一株嗜热兼氧菌UTM601及其应用转让专利
申请号 : CN201210226967.2
文献号 : CN102732465B
文献日 : 2013-03-27
发明人 : 刘永跃 , 周顺桂 , 许宜北 , 汪涌
申请人 : 大地绿源环保科技(北京)有限公司
摘要 :
本发明提供了一株嗜热兼氧菌（Anoxybacillus pushchinoensis）UTM601，其保藏编号为CGMCC No.5929，该菌株UTM601在50-70℃的微氧与好氧环境中均生长良好，具有能较好的适应温度高、氧含量分布不均一的堆肥高温期环境、快速降解有机物质的特点。本发明还提供了利用该菌株制备堆肥接种剂的方法。本发明菌株以有机废物为载体，制备固态微生物堆肥接种剂，成本低，应用于堆肥时不会对物料水分产生影响。利用本发明固态微生物堆肥接种剂进行高温堆肥，可在较低的多水平通风量下，实现物料的高温发酵，避免了堆肥过程中复杂的通风管理控制问题，具有操作简单、节能的特点。
权利要求 :
1.普西诺厌氧芽孢杆菌（Anoxybacillus pushchinoensis）菌株UTM601，其保藏编号为CGMCC No.5929。
2.权利要求1所述的普西诺厌氧芽孢杆菌UTM601或其发酵产物在堆肥中的应用。
3.权利要求1所述的普西诺厌氧芽孢杆菌UTM601或其发酵产物在制备堆肥接种剂中的应用。
4.含有权利要求1所述普西诺厌氧芽孢杆菌UTM601的堆肥接种剂。
5.一种制备权利要求4所述堆肥接种剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）菌种活化：取权利要求1所述普西诺厌氧芽孢杆菌菌株UTM601的菌种接种于培养基，在50-60℃条件下培养1-3d，使种子液的OD600为0.5-1.2；
2）发酵种子液制备：将活化的菌种接种于液体培养基中，制备种子液，再将种子液扩大培养，制得发酵种子液；
3）将湿料和干料混合均匀得混合物料，将混合物料平铺厚度为10-25cm，取步骤2）的发酵种子液与糖蜜的混合溶液泼洒在混合物物料上，再覆盖混合物料10-25cm，按前述方法泼洒发酵种子液与糖蜜的混合溶液，如此重复，至混合物料层堆达50-150cm后，盖上透气性覆盖物，待温度升至55-70℃时，每隔3-6d搅拌1次，直至发酵温度降至环境温度，停止发酵，将发酵产物烘干制得堆肥接种剂。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤2）所述的种子液的培养条件为50-60℃震荡培养，转速为50-200r/min，待种子液的OD600为1-2时，停止培养；所述的发酵种子液的培养方法为：将种子液按体积比5%-20%接种于液体培养基扩大发酵培养，培养条件为温度
50-60℃，间隔4-8h通气10-30min，通气量体积比0.3~0.8:1，100-200rpm搅拌，培养2-6天发酵种子液的OD600在2-3之间停止发酵，得发酵种子液。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤3）所述混合物料的碳氮比为20-30，含水率为35%-45%。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤3）所述发酵种子液与糖蜜的混合溶液泼洒在混合物料上的方法是：取混合物料重量0.5%-1%的糖蜜按质量比1:2与步骤2）制得的发酵种子液混合，再按质量比1:3与水混合，然后将混合溶液均匀泼洒在混合物料上。
9.权利要求4所述的堆肥接种剂在堆肥中的应用。
10.权利要求9所述的应用，其特征在于，将堆肥接种剂按重量比10%-20%与物料混合，添加辅料，使混合物料碳氮比为20-30，含水率50-60%，进行堆肥。
说明书 :
一株嗜热兼氧菌UTM601及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及环境微生物技术领域，具体地，涉及一种嗜热兼氧菌菌株UTM601及其在高温堆肥中的应用。
背景技术
[0002] 堆肥化是在微生物作用下通过高温发酵使有机物矿质化、腐殖化和无害化而变成腐熟肥料的过程。高温堆肥作为一种微生物学过程，依赖于具一定数量及活力的微生物源。随着堆肥的产业化、商品化，微生物接菌剂已经成为一项重要的技术而被应用。 [0003] 目前，高温堆肥采用的发酵工艺一般为好氧发酵，微生物接种剂也主要是中温好氧菌。好氧发酵必须维持一定的氧浓度。但堆肥是一个复杂系统，对于不同混料比例、堆体的不同部位，鼓风过程的影响范围和程度都会随之变化，即便是相同的通风量下，堆体中不同部位的氧含量分布也不一致，这就使得在实际操作中难以把握适当的通风量：通风量过小，微生物无法获得足够的氧气，活性降低，甚至会处于厌氧状态，堆肥反应进程缓慢；通风量过大，堆体的温度不容易积累，难以保证无害化效果，也影响堆肥的正常进程，且增加能耗，氮素大量损失，降低发酵产物的肥料效益。尤其是在50℃-70℃的堆肥高温期环境中，常用微生物接种剂的活性还受到温度的抑制。
[0004] 嗜热兼氧菌具有嗜热、兼性厌氧，较中温菌，具有更高的有机物降解活性和更快的代谢速率的优点，可提高有机物质的降解速率，缩短工艺运行时间，在有机废物资源化利用领域中具有潜在的应用价值。将嗜热兼氧菌作为接种剂应用于堆肥，将有效解决以上问题，促进堆肥进程。但目前还未见到关于嗜热兼氧菌作为接种剂应用于高温堆肥的公开报告。 发明内容
[0005] 本发明的目的在于提供一种嗜热兼氧菌（Anoxybacillus pushchinoensis）及其应用。
[0006] 本发明菌株UTM601是从采自大地绿源环保科技（北京）有限公司堆肥发酵车间的高温期污泥堆肥样品中，在40℃下，经微氧传代驯化，分离纯化、需氧性生长性能测试、降解性能比较试验筛选后得到的Anoxybacillus sp.菌株，命名为UTM601。该菌株已于2012年3月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），分类命名为Anoxybacillus pushchinoensis，保藏号CGMCC No.5929。
[0007] 本发明菌株UTM601具有如下特性：
[0008] UTM601在NA培养基（牛肉膏3-5g，蛋白胨6-10g，氯化钠3-5g，琼脂14-18g，植物凝胶7-9g，蒸馏水1000ml，pH7.2）上菌落特征是：形态为不规则状，表面湿润，浅黄色，啮蚀状，扁平，生长迅速，50-70℃培养下36小时菌落直径约3mm。利用引物引物为27f：5′-AGA GTT
[0009] TGA TCC TGG CTC AG-3′和1492r：5′-GGT TAC CTT GTT ACG ACTT-3′经PCR扩增该菌株的16S rRNA基因序列，获得序列提交到EzTaxon数据库(http://www.eztaxon.Torg/)进行同源性比对，结果显示与Anoxybacillus pushchinoensis K-1 相似性最高，为
98.80%，此序列是鉴定该菌株的主要特征依据。其次是上述菌株在微氧条件下生长良好和具有快速降解淀粉的特性为鉴别该菌株的次要特征。
98.80%，此序列是鉴定该菌株的主要特征依据。其次是上述菌株在微氧条件下生长良好和具有快速降解淀粉的特性为鉴别该菌株的次要特征。
[0010] 上述嗜热兼氧菌UTM601的富集驯化方法是：高温期污泥堆肥样品10g加入到90ml的无菌水中，在200rpm的摇床上摇30分钟，然后取出静置30分钟，取10ml上清液接到90ml的NA培养液中，置于水浴摇床上，在60℃下，变速驯化培养：以每6小时为一个时间单位，以50rpm为变速单位，逐步增加转速，直到达到150rpm后，同理逐步减小转速，此为一个驯化周期；当完成3个驯化周期后，取 10ml驯化液转接至新的NA培养液中，继续驯化培养，如此传代3次。
[0011] 上述嗜热兼氧菌UTM601的需氧性能测试筛选方法是：按接种量5%向已灭菌的装有50ml、100ml、150ml、200ml、250ml NA培养液的250ml三角瓶进行接种，在60℃下静置培养3天，检测培养液的OD600。
[0012] 上述嗜热兼氧菌UTM601的降解特性的筛选方法是：取在NA平板上活化培养的菌株，点接于降解培养基上，在60℃下培养至菌落丰厚，后滴加2%碘液观察有无透明圈及透明圈的大小，并用游标卡尺测定透明圈直径（D）和菌落直径（d）。分解能力大小按公式Up=（D/d）2来判断，单位为毫米（mm），Up越大，表示分解能力越大。在降解培养基上传代培养4代，观察每代菌的Up情况，淘汰降解能力不稳定菌株，得到降解能力大且稳定的菌株。降解培养基的配方是10g蛋白胨，3g牛肉膏，5g NaCl，2g可溶性淀粉，16g琼脂，1000ml蒸馏水，pH 7.0-7.2。
[0013] 本发明提供了含有嗜热兼氧菌UTM601的菌剂。
[0014] 本发明提供了嗜热兼氧菌UTM601或其发酵产物在污泥堆肥中的应用。 [0015] 本发明提供了嗜热兼氧菌UTM601或其发酵产物在制备堆肥接种剂中的应用。 [0016] 本发明提供的制备堆肥接种剂的方法，包括以下步骤：
[0017] 1）菌种活化：取嗜热兼氧菌菌株UTM601的菌种接种于培养基，在50-60℃条件下培养1-3d，使种子液的OD600为0.5-1.2；
[0018] 2）发酵种子液制备：将活化的菌种接种于液体培养基中，制备种子液，再将种子液扩大培养，制得发酵种子液；
[0019] 3）将湿料和干料混合均匀得混合物料，将混合物料平铺厚度为10-25cm，取步骤2）的发酵种子液与糖蜜的混合溶液泼洒在混合物 物料上，再覆盖混合物料10-25cm，按前述方法泼洒发酵种子液与糖蜜的混合溶液，如此重复，至混合物料层堆达50-150cm后，盖上透气性覆盖物，待温度升至55-70℃时，每隔3-6d搅拌1次，直至发酵温度降至环境温度，停止发酵，将发酵产物烘干制得堆肥接种剂。
[0020] 所述的湿料为畜禽粪便。
[0021] 所述的干料为花生壳粉、豆粕和/或锯木屑。
[0022] 其中步骤2）所述的种子液的培养条件为50-60℃震荡培养，转速为50-200r/min，待种子液的OD600为1-2时，停止培养；所述的发酵种子液的培养方法为：将种子液按体积比5%-20%接种于液体培养基扩大发酵培养，培养条件为温度50-60℃，间隔4-8h通气10-30min，通气量体积比0.3~0.8:1，100-200rpm搅拌，培养2-6天发酵种子液的OD600在
2-3之间停止发酵，得发酵种子液。
2-3之间停止发酵，得发酵种子液。
[0023] 其中，步骤3）所述混合物料的碳氮比为20-30，含水率为35%-45%。 [0024] 其中，步骤3）所述发酵种子液与糖蜜的混合溶液泼洒在混合物料上的方法是：取混合物料重量0.5%-1%的糖蜜按质量比1:2与步骤2）制得的发酵种子液混合，再按质量比1:3与水混合，然后将混合溶液均匀泼洒在混合物料上。
[0025] 在本发明的实施例中，使用的培养基为NA培养基（牛肉膏3-5g，蛋白胨6-10g，氯化钠3-5g，琼脂14-18g，植物凝胶7-9g，蒸馏水1000ml，pH7.2）。
[0026] 本发明还提供了上述含有UTM601菌株的堆肥接种剂在堆肥中的应用。 [0027] 具体地，将堆肥接种剂按重量比10%-20%与物料混合，添加辅料，使混合物料碳氮比为20-30，含水率50-60%，进行堆肥。
[0028] 本发明从腐熟的污泥堆肥样品中分离筛选到一种嗜热兼氧菌株，该菌株UTM601在50-70℃的微氧与好氧环境中均生长良好，具有能 较好的适应温度高、氧含量分布不均一的堆肥高温期环境，快速降解有机物质的特点。本发明利用该菌株以有机废物为载体，制备固态微生物堆肥接种剂，成本低，应用于堆肥时不会对物料水分产生影响。利用本发明的固态微生物堆肥接种剂进行高温堆肥，可在较低的多水平通风量下，实现物料的高温发酵，避免了堆肥过程中复杂的通风管理控制问题，具有操作简单、节能的特点。 具体实施方式
[0029] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。 [0030] 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。 [0031] 实施例1嗜热兼氧菌UTM601的分离和鉴定
[0032] 称取10g高温期污泥堆肥样品（采自大地绿源环保科技（北京）有限公司堆肥发酵车间）置于装有10粒玻璃珠和90ml无菌水的250ml三角瓶中，在200rpm的摇床上摇30分钟，然后取出静置30分钟，取10ml上清液接到90ml的NA培养液（牛肉膏4g，蛋白胨8g，氯化钠4g，琼脂16g，植物凝胶8g，蒸馏水1000ml，pH7.2）中，置于水浴摇床上，在60℃下，变速驯化培养：以每6小时为一个时间单位，以50rpm为变速单位，逐步增加转速，直到达到150rpm后，同理逐步减小转速，此为一个驯化周期；当完成3个驯化周期后，取10ml驯化液转接至新的NA培养液中，继续驯化培养，如此传代3次。
[0033] 分别取驯化后的菌悬液1mL，加入到9mL无菌水中，以梯度稀释法制成10-1，10-2，-3 -4 -5 -6 -710 ，10 ，10 ，10 ，10 的稀释度，取0.1mL平板涂布，每个稀释度涂布于3个NA培养基平板上。取1mL的无菌水做上述同样的操作，作为对照处理。在60℃下培养2天，选择 菌落分散较好的平板（在一定的稀释度下的平板），挑取生长旺盛的单菌落，在NA培养基上，反复划线分离纯化3次，再将形态一致的菌落制片，进行简单染色，在油镜下观察菌体形态，多视野下观察菌体细胞形态，确认菌体形态一致后，接种至LB斜面培养至丰厚，得纯化的嗜热菌株，在4℃下保存，备用。
[0034] 取上述纯化的嗜热菌株，在NA液体培养基中活化培养至OD600为0.8-1.0，然后按体积比5%的接种量向已灭菌的装有50ml、100ml、150ml、200ml、250ml NA培养液的250ml三角瓶进行接种，在60℃下静置培养3天，检测培养液的OD600。分解各菌在不同装液量下的OD600，选择OD600较大且受装液量影响小的菌株，作为目标嗜热兼氧菌株。 [0035] 取上述嗜热兼氧菌株经在NA平板上活化培养36小时后，点接于降解培养基（10g蛋白胨，3g牛肉膏，5g NaCl，2g可溶性淀粉，16g琼脂，1000ml蒸馏水，pH7.2）上，在60℃下培养至菌落丰厚，后滴加2%碘液观察有无透明圈及透明圈的大小，并用游标卡尺测定透明圈直径（D）和菌落直径（d）。分解能力大小按公式Up=（D/d）2来判断，单位为毫米（mm），Up越大，表示分解能力越大。在降解培养基上传代培养4代，计算与分析每代菌的Up情况，淘汰降解能力不稳定菌株，得到降解能力大且稳定的菌株，从中选出取Up值最大的菌株作为目标嗜热微氧降解株，并编号为UTM601。
[0036] UTM601在NA培养基（牛肉膏3-5g，蛋白胨6-10g，氯化钠3-5g，琼脂14-18g，植物凝胶7-9g，蒸馏水1000ml，pH7.2）上菌落特征是：形态为不规则状，表面湿润，浅黄色，啮蚀状，扁平，生长迅速，50-70℃培养下36小时菌落直径约3mm。
[0037] 以UTM601的DNA为模板，PCR扩增其16S rRNA序列，引物为（27f）：5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′和（1492r）：5′-GGTTAC CTT GTTACGACT T-3′。PCR反应程序为：95℃预变性5min， 95℃变性30s，53℃退火45s，72℃延伸90s，30个循环，72℃延伸10min。
扩增产物经电泳检测其纯度后测序，测序结果见序列表SEQ ID No.1所示。获得的16S rRNA基因序列通过EzTaxon数据库(http://www.eztaxon.org/)进行比对，结果显示其与Anoxybacillus pushchinoensis K-1T相似性最高，为98.80%，把该菌株命名为UTM601，并于2012年3月22日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101）保藏，分类命名为Anoxybacillus pushchinoensis，保藏号为CGMCC No.5929。
扩增产物经电泳检测其纯度后测序，测序结果见序列表SEQ ID No.1所示。获得的16S rRNA基因序列通过EzTaxon数据库(http://www.eztaxon.org/)进行比对，结果显示其与Anoxybacillus pushchinoensis K-1T相似性最高，为98.80%，把该菌株命名为UTM601，并于2012年3月22日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101）保藏，分类命名为Anoxybacillus pushchinoensis，保藏号为CGMCC No.5929。
[0038] 实施例2堆肥接种剂的制备（1）
[0039] （1）制备活化液：取本发明微生物UTM601的4℃保存斜面1支接种至5支装有10ml的已灭菌的NA液体培养液试管，在55℃的恒温水浴中培养1.5天得斜面活化菌液。斜面活化菌液的OD600为0.8。
[0040] （2）制备种子液：上述斜面活化菌液试管1支接种至1L无菌NA液体培养液中，在水浴摇床上震荡培养，培养温度55℃，振荡频率50rpm，培养3天后得种子液。种子液的OD600为1.2。
[0041] （3）发酵种子液的制备：上述种子液按5%（v/v）的接种量接种至已灭菌的发酵罐中，进行扩大发酵培养。扩大发酵培养的条件是：温度55℃，间隔4小时通气15分钟，通气量体积比0.5:1，200rpm搅拌，培养4天得发酵种子液。发酵种子液的OD600为2.5。 [0042] （4）以鸡粪便为湿料，花生壳粉为干料，将湿料和干料混合均匀得混合物料，使碳氮比为28，含水率为40%，将混合物料平铺于水泥地面厚度为10cm，取混合物料重量0.5%的糖蜜按质量比1:2与步骤2）制得的发酵种子液混合，再按质量比1:3与水混合，然后将混合溶液均匀泼洒在混合物料上。再覆盖混合物料10cm，按前述方法泼洒发酵种子液与糖蜜的混合溶液，如此重复，至混合物料层堆达50cm后，盖上草帘，待温度升至55℃时，每隔6d搅拌1次，直至发酵温度降至环境温度，停止发酵，将发酵产物干燥制得固态堆肥接种剂。 [0043] 实施例3堆肥接种剂的制备（2）
[0044] （1）制备活化液，培养条件是：取本发明微生物UTM601的4℃保存斜面1支接种至5支装有10ml的已灭菌的NA液体培养基试管，50℃的恒温水浴中培养2天，斜面活化菌液的OD600为1.2。
[0045] （2）制备种子液，培养温度50℃，振荡频率160rpm，培养4天后得种子液，种子液的OD600为1.5。
[0046] （3）发酵种子液的制备中，上述种子液的接种量为15%（v/v），扩大发酵培养的条件是：温度50℃，间隔5小时通气20分钟，通气量体积比0.3:1，160rpm搅拌，培养2天得发酵种子液。发酵种子液的OD600为2。
[0047] （4）以猪粪便为湿料，豆粕为干料，将湿料和干料混合均匀得混合物料，使碳氮比为20，含水率为35%，将混合物料平铺于水泥地面厚度为18cm，取混合物料重量1%的糖蜜按质量比1:2与步骤2）制得的发酵种子液混合，再按质量比1:3与水混合，然后将混合溶液均匀泼洒在混合物料上。再覆盖混合物料18cm，按前述方法泼洒发酵种子液与糖蜜的混合溶液，如此重复，至混合物料层堆达90cm后，盖上草席，待温度升至62℃时，每隔5d搅拌1次，直至发酵温度降至环境温度，停止发酵，将发酵产物干燥制得固态堆肥接种剂。 [0048] 实施例4堆肥接种剂的制备（3）
[0049] （1）制备活化液，培养条件是：取本发明微生物UTM601的4℃保存斜面1支接种至5支装有10ml的已灭菌的NA液体培养液试管，60℃的恒温水浴中培养1天，斜面活化菌液的OD600为0.5。
[0050] （2）制备种子液，培养温度60℃，振荡频率200rpm，培养2天后得种子液，种子液的OD600为1。
[0051] （3）发酵种子液的制备中，上述种子液的接种量为20%（v/v）， 扩大发酵培养的条件是：温度60℃，间隔8小时通气30分钟，通气量体积比0.8:1，100rpm搅拌，培养6天得发酵种子液。发酵种子液的OD600为3。
[0052] （4）以牛粪便为湿料，锯木屑粉为干料，将湿料和干料混合均匀得混合物料，使碳氮比为30，含水率为45%，将混合物料平铺于水泥地面厚度为25cm，取混合物料重量0.8%的糖蜜按质量比1:2与步骤2）制得的发酵种子液混合，再按质量比1:3与水混合，然后将混合溶液均匀泼洒在混合物料上。再覆盖混合物料25cm，按前述方法泼洒发酵种子液与糖蜜的混合溶液，如此重复，至混合物料层堆达150cm后，盖上透气性覆盖物，待温度升至70℃时，每隔3d搅拌1次，直至发酵温度降至环境温度，停止发酵，将发酵产物干燥制得固态堆肥接种剂。
[0053] 实施例5堆肥接种剂的应用
[0054] 取10吨实施例2制备的堆肥接种剂与60吨生污泥、20吨花生壳粉充分混合后进行堆置发酵。同时以不添加本发明堆肥接种剂为对照，进行实验。堆肥时间为30天，期间每天检测堆体温度，间隔5天翻堆一次，待堆温达到65℃时翻堆；每5天于位于堆体表层15㎝处，按5点采样法的原则取样并充分混匀后，检测堆肥腐熟度指标，对堆肥结束时样品还检测其养分等理化指标。结果分析如下：
[0055] 表1实施例2的堆肥接种剂对堆肥温度的影响分析
[0056]
[0057] 表2实施例2的堆肥接种剂接种剂对堆肥腐熟度的影响
[0058]
[0059] 表1和表2表明，与不接种组处理相比，接种实施例2的堆肥接种剂不但可明显提高堆肥前期发酵升温，提高堆肥温度，而且高温持续时间长，堆肥反应速率加快，降低物料的植物毒性，提高物料的无害化程度，缩短堆肥发酵周期，促进堆肥快速腐熟。 [0060] 表3堆肥后的养分指标
[0061]
[0062] 表3表明，接种与不接种相比，养分含量增加，水分减少，利于堆肥产品后期烘干造粒和优质高效有机肥的产生。
[0063] 按照上述同样的方法，采用实施例3和4制备的固体堆肥接种剂进行堆肥应用，也获得了上述类似的试验效果。说明本发明提供的嗜热兼氧菌UTM601制得的堆肥接种剂能够使堆体快速起温，迅速进入高温阶段，并维持长时间高温，有利于有机物的快速降解和腐熟进程，降低物料的植物毒性，提高物料的无害化程度，缩短堆肥发酵周期，促进堆肥快速腐熟，提高了堆肥的质量和发酵效率。