噬菌体抗体库的构建方法及应用此库筛选到的抗CD6抗体

摘要

本发明公开了一种构建高度多样性的大容量天然人源Fab噬菌体抗体库的方法，采用DNA重组技术从15位健康志愿者外周血淋巴细胞中扩增出全套人抗体轻链和重链可变区基因，分别插入噬菌体载体PFK-1，PFL-6相应的位置，建立高容量、高多样性的天然人源Fab噬菌体抗体库，该方法建立的kappa链Fab抗体库容量为2.85×108，lambda链Fab抗体库容量为2.9×108，符合大容量体抗体库的标准，且包含几乎覆盖人抗体的全部轻链和重链可变区基因，具有高度的多样性。该抗体库主要用来高通量筛选临床治疗用的低抗原性和高亲和性人源抗体。使用该抗体库，筛选出一株抗CD6的单克隆抗体。

权利要求

1.一种天然人源Fab噬菌体抗体库的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）构建噬菌体展示Fab抗体的噬粒载体，所述构建载体的方法为：重链CH1恒定区基因分别以限制性内切酶AscI和NotI进行酶切，纯化后重链CH1恒定区基因与噬菌体载体PCSm连接，转化大肠杆菌DH5α中，构建了PCSm-CH1载体，轻链Lambda链和kappa链恒定区基因分别用HindIII和AscI进行酶切，纯化后分别将lambda和kappa链恒定区基因与PCSm-CH1载体连接，转化大肠杆菌DH5α中，构建的载体命名为PFK-1，PFL-6；

（2）人外周血淋巴细胞的分离及总RNA的提取，通过RT-PCR合成cDNA；

（3）以cDNA为模板，然后采用一组几乎覆盖人抗体全部重链或轻链可变区编码序列的特异性引物进行PCR反应，扩增轻链kappa，lambda和重链可变区基因；

所述一组几乎覆盖人抗体全部轻链可变区编码序列的特异性引物如下所示：扩增kappa轻链可变区基因的上游引物为：

5’VK-1：

GCTGGCTTAGTCTTGGCCTTCTCGGCCAGCGCAGACATCCAGWTGACCCA

5’VK-2：

GCTGGCTTAGTCTTGGCCTTCTCGGCCAGCGCAGATGTTGTGATGACTCAG

5’VK-3：

GCTGGCTTAGTCTTGGCCTTCTCGGCCAGCGCAGAAATTGTGWTGACRCA

5’VK-4：

GCTGGCTTAGTCTTGGCCTTCTCGGCCAGCGCAGATATTGTGATGACCCAG扩增kappa轻链可变区基因的下游引物为：

3’VK-1：

ACGTTTGATCTCGAGCTTGGTCCCYTGGCCRAA

3’VK-2：

ACGTTTGATCTCGAGTTTGGTCCCAGGGCCGAA

3’VK-3：

ACGTTTGATCTCGAGCTTGGTCCCTCCGCCGAA扩增lambda轻链可变区基因的上游引物为:

5’VL-1：

GCTGGCTTAGTCTTGGCCTTCTCGGCCAGCGCACAGTCTGTGYTGACKCAG

5’VL-2：

GCTGGCTTAGTCTTGGCCTTCTCGGCCAGCGCACARTCTGCCCTGACTCAG

5’VL-3：

GCTGGCTTAGTCTTGGCCTTCTCGGCCAGCGCATCCTATGWGCTGACTCAG

5’VL-4：

GCTGGCTTAGTCTTGGCCTTCTCGGCCAGCGCATCTTCTGAGCTGACTCAG

5’VL-5：

GCTGGCTTAGTCTTGGCCTTCTCGGCCAGCGCACAGGCTGTGCTGACTCAG

5’VL-6：

GCTGGCTTAGTCTTGGCCTTCTCGGCCAGCGCAAATTTTATGCTGACTCAGC扩增lambda轻链可变区基因的下游引物为:

3’VL-1：

CTTGGGCTGACCTAGGACGGTSACCTTGGTSCC

3’VL-2：

CTTGGGCTGACCTAGGACGGTCAGCTYSGTCCC

3’VL-3：

CTTGGGCTGACCTAGGATGATCAGCTGGGTTCC所述一组几乎覆盖人抗体全部重链可变区编码序列的特异性引物如下所示：扩增重链可变区基因的上游引物为：

5’VH-1：

TTCTATTCTCACAGTGCACAGRTGCAGCTGGTGCARTCTGG

5’VH-2：

TTCTATTCTCACAGTGCACAGSAGGTCCAGCTGGTRCAGTCTGG

5’VH-3：

TTCTATTCTCACAGTGCACAGRTCACCTTGAAGGAGTCTGG

5’VH-4：

TTCTATTCTCACAGTGCACAGSAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG

5’VH-5：

TTCTATTCTCACAGTGCACAGGAGGTGCAGCTGGTGGAGWCYGG

5’VH-6：

TTCTATTCTCACAGTGCACAGGTGCAGCTACAGCAGTGGGG

5’VH-7：

TTCTATTCTCACAGTGCACAGSTGCAGCTGCAGGAGTCSGG

5’VH-8：

TTCTATTCTCACAGTGCACAGGARGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG扩增重链可变区基因的下游引物为：

3’VH-1：

GGCCCTTGGTGCTAGCTGAGGAGACGGTGACCAGGGTKCC

3’VH-2：

GGCCCTTGGTGCTAGCTGAAGAGACGGTGACCATTGTCCC

3’VH-3：

GGCCCTTGGTGCTAGCTGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCC；

（4）将轻链kappa链和lambda链可变区基因分别用限制性内切酶SfiI和XhoI，SfiI和AvrII双酶切，纯化后Vkappa和Vlambda基因分别与噬粒载体PFK-1，PFL-6连接；将kappa部分连接产物纯化后溶于100uL无菌水中，电转入感受态细胞TG1后将转化菌均匀涂布于含100ug/mL氨苄青霉素的2YTAG平板中；收集所有克隆质粒的DNA即为kappa链轻链抗体库；用相同的方法获得lambda链轻链抗体库；

（5）将重链VH片段基因分别用ApaLI和NheI进行双酶切，纯化后与噬粒载体PFK-1连接；将重链连接产物纯化后溶于100uL无菌水中，分四次电击转化TG1感受态细胞后将转化菌均匀涂布与含100ug/mL氨苄青霉素的2YTAG平板中；收集所有克隆质粒的DNA即为重链抗体库；

（6）采用ApaLI和NheI进行双酶切，将重链可变区基因从重链抗体库DNA中切出，分别与轻链kappa库DNA连接和轻链lambda库DNA连接；分四次电击转化TG1感受态细胞后将转化菌均匀涂布与含100ug/mL氨苄青霉素的2YTAG平板中；收集所有克隆的质粒DNA，即为抗体库DNA；

（7）进行天然人源Fab噬菌体抗体库的多样性分析。

2.由权利要求1所述方法筛选到的单克隆抗体。

3.根据权利要求2筛选到的单克隆抗体，其为抗CD6单克隆抗体，其Fab抗体的VH-CH1的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，Vkappa-Ckappa的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

4.根据权利要求3所述的单克隆抗体，其特征在于，抗CD6单克隆抗体的生物筛选的过程为：富集筛选kappa链噬菌体抗体库→噬菌体库ELISA→单克隆噬菌体ELISA鉴定→PCR指纹图谱认证→单克隆菌落测序→噬菌体ELISA结果验证。

说明书

噬菌体抗体库的构建方法及应用此库筛选到的抗CD6抗体

技术领域

[0001] 本发明涉及抗体工程技术领域，特别涉及一种噬菌体抗体库的构建方法及此库在抗体筛选中的作用，尤其涉及应用此库筛选到的抗CD6抗体。

背景技术

[0002] 抗体库技术是90年代抗体工程领域的重大进展，它是噬菌体展示和抗体库两种技术的集成，它的出现有赖于PCR技术的建立、抗体分子在大肠杆菌的功能性表达以及噬菌体展示技术的发展。噬菌体抗体库技术的原理就是将抗体分子的Fab或ScFv等片段与单链噬菌体外壳蛋白形成融合蛋白，展示于噬菌体颗粒表面。噬菌体抗体库技术模拟了抗体免疫系统的选择作用，呈现在噬菌体表面的抗体能够在体外与固相化的靶抗原相互作用，然后反复洗涤去除非特异性结合抗体，再洗脱并收集与抗原结合的噬菌体，再次感染大肠杆菌，使特异的噬菌体得到富集。

[0003] 建立噬菌体抗体库的目的是为了有效的获得针对各种抗原的人源抗体。抗体库的筛选方法可分为：（1）液相抗原的筛选，可较好地保持抗原的天然构象；（2）完整细胞的筛选，适用于难以纯化的或未知的抗原，但此法细胞膜成分复杂，难度较大；（3）组织筛选，用于一些难以获得单个细胞的组织进行特异性抗体的筛选。噬菌体抗体库将基因型和表型统一于一体，将选择能力与扩增能力偶连起来，具有强大的筛选功能，能能够在体外模拟体内的抗体生成过程，使抗体工程技术进入了一个新的时代。

[0004] 目前，噬菌体抗体库主要用于表达筛选Fab和单链抗体（ScFv）。Fab即抗原结合片段（fragment of antigen binding）是由重链Fd段和完整轻链组成，是完整抗体分子的三分之一，在体内的稳定性要远高于单链抗体，并且具有易于进行结构改造且细菌内表达产物多为有功能的抗体片段等优点，因此，Fab在研究抗体可变区的功能活性以及临床应用有着不可比拟的优点。

[0005] 治疗性抗体的发展经历了异源抗体、人源化抗体和人源性抗体几个阶段。目前，人源性抗体是治疗性抗体发展的主要方向，而噬菌体抗体库技术的出现为人源性抗体的制备提供了良好的技术平台，并且逐渐成为目前获得人源性抗体的主要手段之一。

[0006] 抗CD6单克隆抗体在牛皮鲜及类风湿性关节炎等疾病的治疗方面已经显示了较好的治疗效果，因此抗CD6单克隆抗体的筛选已经成为抗体领域的研究热点。

[0007] CD6分子是I型跨膜糖蛋白，胞外区有3个富含半胱氨酸的功能区重复序列，属于SRCRSF家族，CD6有105/110KD和130KD两种异构型。CD6分子序列全长668个氨基酸，去除N-末端17个氨基酸信号肽序列后，CD6分子胞外区385个氨基酸，胞外区至少有3个表位:SRCR1、SRCR2和SRCR3。目前研究较多的CD6配体是ALCAM(CD166)。CD6/CD6L配体相互作用可能通过下列途径调节T细胞活化：①通过PKC途径激活T细胞。②CD6与CD6L粘附促进并延长T细胞与APC的接触，从而延长了经TRC/CD3或CD2通路产生的刺激；③CD62+
交联可以触发细胞浆游离Ca 浓度增加。

[0008] CD6参与T细胞的活化，发挥免疫效应，同时表明CD6也参与免疫自稳的功能。目前，对CD6在淋巴细胞的活化和分化中的准确机制还不是很清楚。但越来越多的研究表明CD6是T淋巴细胞活化的重要辅助分子，提供淋巴细胞活化的共刺激信号。基于CD6分子在淋巴细胞成熟、活化和增殖中的重要作用，阻断CD6分子的功能可为类风湿性关节炎、银屑病等自身免疫性疾病的治疗提供新的治疗手段和方法。

[0009] 因此，为了满足高通量筛选临床治疗用的低抗原性、高亲和性抗体，构建具有高度多样性、通用性好、无抗原偏向性的大容量天然人源Fab噬菌体抗体库有着极其重要的应用价值。并且该抗体库在如抗CD6抗体等人源化抗体的筛选方面具有重要的作用。

发明内容

[0010] 本发明的目的在于提供一种构建高度多样性的大容量天然人源Fab噬菌体抗体库的方法，以及应用此库筛选出一株抗CD6抗原的单克隆抗体。该抗体库主要用于高通量筛选临床治疗用的低抗原性和高亲和性人源抗体。

[0011] 本发明的技术方案如下：

[0012] 一种天然人源Fab噬菌体抗体库的构建方法，包括如下步骤：

[0013] （1）构建噬菌体展示Fab抗体的噬粒载体PFK-1，PFL-6；

[0014] （2）人外周血淋巴细胞的分离及总RNA的提取，通过RT-PCR合成cDNA；

[0015] （3）以cDNA为模板，采用一组几乎覆盖人抗体全部重链或轻链可变区编码序列的特异性引物进行PCR反应，扩增轻链kappa，lambda和重链可变区基因；

[0016] （4）将轻链kappa链和lambda链可变区基因分别与噬粒载体PFK-1，PFL-6连接，构建kappa链，lambda链轻链抗体库；

[0017] （5）将重链VH片段基因与噬粒载体PFK-1连接，收集所有克隆质粒的DNA，构建重链抗体库；

[0018] （6）将重链可变区基因从重链抗体库DNA中切出，分别与轻链kappa库DNA连接和轻链lambda库DNA连接得到完整的抗体库DNA；

[0019] （7）进行天然人源Fab噬菌体抗体库的多样性分析。

[0020] 在上述方法中，步骤（1）中所述构建噬粒载体的方法为：重链CH1恒定区基因分别以限制性内切酶AscI和NotI进行酶切，纯化后重链CH1恒定区基因与噬菌体载体PCSm连接，转化大肠杆菌DH5α中，构建了PCSm-CH1载体。轻链Lambda链和kappa链恒定区基因分别用HindIII和AscI进行酶切，纯化后分别将lambda和kappa链恒定区基因与PCSm-CH1载体连接，转化大肠杆菌DH5α中，构建的载体命名为PFK-1，PFL-6。

[0021] 在上述方法中，步骤（2）所分离及总RNA提取来源于15份年龄分布为30-40岁之间的健康志愿者的外周血分离的淋巴细胞。

[0022] 在上述方法中，步骤（3）所述一组几乎覆盖人抗体全部重链或轻链可变区编码序列的特异性引物，可以扩增得到几乎覆盖人免疫球蛋白（IgG）的全部重链和轻链可变区基因，所述引物如下所示：

[0023] 扩增kappa轻链可变区基因的上游引物为：

[0024] 5’VK-1：

[0025] GCTGGCTTAGTCTTGGCCTTCTCGGCCAGCGCAGACATCCAGWTGACCCA

[0026] 5’VK-2：

[0027] GCTGGCTTAGTCTTGGCCTTCTCGGCCAGCGCAGATGTTGTGATGACTCAG

[0028] 5’VK-3：

[0029] GCTGGCTTAGTCTTGGCCTTCTCGGCCAGCGCAGAAATTGTGWTGACRCA

[0030] 5’VK-4：

[0031] GCTGGCTTAGTCTTGGCCTTCTCGGCCAGCGCAGATATTGTGATGACCCAG

[0032] 扩增kappa轻链可变区基因的下游引物为：

[0033] 3’VK-1：

[0034] ACGTTTGATCTCGAGCTTGGTCCCYTGGCCRAA

[0035] 3’VK-2：

[0036] ACGTTTGATCTCGAGTTTGGTCCCAGGGCCGAA

[0037] 3’VK-3：

[0038] ACGTTTGATCTCGAGCTTGGTCCCTCCGCCGAA

[0039] 扩增lambda轻链可变区基因的上游引物为:

[0040] 5’VL-1：

[0041] GCTGGCTTAGTCTTGGCCTTCTCGGCCAGCGCACAGTCTGTGYTGACKCAG

[0042] 5’VL-2：

[0043] GCTGGCTTAGTCTTGGCCTTCTCGGCCAGCGCACARTCTGCCCTGACTCAG

[0044] 5’VL-3：

[0045] GCTGGCTTAGTCTTGGCCTTCTCGGCCAGCGCATCCTATGWGCTGACTCAG

[0046] 5’VL-4：

[0047] GCTGGCTTAGTCTTGGCCTTCTCGGCCAGCGCATCTTCTGAGCTGACTCAG

[0048] 5’VL-5：

[0049] GCTGGCTTAGTCTTGGCCTTCTCGGCCAGCGCACAGGCTGTGCTGACTCAG

[0050] 5’VL-6：

[0051] GCTGGCTTAGTCTTGGCCTTCTCGGCCAGCGCAAATTTTATGCTGACTCAGC

[0052] 扩增lambda轻链可变区基因的下游引物为:

[0053] 3’VL-1：

[0054] CTTGGGCTGACCTAGGACGGTSACCTTGGTSCC

[0055] 3’VL-2：

[0056] CTTGGGCTGACCTAGGACGGTCAGCTYSGTCCC

[0057] 3’VL-3：

[0058] CTTGGGCTGACCTAGGATGATCAGCTGGGTTCC

[0059] 扩增重链可变区基因的上游引物为：

[0060] 5’VH-1：

[0061] TTCTATTCTCACAGTGCACAGRTGCAGCTGGTGCARTCTGG

[0062] 5’VH-2：

[0063] TTCTATTCTCACAGTGCACAGSAGGTCCAGCTGGTRCAGTCTGG

[0064] 5’VH-3：

[0065] TTCTATTCTCACAGTGCACAGRTCACCTTGAAGGAGTCTGG

[0066] 5’VH-4：

[0067] TTCTATTCTCACAGTGCACAGSAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG

[0068] 5’VH-5：

[0069] TTCTATTCTCACAGTGCACAGGAGGTGCAGCTGGTGGAGWCYGG

[0070] 5’VH-6：

[0071] TTCTATTCTCACAGTGCACAGGTGCAGCTACAGCAGTGGGG

[0072] 5’VH-7：

[0073] TTCTATTCTCACAGTGCACAGSTGCAGCTGCAGGAGTCSGG

[0074] 5’VH-8：

[0075] TTCTATTCTCACAGTGCACAGGARGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG

[0076] 扩增重链可变区基因的下游引物为：

[0077] 3’VH-1：

[0078] GGCCCTTGGTGCTAGCTGAGGAGACGGTGACCAGGGTKCC

[0079] 3’VH-2：

[0080] GGCCCTTGGTGCTAGCTGAAGAGACGGTGACCATTGTCCC

[0081] 3’VH-3：

[0082] GGCCCTTGGTGCTAGCTGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCC。

[0083] 上述方法中，步骤（4）中构建轻链库的方法为：将轻链kappa链和lambda链可变区基因分别用限制性内切酶SfiI和XhoI，SfiI和AvrII双酶切，纯化后Vkappa和Vlambda基因分别与噬粒载体PFK-1，PFL-6连接；将kappa部分连接产物纯化后溶于100uL无菌水中，电转入感受态细胞TG1后将转化菌均匀涂布于含100ug/ml氨苄青霉素的2YTAG平板中；收集所有克隆质粒的DNA即为kappa链轻链抗体库；用相同的方法获得lambda链轻链抗体库。

[0084] 上述方法中，步骤（5）中构建重链库的方法为：将重链VH片段基因分别用ApaLI和NheI进行双酶切，纯化后与噬粒载体PFK-1连接；将重链连接产物纯化后溶于100uL无菌水中，分四次电击转化TG1感受态细胞后将转化菌均匀涂布与含100ug/mL氨苄青霉素的2YTAG平板中；收集所有克隆质粒的DNA即为重链抗体库。

[0085] 上述方法中，步骤（6）中所述得到完整抗体库的方法为：采用ApaLI和NheI进行双酶切，将重链可变区基因从重链抗体库DNA中切出，分别与轻链kappa库DNA连接和轻链lambda库DNA连接。同法电击转化获得所有克隆的质粒DNA，即为抗体库DNA。

[0086] 本发明同时提供了通过该噬菌体抗体库的构建方法筛选到的单克隆抗体。

[0087] 本发明同时提供了通过该噬菌体抗体库的构建方法筛选到的抗CD6单克隆抗体，其Fab抗体VH-CH1的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，Vkappa-Ckappa的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

[0088] 本发明所述的抗CD6 Fab抗体的生物筛选过程为：富集筛选kappa链噬菌体抗体库→噬菌体库ELISA→单克隆噬菌体ELISA鉴定→PCR指纹图谱认证→单克隆菌落测序→噬菌体ELISA结果验证。

附图说明

[0089] 图1为PFK-1/PFL-6质粒载体图。

[0090] 图2为重链可变区基因和轻链可变区基因PCR扩增产物图。其中，M为100bp Ladder DNA Marker。

[0091] 图3为抗CD6筛选后噬菌体抗体库ELISA检测结果。

[0092] 图4为单克隆噬菌体展示ELISA结果。

[0093] 图5为BstNI酶切PCR片段指纹图谱。

[0094] 图6为抗CD6抗体验证ELISA检测结果。

具体实施方式

[0095] 本发明的实施方案通过下列实施例举例说明。然而本发明的实施方案不限于这些实施例的特定细节，因为对于本领域的普通技术人员来说，其它的变化是已知的，或根据直接公开的内容和附属的权利要求是显而易见的。因此，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。本文引用的参考文献以其全文通过引用并入本文。

[0096] 下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

[0097] 实施例1、用于噬菌体展示Fab抗体的噬粒载体的构建

[0098] 采用基因合成的方法，体外合成重链CH1恒定区基因，同时合成轻链Lambda链和kappa链恒定区基因。重链CH1恒定区基因分别以限制性内切酶AscI和NotI进行酶切，纯化后重链CH1恒定区基因与噬菌体载体PCSm（购自古巴分子免疫中心有限公司）连接，转化大肠杆菌DH5α中，构建了PCSm-CH1载体。将轻链Lambda链和kappa链恒定区基因分别用HindⅢ和AscI进行酶切，纯化后分别将lambda和kappa链恒定区基因与PCSm-CH1载体连接，转化大肠杆菌DH5α中，构建PCSm-CH1-Ckappa载体和PCSm-CH1-Clambda载体。将这两种载体命名为PFK-1，PFL-6，结果如图1所示。

[0099] 实施例2、人外周血淋巴细胞的分离及总RNA的提取

[0100] 分别收集15份年龄分布为30~40岁之间的健康志愿者外周血各2mL，分别采用淋巴细胞分离液分离获得外周血淋巴细胞，每份淋巴细胞的量约为5×106。采用Trizol法从淋巴细胞中提取总RNA。

[0101] 实施例3、人源抗体重链和轻链可变区基因的扩增

[0102] 采用omniscript RT kit(购自Qiagen有限公司)进行RT-PCR反应，将淋巴细胞总RNA反转录成cDNA。以cDNA为模板，然后采用一组几乎覆盖人抗体全部重链或轻链可变区编码序列的特异性引物（发明内容部分有详述）进行PCR反应，扩增轻链kappa，lambda和重链可变区基因。扩增条件为：98℃，3min，然后98℃，30sec，56℃，30sec，72℃，30sec，共30个循环，最终延长为72℃，10min。PCR产物经1.5%的凝胶电泳鉴定，显示重链可变区基因长度为390bp左右。轻链kappa，lambda可变区基因长度为350bp左右。结果如图2所示。

[0103] 实施例4、天然人源Fab噬菌体抗体库的构建

[0104] 将轻链kappa链和lambda链可变区基因分别用限制性内切酶SfiI和XhoI，SfiI和AvrII双酶切，纯化后Vkappa和Vlambda基因分别与噬粒载体PFK-1，PFL-6连接。将kappa部分连接产物纯化后溶于100uL无菌水中，分四次电击转化TG1感受态细胞后将转化菌均匀涂布与含100ug/mL氨苄青霉素的2YTAG平板中。收集所有克隆质粒的DNA即为kappa链轻链抗体库。用相同的方法获得lambda链轻链抗体库。

[0105] 将重链VH片段基因分别用ApaLI和NheI进行双酶切，纯化后与噬粒载体PFK-1连接。将重链连接产物纯化后溶于100uL无菌水中，分四次电击转化TG1感受态细胞后将转化菌均匀涂布与含100ug/mL氨苄青霉素的2YTAG平板中。收集所有克隆质粒的DNA即为重链抗体库。

[0106] 采用ApaLI和NheI进行双酶切，将重链可变区基因从重链抗体库DNA中切出，分别与轻链kappa库DNA连接和轻链lambda库DNA连接。同法电击转化获得所有克隆的质粒DNA，即为抗体库DNA。同时将转化菌梯度稀释，涂板后计算菌落个数。获得kappa链Fab8 8
抗体库容量为2.85×10，lambda链Fab抗体库容量为2.9×10，符合大容量噬菌体抗体库的要求。

[0107] 实施例5、天然人源Fab噬菌体抗体库的多样性分析

[0108] 对两次随机挑选克隆获得lambda链和重链基因插入正确的28个克隆进行序列分析，重链可变区V片段分属于VH1~7基因家族。其中，VH1基因家族有11条，占39%。VH4基因家族8条（29%），VH5基因家族4条（14%），VH3基因家族3条（11%），VH2基因家族1条（3.5%），VH6基因家族1条（3.5%）。重链可变区J片段分属于1~6家族，以JH4家族最多占43%。28条Lambda轻链可变区V片段分属于Vλ1~10家族。其中Vλ3基因家族13条（46%），Vλ1基因家族4条（14%），Vλ2基因家族4条（14%），Vλ9基因家族3条（11%），Vλ6基因家族2条（7%），Vλ5基因家族1条（3.5%），Vλ10基因家族1条（3.5%）。Lambda链轻链可变区J片段分属于Jλ1~3家族。由此说明天然人源lambda链IGg Fab噬菌体抗体库具有高度的多样性。

[0109] 对两次随机挑选克隆获得kappa链和重链基因插入正确的20个克隆进行序列分析，重链可变区V片段分属于VH1~7基因家族。其中，VH1基因家族有7条，占35%。VH4基因家族4条（20%），VH3基因家族4条（20%），VH5基因家族3条（15%），VH2基因家族2条（10%）。重链可变区J片段分属于1~6家族，以JH4家族最多占35%。20条kappa轻链可变区V片段分属于Vκ1~3家族。其中Vκ3基因家族9条（45%），Vκ2基因家族8条（40%），Vκ1基因家族3条（15%）。Kappa链轻链可变区J片段分属于Jκ1~5家族。由此说明天然人源Kappa链IGg Fab噬菌体抗体库具有高度的多样性。

[0110] 实施例6、抗CD6Fab抗体的生物淘选

[0111] 1、kappa链噬菌体抗体库的富集筛选

[0112] 以CD6为抗原包被免疫管，采用4%的PBSM封闭。向免疫管中加入kappa噬菌体库进行抗体抗原结合，PBS（吐温20）洗去未结合的噬菌体。100mM/L TEA洗脱抗体，将洗脱下来的抗体重新感染TG1细胞，2YTAG平板培养过夜。将大肠杆菌从平板刮下，重新摇菌并加入M13辅助噬菌体进行噬菌体扩增，PEG/Nacl沉淀纯化噬菌体用于下一轮筛选。共进行四轮噬菌体库富集筛选。

[0113] 2、噬菌体库ELISA

[0114] 以CD6包被ELISA板，BSA（牛血清蛋白）、抗Myc单抗分别做阴性和阳性对照。将每轮富集后的噬菌体库分别经行1:10，1:100，1:1000稀释，然后加入ELISA板进行孵育。洗板后，加入anti-M13 monoclonal antibody/HRP（抗-M13单抗/辣根过氧化酶）进行孵育，TMB（四甲基联苯胺）显色。结果显示，CD6从第二轮富集开始获得阳性结果，如图3所示。

[0115] 3、单克隆噬菌体ELISA鉴定

[0116] 将第二轮，第三轮，第四轮洗脱下来的噬菌体感染TG1细胞，涂2YTAG平板获得单菌落。挑取84个单菌落培养在96孔深孔板中，加入辅助噬菌体M13进行噬菌体扩增。吸取扩增后的噬菌体进行ELISA鉴定。结果显示每个单克隆噬菌体都显示阳性结果，如图4所示。

[0117] 4、PCR指纹图谱认证及单克隆菌落测序

[0118] 选取第三轮富集后的单克隆进行PCR指纹图谱认证。采用菌落PCR的方法从42个样品中扩增Fab全长DNA。然后采用BstNI对PCR片段进行酶切。4%的琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果。结果显示：42个样品含有相同的DNA片段图案，如图5所示。随即选取6个样品进行测序。结果显示6个样品拥有相同的Fab抗体的氨基酸序列和DNA序列，VH-CH1的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，DNA序列如SEQ ID NO：2所示；Vkappa-Ckappa的氨基酸序列如SEQ IDNO：3所示，DNA序列如SEQ ID NO：4所示。

[0119] SEQ ID NO：1：

[0120] MKKIWLALAGLVLAFSASAQVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGASFGDDYWSWIRQAPGRGLEWIGEINRAGRTFYDPSVKSRVTISMDTSKNQFSLRLTSVTAADTAVYYCARGRIIQRSSLHFDFWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC

[0121] SEQ ID NO：2：

[0122] ATGAAAAAGATTTGGCTGGCGCTGGCTGGTTTAGTTTTAGCGTTTAGCGCAAGTGCACAGGTGCAGCTACAGCAGTGGGGCGCAGGACTGTTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCGCTGTCTATGGTGCGTCCTTCGGTGATGACTACTGGAGCTGGATCCGCCAGGCCCCAGGGAGGGGGCTTGAGTGGATTGGTGAAATCAATCGTGCTGGACGCACCTTCTACGACCCGTCCGTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAATGGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAGGCTGACCTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCTGTCTATTACTGTGCGAGAGGCAGAATAATCCAGAGGAGTAGCCTTCACTTTGACTTCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTCCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTAGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGT

[0123] SEQ ID NO：3：

[0124] MKKIWLALAGLVLAFSASADIVMTQTPSPLSASVGDRVTITCRASQSISTYVNWYQQKPGKAPRLLIYDGSRLESGVPSRFSASGSGTDFTLTISGLQPEDCATYYCQQSYSASRGSFGPGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

[0125] SEQ ID NO：4：

[0126] ATGAAGAAAATCTGGCTGGCACTGGCTGGCTTAGTCTTGGCCTTCTCGGCCAGCGCAGATATTGTGATGACCCAGACTCCATCTCCCTTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGTACCTATGTAAATTGGTATCAACAAAAACCAGGGAAAGCCCCTAGGCTTCTGATTTACGATGGATCCAGATTGGAGAGTGGGGTCCCATCGAGGTTCAGTGCCAGTGGGTCTGGAACAGATTTCACTCTCACCATCAGCGGTCTGCAACCTGAAGATTGTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTACAGTGCCTCCCGAGGAAGTTTCGGCCCTGGGACCAAACTCGAGATCAAACGTACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGTTCACCGGTGACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT

[0127] 5、噬菌体ELISA进行结果验证

[0128] 从6个Fab DNA序列相同的样品中选取1个样品（1A），进行噬菌体的扩增和纯化。以CD6包被ELISA板子，并进行ELISA检测。结果显示：在1:10，1:100两个稀释度获得强阳性，证明富集后获得的Fab抗体片段可以和CD6特异性结合，结果如图6所示。