以海水白点虫制动抗原互补脱氧核糖核酸生产的疫苗及其制造方法及用途

摘要

本发明提供一种优化(optimize)海水白点虫制动抗原互补脱氧核糖核酸(cDNA)序列，其是透过置换密码子使该序列能于原核生物及真核生物中表达，并且能产生免疫原性与海水白点虫纤毛幼虫纯化出的制动抗原相近的蛋白质。本发明进一步提供一以该cDNA制造的DNA疫苗预防鱼类受海水白点虫感染。

权利要求

1.一优化的海水白点虫制动抗原互补脱氧核糖核酸序列，其序列为SEQ IDNO:10所示的核苷酸序列。

2.一载体，其包含如权利要求1所述的优化的海水白点虫制动抗原cDNA序列。

3.一种核酸疫苗，所述核酸疫苗为DNA疫苗，其包含如权利要求1所述的优化的海水白点虫制动抗原cDNA序列。

4.如权利要求3所述的核酸疫苗，其是以几丁聚糖纳米颗粒包裹。

5.一种优化的海水白点虫制动抗原cDNA序列用于制备针对海水白点虫的抗体的用途，其特征在于将包含SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列的载体使用于一鱼类，促使该鱼类产生抗体对所述核苷酸序列转译出的蛋白质发生凝集反应后，取得该针对海水白点虫的抗体；其中该鱼类为黑鲷、异臂花鮨、红点九刺鮨、青星九刺鮨、细点牙鲷、欧洲海鲈、尖吻重牙鲷、单斑重牙鲷、青石斑、点带石斑、鞍带石斑、三斑石斑、黑毛瓜子腊、臀斑髭鲷、棘箱鲀、大黄鱼、尖吻鲈、银纹笛鲷、赤鳍笛鲷、白星笛鲷、角鳞鲀、真鲷、花软唇、茉莉花鳉、魔鬼蓑鲉、黄锡鲷、金钱鱼、红甘鲹、银篮子鱼、金头鲷、布氏鲳鲹、海鲡、青甘鲹、克氏海葵鱼、白条海葵鱼、鞍斑海葵鱼或眼斑海葵鱼。

6.如权利要求5所述的用途，其中该载体是以几丁聚糖包裹成纳米颗粒。

7.如权利要求5所述的用途，其中将该载体使用于该鱼类的方式可为混入饲料或食饵中、混入水中浸泡该鱼类或注射该鱼类。

说明书

以海水白点虫制动抗原互补脱氧核糖核酸生产的疫苗及其

制造方法及用途

技术领域

[0001] 本发明提供一优化的海水白点虫制动抗原互补脱氧核糖核酸(cDNA)，及包含其之载体、以其生产的疫苗及其制造方法及用途。

背景技术

[0002] 周纤毛虫类原生动物寄生虫海水白点虫(Cryptocaryon irritans)是造成多种海水鱼类感染海水白点病的致病生物，野生鱼类、观赏鱼类或养殖鱼类都有可能遭受感染。目前海水白点虫已是鱼类养殖场常见的寄生虫，其被认为是造成最严重渔业经济损害的寄生虫的一，不只亚洲养殖渔业(包括中国、台湾、日本、韩国、印度及其他亚洲国家)受到海水白点虫的威胁，澳洲、波斯湾、以色列红海、加勒比海等地亦有海水白点虫的踪迹，造成海水养殖渔业巨大的经济损失。虽然可使用化学药剂预防或治疗受海水白点虫感染的鱼类，但其会造成严重的海洋污染，且对人类健康有危害。

[0003] 海水白点虫的生命周期以四个阶段组成：营养体(trophont)期、原分裂前体(protomont)期、分裂囊胞体(tomonts cyst)期及纤毛幼虫(theront)期，早期有关与海水白点虫分属动物分类学上不同门(phylum)的淡水白点虫(Ichthyophthirius multifiliis)的研究显示体液免疫可藉由制动(immobilize)纤毛幼虫达到预防感染的效果。有许多研究指出鱼类血液免疫及皮肤黏膜免疫在对抗海水白点虫上扮演重要角色，对海水白点虫的细胞免疫可由自然受感染鱼体的感染部位上的白血球渗入(Infiltration)及海水白点虫营养体上CD8+白血球定位(localization)窥知，而对海水白点虫的非专一细胞免疫反应如外围血的嗜酸性白血球(eosinophil)数量降低及表皮层的黏膜细胞增生也在石斑鱼中被发现。

[0004] 许多研究指出对于海水白点虫营养体、原分裂前体及纤毛幼虫的免疫作用可在受感染鱼体中诱发更强的保护免疫力(protective immunity)，其中纤毛幼虫期可提供较强的保护免疫力。由于海水白点虫是一绝对寄生虫，作为疫苗的纤毛幼虫仅能从受感染鱼体中得到，因此要搜集到足够量的活体纤毛幼虫用于生产疫苗相当费时费力且不切实际，且截至目前为止，并无技术可以利用离体方式使海水白点虫完成完整的生命周期。

[0005] 制动现象(immobilization phenomenon)是在离体实验中，由经免疫过后的鱼体的血浆及黏膜制动活体纤毛幼虫，此现象可于鱼体内发生并提供鱼体保护，其是抗体结合寄生虫细胞及纤毛表面抗原造成该寄生虫无法移动。制动现象的目标抗原称为致动抗原(immbolization antigens，iAg)，其特征在于锚定大量糖基化磷脂酰肌醇(glycosyl phosphatidyl inositol，GPI)的表面膜蛋白。文献中指出，从淡水白点虫中分离出的制动抗原在诱发保护免疫力上扮演重要角色，该致动抗原的重组基因片段已被揭露可于金鱼体内产生对抗淡水白点虫的免疫反应，并有效提供保护免疫力。此外，有研究者曾利用受感染鱼体及产生免疫反应的兔子的抗血清和海水白点虫的营养体及纤毛幼虫，萃取出箝入性膜蛋白(integral membrane protein)与大量的表面抗原，并从血清型(serotype)G37的海水白点虫纯化及选殖出此发生表面凝集/制动现象的抗原。然而因细菌及真核生物无法使用该寄生虫的密码子，使该制动抗原DNA序列在大肠杆菌及真核细胞中难以表达，再者，经优化的制动抗原(CISA-32)亚克隆至pHSG299构筑的密码子仅能在细菌中表达，无法于哺乳类动物细胞、昆虫细胞或酵母菌细胞中表达。于本发明中，该制动抗原的密码子经修饰过后可顺利于大肠杆菌及鱼类细胞中表达该制动抗原重组蛋白，并且其具有免疫原性(immunogenic)。而本发明经由免疫测试证实该密码子经修饰后的制动蛋白可做为预防点带石斑鱼(E.coioides)或其他海水鱼类遭海水白点虫感染的疫苗。

[0006] 脱氧核糖核酸(DNA)疫苗是指注射经基因工程改造的DNA进入生物体引发免疫反应以达到预防感染疾病的效果的技术，核酸疫苗可应用于预防细菌、病毒及寄生虫感染，甚至可用来治疗肿瘤，但目前大部分仍处于实验阶段。相较于传统疫苗，DNA疫苗有许多优点，例如可同时诱发多种免疫反应。

[0007] 以人类而言，疫苗对现代医学有相当大的贡献，例如使天花、小儿麻痹、伤寒(typhus)、轮状病毒(rotavirus)、A型肝炎、B型肝炎等疾病都藉由疫苗达到良好的控制。然而，传统疫苗仅能对抗有限数量的疾病，目前仍有许多疾病缺乏有效疫苗防治，例如人类后天免疫不全症候群(AIDS)、C型肝炎、疟疾(malaria)等病症，仍待开发有效疫苗。

[0008] 对动物而言，疫苗及其预防接种是控制动物病原疾病、保障养殖业持续发展的重要手段。鱼类疫苗可分为灭活疫苗、减毒活疫苗、重组活疫苗、次单位疫苗以及DNA疫苗五大类；十年前已有一些细菌疫苗商品化，但病毒疫苗还很少，而寄生虫疫苗完全没有。因为鱼类疫苗存在免疫原力、生产成本和安全性等问题，大部分疫苗停留在实验室使用阶段，还未商品化生产。

[0009] 在开发疫苗过程中，所谓第一代疫苗是指全生物体疫苗(whole-organism vaccine)，其可能是活体、经弱化过的活体或死亡状态的生物，灭活疫苗或减毒活疫苗，例如天花及小儿麻痹疫苗，其可诱发细胞毒杀T淋巴球(TC或CTL)、辅助T细胞(TH)活化及抗体产生，但其存在毒性回复(reversion to virulence)的风险，灭活疫苗(killed vaccine)虽不具有此风险，但其无法诱发细胞毒杀T淋巴球活化，且生产上有其对应疾病的限制。为最小化上述风险，第二代疫苗应运而生，例如次单元疫苗(subunit vaccine)，其是以已知蛋白质抗原(defined protein antigen)或重组蛋白组成，前者如破伤风(tetanus)疫苗及白喉(diphtheria toxoid)疫苗，后者如B型肝炎疫苗。第二代疫苗可诱发辅助T细胞及抗体产生，但仍然无法诱发细胞毒杀T淋巴球活化。

[0010] DNA疫苗即第三代疫苗，其是以质粒透过基因工程技术处理，使其可产生一至两个属于病原体的特定抗原或蛋白质，当该DNA被送进体内细胞后，透过该质粒宿主细胞本身机制即可读取该DNA并转译出病原体的特定蛋白质，该蛋白质会被认定为外来蛋白质，便会被宿主细胞呈现至其表面，诱发免疫系统辨认并产生多种免疫反应。

[0011] 1993年以来，DNA疫苗以其高免疫保护率受到了广泛关注。DNA疫苗是指直接把带有目标抗原基因的重组质粒转染或注射到动物体内，使的表达出天然抗原物质。与传统疫苗相比，DNA疫苗的制作相对简单，成本低廉，运输保存容易，不存在毒力回复的现象。与灭活疫苗和次单位疫苗相比，DNA疫苗的效果更好。1996年，Anderson等首次将鱼传染性造血器官坏死症病毒(IPNV)的糖蛋白基因插入真核表达质粒以制成DNA疫苗，并免疫虹鳟鱼，发现能够诱导其产生强烈的保护性免疫反应，抵抗IPNV病毒的攻击。迄今为止，学者仍陆续进行鱼类DNA疫苗相关研究，并有突破性的发展。

[0012] 本发明即提供一种以海水白点虫制动抗原互补脱氧核糖核酸(cDNA)生产的疫苗及其制造方法及用途，该疫苗即为鱼类抗寄生虫的DNA疫苗，其可用于预防鱼类感染海水白点虫，是于该领域极具新颖性及进步性的发明。

发明内容

[0013] 本发明提供一种优化(optimize)海水白点虫制动抗原互补脱氧核糖核酸(cDNA)序列的方法，其包含：

[0014] a.取得海水白点虫制动抗原的mRNA序列；

[0015] b.将该mRNA序列转换为cDNA序列；

[0016] c.根据该cDNA序列中终止码(stop codon)周围的密码子(codons)对应的氨基酸残基的特定特征推测出终止码特定氨基酸，使该终止码以能转译出该特定氨基酸的密码子取代后，转译出的蛋白与从该海水白点虫纤毛幼虫纯化出的制动抗原两者的免疫原性(immunogenicity)相近；及

[0017] d.将该终止码(stop codon)以能转译出该特定氨基酸的密码子取代，产生优化的(optimized)cDNA序列；

[0018] 其中该特定特征是选自终止码周围密码子所对应的氨基酸残基的结构特性、疏水性、电荷分布所组成的群组。

[0019] 本发明所提供的优化(optimize)海水白点虫制动抗原互补脱氧核糖核酸(cDNA)序列的方法，其中该特定氨基酸为精氨酸(Arginine)、甘胺酸(Glycine)或丙胺酸(Alanine)，以甘胺酸(glycine)置换疏水性端(hydrophobicity alteration)、丙胺酸(alanine)置换可最小化结构改变、精胺酸(arginine)可用以置换带电部分(regional charge)。

[0020] 本发明进一步提供一优化的海水白点虫制动抗原互补脱氧核糖核酸(cDNA)序列，其包含SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列，及一载体，其包该优化的海水白点虫制动抗原cDNA序列，该载体为pGex2T-iAg或pcDNA3.1-iAg。

[0021] 本发明进一步提供一种核酸疫苗，其包括该优化的海水白点虫制动抗原cDNA序列，其进一步可以利用几丁聚糖纳米颗粒包裹。

[0022] 本发明进一步提供一种优化的海水白点虫制动抗原cDNA序列用于制备针对海水白点虫的抗体的用途，其特征在于将包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的cDNA序列的载体使用于一宿主(host)，促使该宿主产生抗体对该cDNA序列转译出的蛋白质发生免疫反应后，取得该针对海水白点虫的抗体，其中该载体可为为pGex2T-iAg或pcDNA3.1-iAg，并可以几丁聚糖包裹成纳米颗粒，而其中使用于该宿主的方式可为混入饲料或食饵中、混入水中浸泡该宿主或注射该宿主；而其中该宿主为水生生物，尤其是鱼类，例如黑鲷(Acanthopagrus schlegelii)、异臂花鮨(Caprodon schlegelii)、红点九刺鮨(Cephalopholis aurantia)、青星九刺鮨(Cephalopholis miniata)、细点牙鲷(Dentex dentex)、欧洲海鲈(Dicentrarchus labrax)、尖吻重牙鲷(Diplodus puntazzo)、单斑重牙鲷(Diplodus sargus)、青石斑(Epinephelus awoara)、点带石斑(Epinephelus coioides)、鞍 带石斑(Epinephelus lanceolatus)、三斑石 斑(Epinephelus trimaculatus)、黑毛瓜子腊(Girella leonina)、臀斑髭鲷(Hapalogenys mucronatus)、棘箱鲀(Kentrocapros aculeatus)、大黄鱼(Larimichthys crocea)、尖吻鲈(Lates calcarifer)、银纹笛鲷(Lutianus argentimaculatus)、赤鳍笛鲷(Lutjanus erythopterus)、白星笛鲷(Lutjanus stellatus)、角鳞鲀(Melichthys vidua)、真鲷(Pagrus major)、花软唇(Plectorhynchus cinctus)、茉莉花鳉(Poecilia latipinna)、魔鬼蓑鱼由(Pterois volitans)、黄锡鲷(Rhabdosargus sarba)、金钱鱼(Scatophagus argus)、红甘鲹(Seriola dumerili)、银篮子鱼(Siganus oramin)、金头鲷(Sparus aurata)、布氏鲳鲹(Trachinotus blochii)、海鲡(Rachycentron canadum)、青甘鲹(Seriola quinqueradiata)、克氏海葵鱼(Amphiprion clarkii)、白条海葵鱼(Amphiprion frenatus)、鞍斑海葵鱼(Amphiprion polymnus)或眼斑海葵鱼(Amphiprion ocellaris)。

附图说明

[0023] 图1是Chiayi品系海水白点虫的制动抗原核苷酸序列(GenBank FJ167511)及其对应的氨基酸序列。预测的信号肽以方框表示，终止密码子以深灰底表示，预测穿膜片段以浅灰底表示，以灰底方框表示者为糖基化磷脂酰肌醇固定位置(第302个氨基酸丝氨酸)，左侧数字为核苷酸序列、右侧数字为氨基酸序列。

[0024] 图2是以RT-PCR侦测制动蛋白转录产物(受转染24小时、48小时及72小时后的GF-1转录产物)，泳道(Lane)M为DNA marker；泳道24、48、72分别为受转染24小时、48小时及72小时后的结果。

[0025] 图3是以RT-PCR侦测制动蛋白转录产物(受注射的鱼体肌肉细胞的转录产物)，泳道M为DNA marker；泳道1、2、3分别为注射质粒模板(plasmid template)、对照组质粒(mock plasmid)及制动抗原质粒(iAg plasmid)的结果。图4是以西方墨点法侦测大肠杆菌表达重组制动抗原蛋白。泳道1为Marker；泳道2为未经IPTG诱导的大肠杆菌；泳道3为经IPTG诱导的大肠杆菌以小鼠抗GST抗体辨认，其中55kDa箭头指示处为GST融合制动抗原蛋白、25kDa箭头指示处为GST蛋白。

[0026] 图5是以西方墨点法侦测大肠杆菌表达重组制动抗原蛋白。泳道1为Marker；泳道2箭头指示处为GST融合制动抗原蛋白以兔子抗海水白点虫纤毛幼虫抗体辨认。

[0027] 图6为透过共轭焦雷射扫描显微镜观察以兔子抗海水白点虫纤毛幼虫免疫球蛋白的(A)白光(bright)；(B)DAPI染色部份；(C)FITC染色部份；(D)前两者重迭的石斑鱼GF-1细胞(a至d为以pcDNA3.1-optiAg转染的GF-1细胞；e至h为以pcDNA3.1转染的GF-1细胞；i至l为未经转染的GF-1细胞；Bar＝50微米)。

[0028] 图7以Kaplan-Meier存活曲线表达经制动抗原刺激免疫反应的实验鱼体只存活率，其中经制动抗原刺激免疫反应的对数等级(log rank)的显著性为0.008。

[0029] 图8以Kaplan-Meier存活曲线表达经重组制动抗原刺激免疫反应的实验鱼体只存活率，其中经重组制动抗原蛋白加强(boost)的对数等级(log rank)的显著性为0.008。

具体实施方式

[0030] 寄生虫体收集与培养

[0031] 于台北地区的鱼市场收集受海水白点虫(Cryptocaryon irritans)感染的鱼类后培养于水槽中，从该水槽底部收集囊胞体(tomont)后，培养于从台湾南部地区购买的点带石斑鱼(grouper Epinephelus coioides)幼鱼(平均每尾重量2.6公克)上。

[0032] 本发明所使用的寄生虫体培养的流程如下：利用小型油漆刷从该水槽底部轻轻地扫取并收集海水白点虫的囊胞体，并利用海水洗去多余的残渣或黏膜后，将该囊胞体利用过滤过的海水培养于培养皿(petri plates)上，并于室温培养三至七天。海水白点虫的纤毛幼虫(theront)会从囊胞体中产生，此时于摄氏4度以1500g离心含有该纤毛幼虫的溶液10分钟后即可收集活体的纤毛幼虫，将该活体纤毛幼虫感染未被海水白点虫感染过的成鱼(每尾平均重量300公克，从鱼市场中采买而得)，随后可得约六百万只活体纤毛幼虫提供后续以水为媒介的人工感染试验。

[0033] DNA萃取与基因型鉴定(genotype differentiation)

[0034] 利用Bio-Rad 36897CHELEX 100树脂抽取囊胞体的DNA，一次约使用20至30颗囊胞体，完成后，以聚合酶连锁反应(polymerase chain reaction，PCR)及核糖体DNA(rDNA)的18S、ITS-1与5.8S区域的特定引物(Primers 1 and 2；Table 1)放大特测序列片段，以初步变性温度摄氏95度进行3分钟后，再以温度循环：变性温度摄氏94度60秒、结合温度摄氏55度30秒，及延长温度摄氏72度60秒进行30个循环，放大完成的序列交由明欣生物科技有限公司(Mission Biotech Co.，Ltd.)测序，再将测序成果，即海水白点虫的部分18S、全部的ITS-1以及部分5.8S序列以多重序列比对软件CLUSTAL W(版本1.83)鉴别其基因型。

[0035] 从两种品系(isolates)的海水白点虫中得到部分18S、整段ITS-1的DNA序列，及部分5.8S rDNA，其核苷酸序列已公开于GenBank，即Chiayi(AF490381)与Aus C(AY029271)。

[0036] 制动抗原(immobilization Antigen，iAg)cDNA选殖(cloning)

[0037] 利用Trizol(Invitrogen)及所提供的程序抽取全RNA后，利用Primer 3软件在GeneBank数据库中记录的制动抗原序列AB262047设计目标制动抗原的特定引物；而部分抗原的基因序列是分离自Chiayi(即嘉义，此品系海水白点虫采集自嘉义)海水白点虫，并以含有25微升(μl)的2X反应混合液(2X Reaction Mix)、10微微摩尔浓度(pM)的TM引物(primers 3 and 4，Table 1)、2微升反转录酶SuperScript III RT/TM
Taq Mix、0.5微克(μg)RNA模板的试剂盒，50微升的总反应体积于SuperScript III One-Step RT-PCR系统放大之，上述进行方式为以摄氏50度30分钟进行cDNA合成后，以温度循环为初期变性温度摄氏94度进行2分钟，再以温度循环：变性温度摄氏94度15秒、结合温度摄氏55度30秒，及延长温度摄氏68度60秒进行40个循环，最后以温度摄氏68度
5分钟进行最终延长，放大后的产物亚克隆(subclone)至pGEM-TEasy Vector(Promega)并对其测序。

[0038] 5′and 3′末端选殖技术

[0039] 利用末端选殖试剂盒(5′and 3′rapid amplification of cDNA ends，RACE)(Invitrogen & Clontech)产出Chiayi海水白点虫的制动抗原的完整cDNA序列。3′末端选殖是以包含2微升的10倍PCR缓冲液、2.5毫摩尔浓度(mM)的氯化镁、0.5毫摩尔浓度的dNTP、5毫摩尔浓度的DTT、200U的反转录酶(Superscrip II Reverse transcriptase)及oligo(dT)-containing Adaptor Primer(AP；Invitrogen)共20微升的反应溶液(Invitrogen)，于摄氏42度下反应50分钟后加温至摄氏70度反应10分钟，进行反转录以合成第一股cDNA(First Strand cDNA)。

[0040] 再将此含有3′端结尾的cDNA作为模板加入2微升至包含5微升的10倍PCR缓冲液、5毫摩尔浓度的氯化镁、0.5毫摩尔浓度的dNTP、5毫摩尔浓度的DTT、5U Taq(Genemark)及10微 微 摩 尔 浓 度 的AUAP引 物 (Abridged Universal Amplification Primer)(Invitrogen)，总量50微升的反应液，于初期变性温度摄氏94度进行2分钟，再以温度循环：变性温度摄氏94度30秒、结合温度摄氏58度30秒，及延长温度摄氏72度60秒进行35个循环，最后以温度摄氏72度10分钟进行最终延长，放大后的产物亚克隆至pGEM-T Easy Vector并对其测序。

[0041] 至于5′端末端选殖，其第一股cDNA是利用SMARTTM RACE cDNAAmplification Kit(Clotnech)，以5′端RACE CDS引物A与SMART II A寡核苷酸(oligonucle-otide)于摄氏42度反应1.5小时后稀释10倍，再将2毫升含有5′端结尾的cDNA作为模板，加入至包含通用引物A Mix(universal Primer A Mix，UPM)(Clontech)及反转高基因专一性引物(reverse gene specific primer)(primer 6，Table 1)的PCR反应溶液，此反应以初期变性温度摄氏94度进行2分钟，再以温度循环：变性温度摄氏94度30秒、结合温度摄氏55度30秒，及延长温度摄氏72度60秒进行35个循环，最后以及温度摄氏72度10分钟进行最终延长。随后利用巢式聚合酶连锁反应(Nested PCR)以稀释50至100倍的第一次PCR产物为模板，与巢式通用引物(nested universal Primer A，NUP)Clontech)及巢式反转高基因专一性引物(nested reverse gene specific primer)(primer 7，Table 1)于上述相同情况下进行，放大后的产物亚克隆至pGemTeasy plasmid(Promega)并对其测序。

[0042] 最后以SignalP 3.0测试Chiayi海水白点虫的全长制动抗原的信号肽(signal peptide)、SMART program预 测 跨 膜 (transmembrane)片 段，及 big-PI Predictor program预测肽裂解(propeptide cleavage)的可能omega(ω)site及糖基化磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol，GPI)的固定位置(anchor site)。

[0043] 密码子置换(Codon replacement)

[0044] 该制动抗原的原始序列(GenBank：FJ167511)是以软件DNASTAR Lasergene 6进行分析，并依据氨基酸的结构特性、疏水性及电荷分布等特性以适当的氨基酸置换终止密码子，例如以甘胺酸(glycine)置换疏水性端(hydrophobicity alteration)、丙胺酸(alanine)置换可最小化结构改变、精胺酸(arginine)可用以置换带电部分(regional charge)。本实施例选定的置换残基为核苷酸序列第309至311、393至395、468至470、519至521、540至542、657至659、及897至899个核苷酸。置换过终止密码子的该制动抗原核酸序列以软件GENEART Gene optimizer Sequence Analysis(Prisma Biotech Co.)分析，评断标准包含GC含量及密码子质量评估(codon quality assessment)，为使该序列在大肠杆菌(E.coli)、哺乳动物细胞、昆虫细胞或酵母菌系统中有稳定的高表达量，序列中的GC含量由原始序列的37％提升至47％。

[0045] 制动抗原质粒(iAg plasmid)构筑及包覆(encapsulation)

[0046] 本实施例构筑两个质粒：能表达于大肠杆菌的pGex-2t-iAg及能表达于石斑鱼鱼鳍细胞(grouper fin-1；GF-1)与经接种过后的石斑鱼活体上的pcDNA3.1-optiAg，pGEX-2T是采用GE Healthcare(前Amersham Biosciences)生产的产品，目录编号：27-4801-01；pcDNA3.1(+)是采用Invitrogen Life technologies生产的产品，目录编号：
V790-20。

[0047] pGex-2T-iAg的构筑方式为：利用已置换的制动抗原DNA作为模板，设计一对引物(引物8(SEQ ID NO：8)及引物9(SEQ ID NO：9)，如表1及序列表所示)进行PCR以确认成熟蛋白质(mature protein)是否含有该制动蛋白DNA片段，其PCR的温度循环为初期变性温度摄氏94度进行2分钟，再以温度循环：变性温度摄氏94度30秒、结合温度摄氏58度30秒，及延长温度摄氏72度60秒进行35个循环，其后以胶体萃取试剂盒(gel extraction kit)(BIOMAN)将该放大后的DNA从琼脂糖(agarose)分离(elute)出，并以限制酶BamHI及EcoRI(Invitrogen)切割后选殖至pGex-2T的BamHI及EcoRI限制酶切割位置。

[0048] pcDNA3.1-iAg的构筑方式为：利用已置换的制动抗原DNA作为模板，设计一对引物(引物8(SEQ ID NO：8)及引物9(SEQ ID NO：9)，如表1及序列表所示)进行PCR以确认成熟蛋白质(mature protein)是否含有该制动蛋白DNA片段，其PCR的温度循环为初期变性温度摄氏94度进行2分钟，再以温度循环：变性温度摄氏94度30秒、结合温度摄氏58度30秒，及延长温度摄氏72度60秒进行35个循环，其后以胶体萃取试剂盒(gel extraction kit)(BIOMAN)将该放大后的DNA从琼脂糖(agarose)分离(elute)出，并以限制酶BamHI及EcoRI(Invitrogen)切割后选殖至pGex-2T的BamHI及EcoRI限制酶切割位置。

[0049] 为达到DNA疫苗的功效，在本实施例中，该优化的制动抗原质粒pcDNA3.1-iAg是参考台湾地区专利公开号第200926967号专利「水产用多重相乳化包埋口服制剂制作方法」，以水/油/水的三层乳状结构(emulsion)以直径19±6.47微米(μm)的大小包裹。在另一实施例中，其包裹方法是参考考国立海洋大学吴彰哲教授等发明之台湾地区专利申请号第098133509号之「几丁聚糖作为传输工具的应用和方法」，以离子凝胶法(ionic gelation)制备几丁聚糖纳米微粒(chitosan nanoparticles)，其制备方法为将几丁聚糖溶液(20毫升，1％几丁聚糖溶解于醋酸之溶液)缓慢加至8毫升三聚磷酸溶液中(tripolyphosphate solution，0.84毫克/毫升)，将上述溶液于室温中迅速进行超声波震碎(ultrasonication，29W，4分钟)处理，在以离心12000g，45分钟除去沉积块状物质(pelleted particle)后，上清液即含有几丁聚糖纳米微粒。将适量质粒DNA加入该上清液后即可产生含有几丁聚糖/质粒DNA混合物的混合液，将该混合液于室温以最大速度的震动(vortex)20秒，即可产生含有直径介于130～160纳米的几丁聚糖/质粒DNA混合物的混合液。

[0050] 利用细菌表达制动抗原并收集重组蛋白

[0051] 将制动抗原质粒pGex2T-iAg转殖至大肠杆菌(pLysS BL21)隔夜培养后，将该菌液以含有50微克/毫升(μg/ml)安比西林(ampicillin)的新鲜LB培养液稀释20倍，并于摄氏37度下快速摇晃(vigorous shaking)，在OD600达到0.7时加入最终浓度0.1mM的IPTG(Isopropyl 1-thio-P-o-galactoside)后培养3小时，随后收取并于摄氏
4度以2000g离心15分钟，以300pl的磷酸缓冲液(phosphate-buffered saline，PBS)使菌液再悬浮(resuspend)、于SD S-sample buffer中沸腾5分钟后，以SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis)分析之，并利用麸胱甘肽树脂(Glutathione resin)(Bioman Scientific Co.Ltd，Taiwan)纯化GST-iAg融合蛋白。100毫升的菌液经过IPTG诱导后以离心收取并利用10毫升细胞裂解缓冲液(lysis buffer，
50mM Tris，pH 8.0，O.lM NaCl，1mM EDTA)再悬浮，并加入最终浓度5毫克/毫升的溶菌酶(lysozyme)于室温下培养5分钟，再以1％Triton-100裂解细胞，再分别加入最终浓度5mM及10微克/毫升氯化镁及脱氧核糖核酸水解酶I(DNase I)消化黏滞DNA(viscous DNA)，溶解产物(lysate)以离心清理后，将上清液(supematant)于室温下培养于1毫升的浆体(slurry)50％麸胱甘肽树脂并缓慢摇动1小时，以10倍树脂沉淀后体积(10bed volumes)磷酸缓冲液(PBS)清洗该树脂3次，再以15mM还原态麸胱甘肽(reduced glutathione)(Bioman，Taiwan)从该树脂中冲提出GST-iAg融合蛋白，最后以Bradford Assay及西方墨点法测量GST融合制动抗原蛋白的浓度，其中第一抗体为抗海水白点虫纤毛幼虫(irritans theront)的兔子免疫球蛋白(rabbit immunoglobulin)(稀释1000倍)，第二抗体为碱性磷酸酶(alkaline phosphatase)接合山羊抗兔子免疫球蛋白(稀释1000倍)。

[0052] 表达制动抗原于GF-1细胞

[0053] 转染

[0054] GF-1细胞系从点带石斑鱼(Epinephelus coioides)鱼鳍中取出，并培养于摄氏28度加入抗生素的L15培养液(Invitrogen，Carlsbad，CA)中，并加入5％(v/v)经热处理不活化(heat-inactivated)的胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)，GF-1主要为类纤维母细胞(fibroblast-like)及表皮细胞。将pcDNA3.1-优化的制动抗原质粒(pcDNA3.1-optiAg)及对照组pcDNA3.1利用lipofectamine 2000(Life Technologies，Inc.，Rockville，MD)及其操作指示转染至GF-1细胞，其步骤为：转染前20小时于6孔培5
养盘中每格培养1 x 10 个细胞，转染时将3微升的lipofectamine以及1微克的该质粒(pcDNA3.1-optiAg)分别以L15培养液稀释至100微升，随后将上述二溶液1∶1混合并于室温下放置20分钟后，与800微升的无血清培养液混合，再缓慢滴至细胞上，静置于摄氏
28度培养5小时后更换新鲜培养液，最后于转染后24小时，48小时及72小时收取细胞以观察该制动抗原转录情形。

[0055] 反转录核酸聚合酶连锁反应(RT-PCR)

[0056] 利用Trizol(Invitrogen)萃取上述经转染的GF-1细胞的RNA，以Superscript One-Step RT-PCR试剂盒(Invitrogen)及引物8(SEQ ID NO：8)与引物9(SEQ ID NO：9)(详见表一及序列表)进行RT-PCR，该RT-PCR以初期变性温度摄氏94度2分钟，再以温度循环：变性温度摄氏94度30秒、结合温度摄氏55度30秒，及延长温度摄氏72度30秒进行30个循环，最后以延长温度摄氏72度10分钟，其产物以1.5％洋菜凝胶电泳及溴化乙锭(ethidium bromide)染色分析其产物。

[0057] 细胞免疫化学染色法(Immunocytochemistry，ICC)法

[0058] 将上述GF-1细胞培养于厚盖玻片并根据上述转染过程，利用5微克的pcDNA3.1-optiAg进行转染，在培养48小时后以L-15培养液清洗并固定于含4％三聚甲醛(paraformaldehide)(v/v)的磷酸缓冲液(PBS)中，该受固定的细胞以NET-明胶阻断液(NET-gelatin blocking solution)于室温下培养1小时后，再于室温下浸泡PBST(PBS with 0.1％triton X-100)15分钟，随后将该细胞加入含有稀释1000倍的抗纤毛幼虫兔子免疫球蛋白的NET-gelatin溶液，于摄氏4度下静置过夜(以兔子免疫前(preimmune)免疫球蛋白为第一抗体的对照组)，利用PBST润洗细胞后，再于室温下与稀释2000倍的荧光素异氰硫酸盐(fluorescein isothiocyanate；FITC)接合山羊抗兔子免疫球蛋白培养2小时后，再次以PBST润洗细胞，并以4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(4′，6-diamidino-2-phenylindole；DAPI)于室温下染色10分钟后，移除该染色液，将该盖玻片移至滴有免疫荧光抗退色液(mounting medium，malinol NX)的载玻片上，盖玻片盖上的方式使载有细胞的一面朝向该载玻片，经染色后，利用共轭焦雷射扫描显微镜(confocal laser scanning microscope)(台湾大学科技共同空间)显影观察。

[0059] 诱发石斑鱼苗免疫反应

[0060] 初始免疫(Primary immunization)

[0061] 从国立海洋大学水生动物实验中心获得的未出现白点病(Cryptocaryonasis)临床症状的石斑鱼苗，于实验前先饲养两周，该鱼苗皆被饲养于摄氏27度的32ppt海水，并持续供应氧气。在进行免疫反应测试前，从该实验鱼群中随机选出20％并以抗海水白点虫纤毛幼虫的特定血清抗体力价(specific serum antibody titer)及酶结合免疫吸附分析(Enzyme-linked immunosorbent assay；ELISA)。每组筛选21只体重介于13至28公克的石斑鱼苗，并将其分至三缸分别饲养于38公分x 25公分x 26公分的水族箱中。该三组石斑鱼苗分别给予以下免疫刺激：(1)对第一组石斑鱼苗于背鳍基部肌肉注射受包裹的水做为对照组；(2)对第二组石斑鱼苗于背鳍基部肌肉注射受包裹的pcDNA3.1质粒(1公克鱼体注射1微克质粒)做为对照组；(3)对第三组石斑鱼苗于背鳍基部肌肉注射受包裹的pcDNA3.1-optiAg质粒(1公克鱼体注射1微克质粒)，其中1微克质粒(湿重，wet weight)11
约包含有1.4x 10 个质粒。

[0062] 第二次追加注射是于第一次注射两天后再给予相同剂量的注射，以确保鱼体有足够的DNA量。

[0063] 初始接种后对鱼体进行转录确认

[0064] 经过初始接种后，对鱼体(n＝3)进行体内基因表达测试，利用引物8(SEQ ID NO：8)及引物9(SEQ ID NO：9)(如表一所示)对注射点附近的肌肉组织测试该制动抗原基因的表达量，该肌肉组织样本系于注射后24小时收取，并利用RT-PCR测试之。

[0065] 追加免疫重组制动抗原蛋白

[0066] 第二次免疫反应测试采核酸初免-蛋白加强(DNA prime-protein boost)的方法进行，用于实验的石斑鱼苗体重介于30公克至45公克之间，此次实验一样分为三组进行，每组约含12至15尾鱼苗，该三组石斑鱼苗分别给予以下免疫刺激：(1)对第一组石斑鱼苗于背鳍左侧肌肉注射受包裹的水做为空白对照组(2)对第一组石斑鱼苗于背鳍左侧肌肉注射受包裹的pcDNA3.1质粒(1公克鱼体注射1微克质粒)做为对照组；(3)对第三组石斑鱼苗于背鳍基左侧肉注射受包裹的iAg质粒(1公克鱼体注射1微克质粒)，并于初始免疫10日后于背鳍右侧肌肉注射麸胺基硫转移酶(glutathione S-transferase，GST)接合的制动抗原重组蛋白(1公克鱼体注射1微克)作为免疫增强剂(booster)。

[0067] 进行人工浸染

[0068] 利用每公升海水1.8x 104只的活体Aus C分离品系(isolate)(从基隆的受感染施氏花鲈(Caprodon schlegelii)身上取得)海水白点虫纤毛幼虫人工浸染免疫后或免疫增强后7日的鱼体，人工浸染的方式为：于38公分x 25公分x 26公分的水箱内5公升的海水中感染10至20分钟后，再加入海水至15公升放置24小时，如2至3天后鱼体体表出现白点，则确认受到海水白点虫感染。本测试每日记录实验鱼体的死亡数目持续一周。

[0069] 实验鱼体死亡率记录

[0070] 利用下列公式计算专一性累积死亡率(cumulative mortality of the specific death，CMSD)：

[0071] CMSD(％)＝(死亡鱼体总数-非特定因素死亡数目/实验鱼体总数-非特定因素死亡数目)×100

[0072] 统计

[0073] 利用变异数分析(Analysis of Variance，ANOVA)及邓肯氏多变域测验(Duncan′s New Multiple Range Test，DMRT)分析CMSD，p值小于0.01及p值小于0.05可显示该结果具有统计显著性。利用统计软件SPSS 11.5绘制Kaplan-Meier存活曲线以表达经制动抗原刺激免疫反应的实验鱼体的累积死亡率。

[0074] 上述实施方式的实施结果

[0075] 制动抗原的cDNA选殖

[0076] Chiayi品系制动抗原的cDNA全长有987个碱基对，开放读码区(open reading frame)含有329个氨基酸，其包含一19个氨基酸的推定的氨端信号肽(N-terminal signal peptide)(如图1所示)，五端及三端的非转译区(untranslated region，UTR)分别为19个核苷酸及140个核苷酸。再者，Chiayi品系制动抗原含有7个TAA密码子(核苷酸第23-25，392-394，467-469，518-520，539-541，656-658与896-898)及1个TAG密码子(核苷酸第308-310)，其转译出的初始蛋白质估计为34.65kDa、不含信号肽的成熟蛋白质估计为32.69，估计的isoelectric point(pI)为7.5。Chiayi品系制动抗原被预测出有两段穿膜片段(transmembrane segment)分别位于第225-227及306-328个氨基酸，另外Chiayi-制动蛋白的羧基末端蛋白质被预测于第302个氨基酸丝氨酸(serine)处具有一可能omega(ω)site提供前肽(propeptide)切割及糖基化磷脂酰肌醇(GPI)的固定位置(如图1所示)。

[0077] 受转染GF-1细胞中与以制动蛋白DNA注射过的鱼体肌肉中的制动蛋白转录产物[0078] 以RT-PCR检测经pcDNA3.1-optiAg转染后24小时、48小时及72小时的GF-1细胞中制动蛋白转录产物表达量显示于图2A，以相同剂量的pcDNA3.1转染的负对照组未显示电泳条带(band)，未经转染的细胞也未显示电泳条带。另外，于转染后24小时测出利用制动蛋白刺激免疫的鱼体肌肉样本中含有制动蛋白转录产物(如图2B所示)，且对照组(mock control)，即以pcDNA3.1注射的鱼体肌肉样本并未显示电泳条带。

[0079] 利用大肠杆菌表达的制动抗原重组蛋白

[0080] 利用西方墨点法测试的结果证明了加入IPTG可诱使GST-iAg融合蛋白表达(如图3A，Lane 3所示)，该融合蛋白是以麸胱甘肽凝胶树脂(glutathione sepharose resin)(BIOMAN，Taiwan)纯化。老鼠抗GST抗体辨认约55kDa的intact融合蛋白及25kDa的GST蛋白(如图3A所示)，另外，兔子抗海水白点虫纤毛幼虫的免疫球蛋白亦可辨认GST-iAg融合蛋白(如图3B所示)，而利用兔子免疫前血清则无法辨认之。利用线性回归方程式分析2
电泳并推算制动抗原重组蛋白的分子量(R ＝0.9668)为32.067，与预估的分子量32.69相当接近。

[0081] 制动抗原蛋白(iAg protein)于GF-1细胞中的表达量分析

[0082] 利用免疫细胞化学染色法(ICC)分析制动抗原质粒(iAg plasmid)于经pcDNA3.1-optiAg转染的GF-1细胞中表达制动抗原蛋白的能力，经转染48小时后以共轭焦雷射扫描显微镜观察，仅以pcDNA3.1-optiAg转染的细胞表达制动抗原蛋白(如图4C所示)，对照组(mock control)及未经转染的细胞都无产生荧光(如图4g及4k所示)。同时利用兔子免疫前免疫球蛋白为第一抗体做ICC测试的结果中，经pcDNA3.1-optiAg转染的细胞亦无产生荧光。

[0083] 以制动抗原免疫石斑鱼对海水白点虫的免疫保护力效果

[0084] 如表二所示，以pcDNA3.1-optiAg免疫的鱼体的专一性累积死亡率(CMSD)为50％，其在统计上与注射水的对照组(93％CMSD)及仅注射pcDNA3.1的对照组(93％CMSD)相比显著下降。最高的相对存活率(relative percent survival，RPS)在第一次试验中得到为46％，其剂量为每1公克鱼体注射1微克的制动抗原质粒两次(中间间隔两天，共2微克)，对照组中存活的鱼体上亦发现感染海水白点虫病征的白色小点。

[0085] 以重组蛋白追加免疫(boost)的效果

[0086] 如表三所示，以制动抗原质粒免疫并以重组制动抗原蛋白追加免疫的鱼苗其相对存活率为40％，与对照组相较(84％CMSD)，其以海水白点虫感染后的CMSD显著较低(50％)(p＜0.05)。

[0087] 纳米微粒包裹

[0088] 为达到较高的免疫效果，在本发明其中一个实施例是以几丁聚糖(chitosan)纳米微粒包裹该制动抗原质粒，其中几丁聚糖纳米微粒及几丁聚糖/DNA混合物的制备方法是依据中国台湾地区公开号第201021806号专利「几丁聚糖作为传输工具的应用和方法」及其相关论文：Han-Ning Huang，Tsung-Lin Li，Yi-Lin Chan，Chien-Lung Chen，Chang-Jer Wu 著 作 的「Transdermal immunization with low-pressure-gene-gun mediated chitosan-based DNA vaccines against Japanese encephalitis virus」(发表于Biomaterials 30(2009)6017-6025)。该几丁聚糖纳米微粒是以离子凝胶(ionic gelation)制备，将几丁聚糖溶液(1％的几丁聚糖溶解于20毫升的醋酸溶液)缓慢加至8毫升的三聚磷酸盐(tripolyphosphate，TPP)(0.84毫克/毫升)后，立刻于室温中以超音波处理(ultrasonication)(29W，4分钟)，再离心12,000转45分钟以去除沉积颗粒，该上清液即含有几丁聚糖纳米微粒。而几丁聚糖/DNA混合物的取得则是将10毫升质粒DNA溶液(1毫克/毫升)加入不同量的几丁聚糖溶液，随后于室温中震荡(vortex)该混合液20秒，其制备完成的几丁聚糖/DNA混合物的直径约介于130～160纳米。

[0089] 本发明中用于制作DNA疫苗的制动抗原是从Chiayi品系海水白点虫(GenBank：FJ167511)选殖而得，其完整序列中有8个密码子在原核生物或部份真核生物中的功能为终止密码子(7个TAA及1个TAG)，因此无法以该密码子直接于细菌或其他真核生物中表达出重组蛋白。在这八个终止密码子中，其中1个位于信号肽区域，其余7个位于原本海水白点虫制动抗原基因片段中，并被置换成通用麸酰胺(Glutamine)密码子CAG及CAA，然而该通用麸酰胺密码子亦无法于细菌中表达，故密码子优化(Codon optimization)，即根据特定生物的需求置换特定密码子，是增加可表达该序列的细胞品系及生物的手段之一，如将密码子置换成目标生物可读且可转换出与原本位置相同的氨基酸，则该用以刺激免疫的制动蛋白氨基酸序列及可与原本相同。因此，本发明其中一个实施例中，考虑氨基酸的结构及电荷分部等特性，该7个终止密码子(除了位于信号肽区域的密码子)被置换成精氨酸(Arginine)、甘胺酸(Glycine)或丙胺酸(Alanine)，同时丙胺酸及甘胺酸的密码子可增加GC含量，该制动蛋白序列经修饰后将平均CG含量由36％提升至47％。此经密码子置换的制动蛋白基因于石斑鱼鳍细胞中成功表达，同时也可在细菌中表达出GST融合蛋白。

[0090] DNA疫苗在水产养殖业中因其经济性、环境保护性及安全性极具产业利用性，曾有许多前案指出DNA疫苗抗鱼类的病原体的成效。于本发明其中一实施例中，密码子经置换后的制动抗原构筑pcDNA3.1-optiAg成功于受转染的GF-1细胞中表达制动抗蛋白，并经共轭焦雷射扫描显微镜确认。同时经RT-PCR亦确认pcDNA3.1-optiAg于接受肌肉注射并免疫后的石斑鱼的注射处表达，该RT-PCR结果中的电泳条带与该制动抗原的分子量相同。此外，制动抗原蛋白于受pGex2T-iAg质粒转染的大肠杆菌的表达亦经由西方墨点法证实，其结果显示该重组制动抗原蛋白在生体外及升体内都可成功表达，故本实施例的DNA疫苗可成功于生物体内诱发免疫反应。

[0091] 再者，本发明其中一实施例中，以海水白点虫感染的实验中成功证明该制动抗原可提供适当的保护(46％RPS)，于第一次试验(如表二所示)，以每1公克鱼体1微克的剂量注射两次实验鱼体(中间间隔两天，共2毫微克)，其RPS为46％，然而第二次试验(如表三所示)，以每1公克鱼体1微克的剂量仅注射1次实验鱼体，第二次是以重组制动抗原蛋白注射(每1公克鱼体1微克)，其RPS为40％，并未比第一次试验高，不过如给予更高剂量的制动抗原质粒或重组制动抗原蛋白可能可以达到更好的保护效果。如欲更增强本发明所提供的DNA疫苗的效果，应可从DNA的剂量、纳米粒子包裹技术、加入信号肽、选择适当血清型(serotype)及适当的投药方式，此外，于本发明其他实施例中，并不限于此实施例所使用的制动抗原，亦可从海水白点虫身上取得其他抗原实施。

[0092] 表一本发明所使用的引物及cDNA

[0093]

[0094]

[0095] 表二第一次试验

[0096]

[0097] 表二中显示以制动抗原质粒诱发免疫的组别III与对照组I、II的经海水白虫感染后CMSD有显著差异(经变异数分析及邓肯氏多变域测验分析p＜0.01)。

[0098] 表三第二次试验

[0099]

[0100] 表三中显示以制动抗原质粒诱发免疫的组别III与对照组I、II的经海水白虫感染后CMSD有显著差异(经变异数分析及邓肯氏多变域测验分析p＜0.01)。

[0101] 将DNA以纳米微粒(nanoparticle)或微粒(microparticle)包裹可避免DNA被消化以增加被摄取量，受纳米微粒包裹的DNA疫苗可透过口服或注射实施，而纳米微粒被认为较微粒佳的原因在于其体积的一致性。而此包裹物以生物可分解材质制成为佳，一种由大展生命科技股份有限公司(Alarvita Biolife)生产的抗鱼类结病毒(betanodavirus)的疫苗即是以此种方式包裹。另外纳米微粒的平均直径约为80纳米，较水/油/水三层乳状结构的19微米小许多。

[0102] 于本发明其中一实施例，发明人利用Aus C品系海水白点虫进行人工浸染，而制动抗原DNA疫苗系由Chiayi品系海水白点虫所构筑，两品系ITS-1区域有3.55％的差异，制动抗原序列有84％相似。而本发明的相关实施例中，此2种品系中皆未发现血清抗体反应，因此制动抗原是否可诱发跨血清型(cross-serotype protection)的保护须经更多实验证明之。

[0103] DNA疫苗可提供体液免疫及细胞媒介免疫的反应，以肌肉注射为例，肌细胞会是主要的受转染细胞类型，虽此免疫方法未产生细胞媒介免疫，但受转染肌细胞产生的抗原足以产生细胞毒杀T淋巴球(CTL)反应。

[0104] 能够诱发CTL反应的DNA疫苗编码(encode)的抗原有全蛋白质、截断(truncated)蛋白质、融合蛋白质、一丛细胞毒杀T淋巴球肽(CTL peptide)、一段嵌于异源蛋白(heterologous protein)的细胞毒杀T淋巴球肽、极小细胞毒杀T淋巴球肽(minimal CTL peptide)等。以NetCTL预测，选殖入pcDNA3.1-optiAg的制动抗原序列，其主要有9个组织兼容性复合物(Major histocompatibility complex，MHC)配位子/细胞毒杀T淋巴球抗原决定基(MHC ligands/CTL epitope)。

[0105] 许多先前技术曾揭露DNA疫苗应用于动物中可诱发抗体反应，又有部分先前技术推测若一DNA疫苗不含引导讯息序列(leading signal sequence)，则相较于全长的序列，其免疫原性较低。相对地，亦有先前技术肯定缺乏分泌讯号序列(secretion signal sequence)的蛋白质亦可诱发抗体反应。DNA疫苗诱发抗体反应的能力可以其所产生的成熟蛋白质结构为膜锚定(membrane-anchored)蛋白或可溶性蛋白、或是否为分泌蛋白。

[0106] 本发明所提供的制动抗原DNA疫苗具有免疫原性，即使该制动抗原质粒并未包含讯息序列以表达抗原为细胞外蛋白质。在本发明其中一实施例中，虽然该DNA疫苗已能诱发免疫反应，但如以对其加入适当信号肽的实施方式，亦可对目标寄生虫产生体液免疫反应，其可增加该DNA疫苗的效果。

[0107] 以本发明所提供的抗海水白点虫DNA疫苗而言，能在不同品系间产生免疫保护效果是相当重要的，因为鱼类通常会遭受不只一种品系的海水白点虫感染，先前技术显示两个不同的海水白点虫制动血清型(immobilization serotype)对不同品系产生之抗血清(antiserum)产生制动现象，故根据免疫力价(immobilization titer)及营养体总数(trophont count)，可认为这两种血清型能诱发交叉保护反应(cross-protection)。

[0108] 将质粒传送至欲转染目标物亦是进行DNA疫苗产生免疫反应的基本步骤之一，目前有许多种方式用以增加DNA于生体内的传送率，其包含各种配方如盐类、局部麻醉(local anesthetic)、油脂、糖类及基因枪与Biojet等等，但若能将DNA疫苗以混入鱼饲料的方式投药则具有降低鱼体压力、可一次对大量的鱼施药、低成本等优点，然若以注射方式投药，则可精准控制剂量。

[0109] 综上所述，本发明的实施例完成一个藉由密码子置换使制动抗原蛋白质能于原核细胞及真核细胞系统中表达的方法，同时亦验证了该制动蛋白具有免疫原性，故本发明所提供的DNA疫苗确实可预防鱼类受到海水白点虫感染。