耐高温的嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus stearothermophilus），革兰氏染色为阳性；镜检观察菌体呈杆状，可形成芽孢，芽孢为椭圆形，端生。在LB平板上菌落圆形，灰白色，表面干燥光滑，边缘整齐，半透明；菌株AZ11能在葡萄糖复合琼脂上进行厌氧生长，且能在含7% NaCl肉汤培养基中生长，V.P.试验呈阴性，柠檬酸盐利用试验、卵磷脂酶反应、淀粉水解试验、酪素水解试验均呈阳性反应，甲基红试验、吲哚产生试验和苯丙氨酸脱氨试验呈阴性反应，具有分解葡萄糖、阿拉伯糖、乳糖、甘露醇和木糖的能力，适宜生长pH为7.0-8.0。
[0010] 上述阿维菌素农药残留降解菌剂的生产过程包括如下步骤：
[0011] 斜面、摇瓶种子培养-种子发酵罐发酵培养-生产发酵罐发酵生产-与载体混匀-产品包装。
[0012] 上述阿维菌素残留降解菌剂的具体生产步骤和工艺条件如下：
[0013] 1）将阿维菌素降解菌AZ11斜面保存试管种子，接种至LB液体培养基中，40-45℃振荡培养至对数生长期；
[0014] 2）将培养好的菌液以10%的接种量接种到10L种子发酵罐中，40-45℃培养至对数生长期。种子发酵罐的培养及配方为：玉米粉2%；豆饼粉1%；葡萄糖0.5%；K2HPO4 0.4%；MgSO4·7H2O 0.02%；CaCO3 0.2%；pH 7.2-7.5；
[0015] 3）将种子发酵罐的发酵液以10%的接种量接种到生产发酵罐中发酵生产，发酵生产中使用的培养基配方为：玉米粉3%；豆饼粉2%；CaCO3 0.5%；K2HPO4 0.2%；ZnSO4·5H2O0.05%；MgSO4·7H2O 0.05%；pH值7.2；
[0016] 发酵生产的工艺条件为：培养温度40—45℃，搅拌速度150r/min，罐压为8
0.04—0.06Mpa，无菌空气通气量1:0.8-1，培养48小时菌数达到35×10cfu/mL。
0.04—0.06Mpa，无菌空气通气量1:0.8-1，培养48小时菌数达到35×10cfu/mL。
[0017] 4）发酵完成后，发酵完成后，发酵液可以直接稀释为液体菌剂作为产品使用，8
也可以用草炭或硅藻土吸附，形成固体菌剂，调整菌数为30×10cfu/g，然后分装为袋装产品。。
也可以用草炭或硅藻土吸附，形成固体菌剂，调整菌数为30×10cfu/g，然后分装为袋装产品。。
[0018] 本发明所制备的阿维菌素降解菌剂对阿维菌素残留的降解率达到90%以上，可广泛用于土壤、水体中阿维菌素残留污染的修复，也可用于阿维菌素发酵废渣及其他有机肥料原料中的阿维菌素残留的降解，还可以在农业生产中直接喷洒于土壤或植物表面，可有效降解去除阿维菌素农药残留，使用方便，成本低，可有效降解去除阿维菌素等农药残留，去除率达到97%以上；还可以直接用于阿维菌素废渣的发酵生产过程中，使废渣发酵产品达到无害化、资源化利用。
[0019] 本发明对于保护环境、土壤及水体污染修复和减少农产品农药残留，改善农产品品质具有重要的意义，适合用于无公害绿色农产品的生产及利用阿维菌素发酵废渣进行无残留生物有机肥料的生产应用。
附图说明
[0020] 图1为添加外源营养物质对阿维菌素降解的影响
[0021] 图2为不同浓度阿维菌素对菌株AZ11生长的影响
[0022] 图3 为阿维菌素对温室盆栽模拟污染土壤的降解效果。
具体实施方式
[0023] 以下实施例是对本发明的进一步说明，但本发明并不局限于此。
[0024] 实施例1：降解菌株的分离
[0025] 取阿维菌素发酵废渣样品10g，加入装有90mL无菌水的三角瓶中（250mL规格，内装玻璃珠）。振荡15min，静止澄清后，取1mL上清加入99mL基础培养基，分别置40℃、50℃、60℃恒温箱中，150r/min振荡培养。3天为一周期进行驯化，共5个周期，阿维菌素浓度设置为：25mg/L、50mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L，每个驯化周期逐步提高。将每次的驯化-1 -2 -3
培养液按照10 、10 和10 稀释度涂布基础培养基平板（作为对照）及含阿维菌素的选择培养基平板，挑选生长速度快且能以阿维菌素为唯一碳源的单菌落进一步分离纯化，直至有单菌落出现。
培养液按照10 、10 和10 稀释度涂布基础培养基平板（作为对照）及含阿维菌素的选择培养基平板，挑选生长速度快且能以阿维菌素为唯一碳源的单菌落进一步分离纯化，直至有单菌落出现。
[0026] 将生长良好的菌株，摇菌培养后，接种到含阿维菌素(浓度为100mg/L)的基础培养基中，置于40℃、50℃和60℃摇床中，150r/min振荡培养，设不接菌的处理为对照，每处理重复3次。分别于接种后6h、12h、24h、48h、72h取培养液，4℃，10000r/min离心5min，取上清液2mL，用HPLC方法测定阿维菌素含量，计算降解率。降解率(%)=(对照样品残留量-处理样品残留量)/对照样品残留量×100%。
[0027]
[0028] 结果从阿维菌素药渣样品中通过富集培养，共分离到6株能以阿维菌素作为唯一碳源生长的细菌，分别命名为AZ11、AZ12、AZ13、AZ14、AZ15、AZ16，如表1。经进一步筛选获得一株降解率较高的菌株AZ11，该菌株是从阿维菌素发酵废渣堆的85cm处的样品中筛选得到的，72小时对阿维菌素的降解率达到87.6%。
[0029] 实施例2：菌株AZ11对阿维菌素的降解活性
[0030] 将阿维菌素高效降解菌株AZ11于40℃，150r/min液体发酵培养，调整菌数为9
10cfu/mL，制成菌悬液。在含有100mg/L阿维菌素的基础盐培养基中分别添加10g/L的葡萄糖、蛋白胨和酵母膏，研究添加外源营养物质对AZ11降解阿维菌素的影响，按1%的量接种菌悬液，培养48h后取样测定样品中阿维菌素含量。另外，在基础盐培养基（加入500mg/L葡萄糖）中添加阿维菌素溶液使其浓度分别至l00、200、300、400、500、600和700 mg/L，按
1%接种量接种AZ11菌悬液，50℃培养36h后取样测定OD660值，研究菌株AZ11对阿维菌素的耐受。
10cfu/mL，制成菌悬液。在含有100mg/L阿维菌素的基础盐培养基中分别添加10g/L的葡萄糖、蛋白胨和酵母膏，研究添加外源营养物质对AZ11降解阿维菌素的影响，按1%的量接种菌悬液，培养48h后取样测定样品中阿维菌素含量。另外，在基础盐培养基（加入500mg/L葡萄糖）中添加阿维菌素溶液使其浓度分别至l00、200、300、400、500、600和700 mg/L，按
1%接种量接种AZ11菌悬液，50℃培养36h后取样测定OD660值，研究菌株AZ11对阿维菌素的耐受。
[0031] 结果从图1可以看出，外源营养物质的添加对阿维菌素的降解没有影响，说明菌株可以在不依赖外源C源的情况下降解阿维菌素。
[0032] 从图2中可以看出阿维菌素浓度低于800mg/L时，对菌株AZ11的生长没有明显的抑制作用，大于800mg/L的浓度开始影响AZ11的生长，推测可能产生了高浓度中间代谢产物，抑制了菌株的代谢生长。在低于600mg/L时，对菌株生长影响不大，36h摇床培养发酵液菌数OD660维持在1.0左右，表明该菌株能够在较高浓度下很好地降解阿维菌素，适宜于环境中的高浓度阿维菌素残留的降解。
[0033] 实施例3：阿维菌素农药残留降解菌剂的制备
[0034] 将阿维菌素降解菌AZ11斜面保存种活化，接种于LB液体培养基中，40-45℃振荡培养至对数生长期，接种种子发酵罐，种子发酵罐的配方为：玉米粉2%；豆饼粉1%；葡萄糖0.5%；K2HPO4 0.4%；MgSO4·7H2O 0.02%；CaCO3 0.2%； pH 7.2-7.5。121℃高压湿热灭菌，冷却至45℃左右时将摇瓶培养好的菌种以10%的接种量接种到10L种子罐中，培养到对数生长期。种子发酵罐的发酵液以10%的接种量接种到生产发酵罐中，培养基配方为：玉米粉
3%；豆饼粉2%；CaCO3 0.5%；K2HPO4 0.2%；ZnSO4·5H2O 0.05%；MgSO4·7H2O 0.05%；pH值7.2；
3%；豆饼粉2%；CaCO3 0.5%；K2HPO4 0.2%；ZnSO4·5H2O 0.05%；MgSO4·7H2O 0.05%；pH值7.2；
[0035] 以上发酵罐的培养条件为：培养温度40—45℃，搅拌速度150r/min，罐压为8
0.04—0.06Mpa，无菌空气通气量1:0.8-1，培养48小时菌数达到35×10cfu/mL。发酵完
8
成后，用草炭或硅藻土吸附，形成固体剂型，调整菌数为30×10cfu/g，然后分装，装袋形成产品。
0.04—0.06Mpa，无菌空气通气量1:0.8-1，培养48小时菌数达到35×10cfu/mL。发酵完
8
成后，用草炭或硅藻土吸附，形成固体剂型，调整菌数为30×10cfu/g，然后分装，装袋形成产品。
[0036] 实施例4：阿维菌素农药残留降解菌剂的盆栽应用试验
[0037] 取蔬菜地土壤，自然风干，过20目筛，进行灭菌处理。灭菌及未灭菌的土壤按-150mg·kg 干土的量加入阿维菌素，搅拌均匀，过夜。花盆消毒后，每盆装入1000g，未灭菌
9 -1
土壤也同样装盆，作为模拟试验污染土壤。每盆撒播辣椒种子10粒，然后按10 个细胞·g干土的量加入降解菌剂，保持土壤的含水量在40%左右，温室培养，辣椒出苗后每盆保持苗数相当。分别于0d、1d、5d、10d、15d、20d取土层同等深度的样品，进行测定。以不接菌的土壤作为对照。每个处理三个重复。降解率=（对照阿维菌素残留量—样品阿维菌素残留量）/对照阿维菌素残留量×100%。
9 -1
土壤也同样装盆，作为模拟试验污染土壤。每盆撒播辣椒种子10粒，然后按10 个细胞·g干土的量加入降解菌剂，保持土壤的含水量在40%左右，温室培养，辣椒出苗后每盆保持苗数相当。分别于0d、1d、5d、10d、15d、20d取土层同等深度的样品，进行测定。以不接菌的土壤作为对照。每个处理三个重复。降解率=（对照阿维菌素残留量—样品阿维菌素残留量）/对照阿维菌素残留量×100%。
[0038] 从图3可以看出，接入降解菌剂后，土壤中的阿维菌素降解很快，第1天降解率就达到80%，在自然土中降解率稍高于灭菌土，达到82%，第5天达到90%，以后降解速率减慢，因为土壤中的阿维菌素量已经很低，降解菌与农药之间的接触机会下降。20天后基本降解完全。整个降解过程中，阿维菌素在自然土中的降解率稍高于灭菌土中的降解率，因为自然土中存在的微生物起到了加速降解的作用；而不接降解菌剂的对照土壤中，阿维菌素的降解效率较低，20天后的降解率仅为19.8%。