IGF-I聚乙二醇缀合物

摘要

本文报道了制备与一个聚乙二醇缀合的多肽的方法，所述方法包括a)提供编码表达构建体的核酸，所述核酸在5′至3′方向上包含编码多肽的核酸，以及编码胰蛋白酶位点SEQ ID NO：01的核酸，b)在细胞中表达a)的核酸，并且从细胞和/或培养基回收表达构建体，c)给目标肽提供于C末端赖氨酸残基处与聚乙二醇共价缀合的氨基酸序列SEQ ID NO：02，d)将表达构建体和目标肽与胰蛋白酶突变体D189K，K60E，N143H，E151H温育，并且e)从温育混合物回收并由此产生与一个聚乙二醇缀合的多肽。

权利要求

1.制备与聚乙二醇残基缀合的多肽的方法，所述方法包括以下步骤a)将融合多肽和目标多肽与具有突变D189K,K60E,N143H和E151H的胰蛋白酶突变体温育，所述融合多肽由核酸编码，所述核酸在5’至3’方向上由以下组成：i)编码所述多肽的核酸、ii)编码氨基酸序列SEQ ID NO:01的核酸和iii)编码氨基酸序列SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:27的核酸，所述目标多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO:02并且在C末端赖氨酸残基处与聚乙二醇残基共价缀合，和b)回收并由此产生与一个聚乙二醇残基缀合的多肽。

2.权利要求1的方法，其特征在于所述温育包括

i)将所述融合多肽和所述目标多肽与盐酸胍在缓冲溶液中温育，ii)将具有突变D189K,K60E,N143H和E151H的胰蛋白酶突变体与Zn(II)-盐温育，和iii)合并并且温育i)和ii)的温育混合物。

3.权利要求1至2中任一项的方法，其特征在于所述温育为150分钟至180分钟。

4.权利要求1至2中任一项的方法，其特征在于步骤a)中的核酸包含iii)编码氨基酸序列SEQ ID NO:13的核酸。

5.权利要求1至2中任一项的方法，其特征在于所述温育是在HEPES缓冲溶液中。

6.权利要求1至2中任一项的方法，其特征在于所述多肽是人IGF-I。

7.权利要求6的方法，其特征在于所述融合多肽具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列。

8.权利要求1至2中任一项的方法，其特征在于所述编码融合多肽的核酸是编码具有氨基酸序列SEQ ID NO:10的多肽的核酸。

说明书

IGF-I聚乙二醇缀合物

[0001] 本文报道了用于将包含聚乙二醇残基的第一多肽选择性酶催化C末端缀合至第二多肽的方法，即酶催化PEG化的方法。

[0002] 发明背景

[0003] 蛋白疗法在过去数十年间已变得非常重要，原因在于此类药物目标在于以前不能治愈的疾病。由于其分子大小非常不同于常规低分子量物质，所以蛋白药物制剂是有挑战性的。此外，蛋白质具有若干其他特性，如其二级和三级结构对合适的功能性是必须的。它们易受许多类型的降解或修饰，并且其制剂必须保证稳定性并保持在其有效和安全的目标剂量之内。

[0004] 有关蛋白质作为药物化合物的其他问题出现在患者体内，例如免疫原性反应，快速从躯体清除导致降低的半衰期，以及药物在行使其作用前被蛋白水解切割破坏(Brown，L.R.，Expert Opinion Drug Deliv.2(2005)29-42)。

[0005] 为解决这些问题，一种方法是将化学改变引入到蛋白分子中，例如将一个或多个聚乙二醇残基共价结合到蛋白药物。此方法称作PEG化。PEG化的优点在于所得缀合物的分子量和流体动力学尺寸的增加。新的缀合物较不容易为蛋白水解酶以及中和抗体或免疫细胞所接近。因此，PEG化可用于使药物免于不需要的切割并且还降低过敏副作用的可能性。增加的大小还影响从身体的清除，原因在于蛋白-PEG缀合物太大以至于不能通过肾超滤被除去(Veronese，F.M.和Pasut，G.，Drug Discovery Today(今日药物发现)10(2005)1451-1458；Brown，L.R.，Expert Opinion Drug Deliv.2(2005)29-42)。聚乙二醇本身极大的改善了新药物的性质。此外，PEG缺乏毒性是一个主要优势。总之，PEG化是用于增加蛋白药物的血液循环寿命的众所周知的方法(Kozlowski，A.和Harris，M.J.，Journal of Controlled Release(受控释放杂志)72(2001)217-224)。多种PEG化的蛋白药物是市售的，例如Schering Plough的 Pfizer的和RochePharmaceuticals的 (Pasut，G.等，Expert Opinion on Therapeutic Patents 14(2004)859-894)。

[0006] 对于具有温和条件、高的化学和区域特异性和合适产物产量的酶催化位点特异性修饰存在极大的兴趣。在本领域中已经进行了很多尝试。Mao等(Mao，H.等，J.Am.Chem.Soc.(美国化学学会杂志)126(2004)2670-2671)开发出用于C末端修饰的分选酶(sortase)介导的蛋白连接方法。Sato(Sato，H.，Advanced Drug Delivery Reviews54(2002)487-504)建立了一种系统，该系统使用转谷氨酰胺酶将聚乙二醇位点特异地引入到完整蛋白和嵌合蛋白中，所述蛋白接受有转谷氨酰胺酶的特殊底物序列。免疫球蛋白A蛋白酶(IgA蛋白酶)已经被Lewinska等(Lewinska，M.等，Bioconjugate Chemistry
15(2004)231-234)用于修饰天然蛋白的N端。Hoess等已经开发了突变的胰蛋白酶(WO
2006/015879)。

[0007] 发明概述

[0008] 本文报道了用于将多肽与一个或多个聚乙二醇分子选择性C末端共价缀合的方法。这是这样的一种方法，其中与聚乙二醇共价缀合的小肽被通过酶催化方法转移到要被PEG化的目的多肽。已经发现，Strep标签在胰蛋白酶切割位点C末端的存在增强了C端位点特异性修饰。

[0009] 如本文所报道的第一方面是制备与聚乙二醇残基缀合的多肽的方法，所述方法包括

[0010] a)提供编码融合多肽的核酸，其在5′至3′方向上包含

[0011] i)编码多肽的核酸，以及

[0012] ii)编码氨基酸序列SEQ ID NO：01的核酸，

[0013] b)在细胞中表达a)的核酸，并且从细胞和/或培养基回收融合多肽，[0014] c)给目标肽提供于C末端赖氨酸残基处与聚乙二醇残基共价缀合的氨基酸序列SEQ ID NO：02，

[0015] d)将融合多肽和目标肽与胰蛋白酶突变体D189K，K60E，N143H，E151H温育，并且[0016] e)从温育混合物回收并由此产生与一个聚乙二醇残基缀合的多肽。

[0017] 在一个实施方案中，所述温育包括

[0018] i)在缓冲溶液中将融合多肽和目标肽与盐酸胍温育，

[0019] ii)将胰蛋白酶突变体D189K，K60E，N143H，E151H与Zn(II)盐一起温育，[0020] iii)合并并温育i)和ii)的温育混合物。

[0021] 在如本文所报道的方法的一个实施方案中，融合多肽在N至C末端方向上包含要被PEG化的多肽，胰蛋白酶-4x-突变体切割位点和Strep标签。在另一个实施方案中，编码融合多肽的核酸在5’至3’方向上包含i)编码要被PEG化的多肽的核酸，ii)编码氨基酸序列SEQ ID NO：01的核酸，以及iii)编码SEQ ID NO：13或27的Strep标签的核酸。

[0022] 在另一个实施方案中，温育总共150分钟至180分钟。在另一个实施方案中，编码融合多肽的核酸还包含iii)编码氨基酸序列SEQ ID NO：13的核酸。在一个实施方案中，所述多肽是人IGF-I。

[0023] 在一个实施方案中，温育是在HEPES缓冲溶液中。在另一个实施方案中，在HEPES缓冲溶液中的温育为至少20小时。在另一个实施方案中，温育为20小时至54小时。在另一个实施方案中，在20℃进行温育。

[0024] 在一个实施方案中，融合多肽具有选自SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12的氨基酸序列。在另一个实施方案中，编码融合多肽的核酸是编码具有氨基酸序列SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12的多肽的核酸。

[0025] 如本文所报道的另一个方面是具有氨基酸序列SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：29并且在C末端赖氨酸残基与一个聚乙二醇残基缀合的多肽。

[0026] 如本文所报道的一个方面是一种药物组合物，其包含具有氨基酸序列SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：29并且在C末端赖氨酸残基与一个聚乙二醇残基缀合的多肽或用如本文所报道的方法获得的多肽。

[0027] 如本文所报道的另一个方面是具有氨基酸序列SEQ ID NO：28或SEQID NO：29并且在C末端赖氨酸残基与一个聚乙二醇残基缀合的多肽或用如本文所报道的方法获得的多肽在制备用于治疗阿尔茨海默病的药物中的用途。

[0028] 如本文所报道的另一个方面是具有氨基酸序列SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：29并且在C末端赖氨酸残基与一个聚乙二醇残基缀合的多肽或用如本文所报道的方法获得的多肽，所述多肽用作药物。

[0029] 如本文所报道的一个方面是具有氨基酸序列SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：29并且在C末端赖氨酸残基与一个聚乙二醇残基缀合的多肽或用如本文所报道的方法获得的多肽，所述多肽用于治疗或预防阿尔茨海默病。

[0030] 如本文所报道的另一方面是一种治疗方法，所述方法包括向需要其的受试者给予治疗有效量的具有氨基酸序列SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：29并且在C末端赖氨酸残基与一个聚乙二醇残基缀合的多肽或用如本文所报道的方法获得的多肽。

[0031] 如本文所报道的另一个方面是包含氨基酸序列SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：29并且在C末端赖氨酸残基与一个聚乙二醇残基缀合的多肽。

[0032] 如本文所报道的另一个方面是一种药物组合物，其包括包含氨基酸序列SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：29并且在C末端赖氨酸残基与一个聚乙二醇残基缀合的多肽。如本文所报道的另一方面是包含氨基酸序列SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：29并且在C末端赖氨酸残基与一个聚乙二醇残基缀合的多肽，所述多肽用于治疗神经变性疾病(neurodegenerative disorder)。在一个实施方案中，所述神经变性疾病是阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)。

[0033] 发明详述

[0034] 本文报道了用于将多肽与一个(或多个)聚乙二醇残基选择性C末端共价缀合的方法。这是这样的一种方法，其中与聚乙二醇共价缀合的小肽被通过酶催化转移到要被PEG化的多肽。

[0035] 如本文所报道的酶催化方法给常规的需要化学品和特殊底物的方法提供了备选方案。通过实施本发明的方法，由于仅获得单一的位点特异性修饰，所以不再需要分离同种型。此外，温和的反应条件防止蛋白变性并且，因此，限制产物损失。此外，可能对天然存在的多肽进行位点特异的单PEG化，其使得经工程改造的突变体变得多余。

[0036] 术语“氨基酸”当在本文中使用时是指羧基α-氨基酸的组，其可以直接或以前体的形式为核酸所编码。个体氨基酸为由三个核苷酸组成的核酸(所谓的密码子或碱基三联体)所编码。每个氨基酸由至少一个密码子所编码。这称作“遗传密码的简并性”。术语“氨基酸”当在本申请中使用时是指天然存在的羧基α-氨基酸，包括丙氨酸(三字母代码：ala，单字母代码：A)，精氨酸(arg，R)，天冬酰胺(asn，N)，天冬氨酸(asp，D)，半胱氨酸(cys，C)，谷氨酰胺(gln，Q)，谷氨酸(glu，E)，甘氨酸(gly，G)，组氨酸(his，H)，异亮氨酸(ile，I)，亮氨酸(leu，L)，赖氨酸(lys，K)，甲硫氨酸(met，M)，苯丙氨酸(phe，F)，脯氨酸(pro，P)，丝氨酸(ser，S)，苏氨酸(thr，T)，色氨酸(trp，W)，酪氨酸(tyr，Y)和缬氨酸(val，V)。

[0037] 本领域技术人员已知的用于实施本发明的方法和技术描述于例如Ausubel，F.M.(编辑)，Current Protocols in Molecular Biology(当今分子生物学方法)，卷I至III(1997)，Wiley and Sons；Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，Second Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)。

[0038] 当用于本文时，“药用载体”包括任何以及所有生理学相容的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收/再吸收延迟剂等。在一个实施方案中，该载体适于注射或输注。药用载体包括无菌水溶液或分散液以及用于制备无菌水溶液或分散液的无菌粉末。这样的介质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域中已知的。除了水，载体可以是例如等渗缓冲盐溶液。

[0039] 术语“聚乙二醇残基”或″PEG”或“PEG分子″是指包含聚乙二醇作为主要级分或部分的分子或残基。这种聚乙二醇可以包含一个或多个另外的化学基团，所述一个或多个另外的化学基团是结合反应所必需的，由分子的化学合成产生，或是用于所述分子的各个部分的最佳距离的间隔区(spacer)。这些另外的化学基团不用于计算聚乙二醇的分子量。此外，这样的聚乙二醇可以包含一个或连在一起的多个聚乙二醇链。具有超过一个聚乙二醇链的聚乙二醇被称作多臂或分支聚乙二醇。分支聚乙二醇可以例如通过将聚环氧乙烷添加到多种多元醇制备，所述多元醇包括甘油、季戊四醇和山梨糖醇。分支聚乙二醇报道于例如EP 0473084和US 5,932,462中。在一个实施方案中，聚乙二醇残基是分子量为20-35kDa的聚乙二醇残基并且是直链聚乙二醇残基。在另一个实施方案中，聚乙二醇残基是分子量超过35kDa(尤其是具有40kDa)的聚乙二醇残基，并且是分支聚乙二醇残基。在另一个实施方案中聚乙二醇残基的分子量为40kDa并且是双臂聚乙二醇残基。

[0040] 术语″PEG化″是指聚乙二醇分子在多肽的N端和/或内部的赖氨酸残基处的共价连接。多肽的PEG化在现有技术中是广泛已知的并且由例如Veronese，F.M.，Biomaterials 22(2001)405-417进行了综述。可以使用不同的官能团和具有不同分子量的聚乙二醇分子、直链和分支PEG以及不同的连接基团将PEG分子与多肽连接(同样参见Francis，G.E.等，Int.J.Hematol(国际血液学杂志).68(1998)1-18；Delgado，C.等，Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Systems 9(1992)249-304)。多肽的PEG化可以在水溶液中进行，使用例如在WO 00/44785中所述的PEG化试剂，在一个实施方案中，使用NHS活化的分子量在5kDa和40kDa之间的直链或分支PEG分子。根据Lu，Y.等，Reactive Polymers22(1994)221-229，PEG化也能够在固相进行。非随机地，也可以根据WO 94/01451制备N末端PEG化的多肽。

[0041] ″多肽″是自然产生的或合成的由通过肽键共价结合的氨基酸残基组成的聚合物。少于约20个氨基酸残基的多肽可以称为″肽″，而由两个或多个多肽组成或包含一个长度超过100个氨基酸残基的多肽的分子可以称作“蛋白质”。多肽也可以包含非氨基酸组分，如碳水化合物基团，金属离子或羧酸酯。非氨基酸组分可以由表达该多肽的细胞添加，并且可以随细胞类型而变化。本文中根据其氨基酸骨架结构或编码其的核酸来定义多肽。虽然如碳水化合物基团之类的添加通常不被指明，但是其可以存在。

[0042] Hoess等制备了胰蛋白酶突变体D189K，K60E，N143H，E151H(胰蛋白酶-4x-突变体)，所述突变体能够克服胰蛋白酶对水解的占优势的亲和性。此外，此突变体不显示显著的赖氨酸和精氨酸的蛋白水解C末端。胰蛋白酶-4x-突变体识别特异性基序，即序列酪氨酸-精氨酸-组氨酸(YRH)。胰蛋白酶-4x-突变体能够通过构建涉及组氨酸残基之间2+
的Zn 离子的螯合物而与此识别位点特异性地相互作用。此识别序列出现在人多肽中的可能性非常小。因此，多位点特异性修饰和/或不需要的切割不太可能发生。为保证胰蛋白酶-4x-突变体的最佳识别，对此序列的进一步修饰导致特殊标签的开发，所述特殊标签是一种经修饰的“胰蛋白酶位点”，其由氨基酸序列酪氨酸-精氨酸-组氨酸-丙氨酸-丙氨酸-甘氨酸(YRHAAG)(SEQ ID NO：01)组成。此肽可以融合到多肽的C端，由此形成胰蛋白酶-4x-突变体的底物。此外，目标肽是必需的，以使位点特异性PEG化成为可能。此肽应当与“胰蛋白酶位点”重叠，并由氨基酸序列精氨酸-组氨酸-丙氨酸-赖氨酸(RHAK)(SEQ ID NO：02)组成。可以通过酶催化将此目标肽转移到多种分子。胰蛋白酶-4x-突变体切割酪氨酸和组氨酸残基之间的肽键，由此除去部分的“胰蛋白酶位点”(RHAAG)(SEQ ID NO：03)。短的非天然氨基酸序列(YRHAK)(SEQ ID NO：04)保留在蛋白和结合的亲核体(nucleophile)之间。然而，此短的延伸被结合的亲核体例如聚乙二醇残基适度屏蔽，并且因此，此肽不太可能有免疫原活性。

[0043] 胰蛋白酶-4x-突变体中的修饰不能够完全排除水解副反应。因此，仅在通过添加2+
乙二胺四乙酸(EDTA)以络合Zn 离子来将反应在正确的时间停止时(如在如本文所报道的方法的一个实施方案中那样)或通过将pH调节至酸性水平使pH范围为适当的酶功能性所必需时(如在如本文所报道的方法的另一个实施方案中那样)才能获得最大产率。

[0044] 一些重组蛋白包含特殊的融合标签，例如用于方便随后的纯化步骤或只是允许构建体的表达(否则太小就难以保证其在宿主细胞中的合适生产)。一些已确立的标签是六组氨酸标签(His标签)或Strep标签。His标签可以用于通过金属-亲和层析来纯化融合蛋白，而Strep标签被应用于使用链霉抗生物素蛋白柱来纯化融合蛋白(Terpe，K.，Appl.Microbiol.Biotechnol.60(2003)523-533)。在某些条件下，必须将这些标签切除，例如对于药物或仅是为了保证正确的再折叠(如果需要)。使用具有定义的识别位点的蛋白酶的酶切是最合乎需要的方法。来源于淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhoeae)的免疫球蛋白A蛋白酶(IgA蛋白酶)被用于如本文所报道的方法的一个实施方案。据报道，IgA蛋白酶的识别位点是Yaa Pro↓Xaa Pro(Yaa代表Pro或者(很少地)代表与Ala，Gly或Thr组合的Pro：Pro Ala、Pro Gly或Pro Thr；Xaa代表Thr、Ser或Ala)。来自淋病奈瑟球菌的IgA蛋白酶的合成肽底物是已知的蛋白自水解位点(参见例如Wood和Burton，Infection and Immunity(感染和免疫)59(1991)1818-1822)。已知的IgA蛋白酶的识别位点包括以下序列，其中“↓”表示被切割的键的位置：

[0045] Pro-Ala-Pro↓Ser-Pro (SEQ ID NO：05)，

[0046] Pro-Pro↓Ser-Pro (SEQ ID NO：06)，

[0047] Pro-Pro↓Ala-Pro (SEQ ID NO：07)，

[0048] Pro-Pro↓Thr-Pro (SEQ ID NO：08)，

[0049] Pro-Pro↓Gly-Pro (SEQ ID NO：09)，

[0050] Ala-Pro↓Arg-Pro (SEQ ID NO：14)，

[0051] Pro-Ala-Pro↓Arg-Pro (SEQ ID NO：15)，

[0052] Pro-Ala-Pro↓Gly-Pro (SEQ ID NO：16)，

[0053] Pro-Pro-Thr-Pro↓Ser-Pro (SEQ ID NO：17)，

[0054] Pro-Arg-Pro-Pro↓Thr-Pro (SEQ ID NO：18)，

[0055] Pro-Arg-Pro-Pro↓Ser-Pro (SEQ ID NO：19)，

[0056] Pro-Arg-Pro-Pro↓Ala-Pro (SEQ ID NO：20)，

[0057] Pro-Arg-Pro-Pro↓Gly-Pro (SEQ ID NO：21)，

[0058] Lys-Pro-Ala-Pro↓Ser-Pro (SEQ ID NO：22)，

[0059] Ser-Thr-Pro-Pro↓Thr-Pro (SEQ ID NO：23)，

[0060] Val-Ala-Pro-Pro↓Ser-Pro (SEQ ID NO：24)，

[0061] Ala-Pro-Arg-Pro-Pro↓Gly-Pro(SEQ ID NO：25)，

[0062] Pro-Ala-Pro-Arg-Pro-Pro↓Gly-Pro(SEQ ID NO：26)，

[0063] 其中选择频率较高的是前三个。

[0064] 因此，在一个实施方案中，融合多肽在N到C末端方向上包含His标签、间隔区、IgA蛋白酶切割位点(IgA位点)、目的多肽、胰蛋白酶-4x-突变体切割位点(tryp位点)以及任选地链霉抗生物素蛋白标签(strep标签)。

[0065] 使用胰蛋白酶-4x-突变体的位点特异性修饰的酶催化技术使得必须制备带有此类修饰所需附件(appendage)的特殊构建体。

[0066] 因此，在如本文所报道的方法的一个实施方案中，融合多肽在N至C末端的方向上包含要被PEG化的多肽、胰蛋白酶-4x-突变体切割位点和Strep标签。在另一个实施方案中编码融合多肽的核酸在5’至3’方向上包含i)编码要被PEG化的多肽的核酸，ii)编码氨基酸序列SEQ ID NO：01的核酸，以及iii)编码Strep标签SEQ ID NO：13或27的核酸。

[0067] 因而，如本文所报道的一个方面是制备与聚乙二醇残基缀合的多肽的方法，所述方法包括以下步骤

[0068] a)将融合多肽和目标多肽与胰蛋白酶突变体D189K，K60E，N143H，E151H温育，所述融合多肽由在5’至3’方向上包含i)编码该多肽的核酸，以及ii)编码氨基酸序列SEQ ID NO：01的核酸的核酸编码，所述目标多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：02并且在C末端赖氨酸残基处与聚乙二醇残基共价缀合，并且

[0069] b)从温育混合物回收并因此生产与一个聚乙二醇残基缀合的多肽。

[0070] 在一个实施方案中，融合多肽被这样的核酸编码，所述核酸在5’至3’方向上包含i)编码要被PEG化的多肽的核酸，ii)编码氨基酸序列SEQ IDNO：01的核酸，以及iii)编码氨基酸序列SEQ ID NO：13或27的核酸。

[0071] 在一个实施方案中，该方法包括以下作为第一步：

[0072] a-1)培养细胞，所述细胞包含编码融合多肽的核酸，所述核酸在5’至3’方向上包含

[0073] i)编码要被PEG化的多肽的核酸，

[0074] ii)编码氨基酸序列SEQ ID NO：01的核酸，以及

[0075] iii)编码氨基酸序列SEQ ID NO：13或27的核酸，并且从细胞和/或培养基回收融合多肽。

[0076] 在一个实施方案中，所述温育包括

[0077] i)将融合多肽和目标肽与盐酸胍在缓冲溶液中温育

[0078] ii)将胰蛋白酶突变体D189K，K60E，N143H，E151H与Zn(II)-盐温育，[0079] iii)合并并温育i)和ii)的温育混合物。

[0080] 以下通过使用IGF-I蛋白来举例说明本发明，在进行本发明时在本实验室中可以获得充足量的所述IGF-I蛋白。这不应被解释为限制，它只是作为实例提供，原因在于本发明可以利用几乎任何多肽来实施。本发明的真正范围在所附权利要求中阐明。

[0081] 示例性构建体携带His标签、间隔区和IgA蛋白酶切割位点(IgA位点)(IGF-I多肽的N端(部分))以及胰蛋白酶切割位点(tryp位点)以及任选地链霉抗生物素蛋白标签(strep标签)(IGF-I-多肽的C端(部分))(同样参见图1)：

[0082] His标签-间隔区-IgA位点-wt-hIGF-tryp位点-strep标签(SEQ ID NO：10)[0083] His标签-间隔区-IgA位点-wt-hIGF-tryp位点(SEQ ID NO：11)

[0084] His标签-间隔区-IgA位点-hIGF(K27R，K65R)-tryp位点(SEQ ID NO：12)[0085] 可以在低至400μl的终体积中进行实验以确定由胰蛋白酶-4x-突变体催化的酯交换反应的动力学。

[0086] 可以在酶反应前，将包含IGF-I的要被位点特异修饰的融合多肽与2M三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)缓冲液(终浓度为0.2M)，pH 8.0，亲核体(RHAK-6CF(SEQ ID NO：02)或RHAK-MCa-PEG20000(SEQ ID NO：02))，以及盐酸胍(Gdm-HCl)温育。不受限于理论，以此方式IGF构建体的可溶性可以得到保持并且低浓度的盐酸胍可能引入部分变性，并且因此，在酶反应期间提供具有“胰蛋白酶位点”的C端的更好的可接近性。胰蛋白酶-4x-突变体可2+
以在存在Zn 离子的情况下预温育。可以通过合并两种反应混合物A和B来获得良好的酶活性，其中混合物A包含含有IGF-I的融合多肽，混合物B包含胰蛋白酶-4x-突变体。反应混合物可以具有的pH值为pH 8.0。总反应混合物可以在30℃温育，同时轻轻振动。可以使
2+
用180min的总反应时间，并且每30min取一次样品。可以通过将Zn 离子与EDTA络合来终止酶反应。最后，可以通过添加缓冲溶液(缓冲液S，其含100mM TRIS，150mM NaCl，pH 8.0)将体积调节至最终的稀释因子为1∶2。样品可以通过SEC分析。取决于所使用的标记，可TM
以应用不同的SEC柱。例如，对于RHAK-6CF可以使用分离范围为100-7000Da的SuperdexTM
肽柱，对于RHAK-MCa-PEG20000可以使用分离范围为3000-70000Da的Superdex 75柱(GE Healthcare)。

[0087] 利用RHAK-6CF的位点特异性修饰的产率可以确定如下。可以制备游离RHAK-6CF的浓度稀释系列(0.5，1，5，10，25，50和100μg/ml)。缓冲液S可以用作溶剂，因为RHAK-6CF荧光对pH敏感。校准样品可以通过SEC分析。可以对不同的浓度确定由514nm处的辐射发射产生的包含RHAK-6CF的峰的峰面积并作图，因此提供校准曲线。反应样品可以通过SEC以与校准样品相同的方式进行分析，并且可以确定荧光产物的峰面积。可以通过使用校准曲线来确定形成的RHAK-6CF的量，并因此确定具有此亲核体的位点特异性修饰的产率。

[0088] 对于所有构建体，产率随时间增加。在大约150min后，可以获得最大产率。构建体wt-hIGF-胰蛋白酶位点-strep标签提供最好的结果，在150min后产率为17.5％。相对比，wt-hIGF-胰蛋白酶位点和mut-hIGF(K27R，K65R)提供较低和相对相等的最大结果(分别为)：150min后为11.9％而180min后为13.0％。在使用RHAK-6CF的位点特异性修饰期间产量随时间的增加显示在图2B中。

[0089] 当RHAK-MCa-PEG20000用作亲核体时，在游离的、未缀合的RHAK-MCa-PEG20000和RHAK-MCa-PEG20000标记的IGF-I的分离中产生问题。这可能是由于亲核体及缀合产物相似的大小。因此，在此情况下，不可能通过产物的增加来确定位点特异性修饰的产率，而需要不同的方法。因为仅发生单个位点特异性修饰，所以未修饰的IGF-I(离析物)的减少可以等同于缀合产物的增加。未修饰的IGF-I的减少通过由在226nm处的吸光度产生的HPLC层析谱峰面积来评估。如同使用RHAK-6CF的修饰一样，使用RHAK-MCa-PEG20000的修饰的产率随时间增加(图3和4)。使用构建体wt-hIGF-tryp位点-strep标签，令人惊奇地，在180min后可以获得23.1％的最高产率。mut-IGF(K27R，K65R)-tryp位点(180min后20.6％)和wt-hIGF-tryp位点(180min后19.9％)获得几乎相等的结果。

[0090] 表1：

[0091] 比较使用RHAK-6CF或RHAK-MCa-PEG20000的位点特异性修饰的产率

[0092]

[0093]

[0094] 对使用RHAK-6CF或RHAK-MCa-PEG20000进行位点特异性修饰的不同融合多肽的比较显示在表1中。总体上，使用RHAK-MCa-PEG20000的修饰比使用RHAK-6CF的修饰具有更高的产率。但是要被PEG化的多肽对产率也有影响。使用构建体wt-hIGF-tryp位点-strep标签可以获得最高的产率而与目标多肽(或亲核体)无关。构建体wt-hIGF-tryp位点和mut-hIGF-tryp位点产生几乎相等的结果。因此，已经发现，Strep标签的存在加强了C端位点特异性酶催化修饰。

[0095] 为证实单一和C端位点特异性修饰，标记的IGF-I构建体可以通过质谱进行分析。为此，可以使用每个构建体的RHAK-6CF的位点特异性修饰的400μl反应。该反应可以在30℃温育150min并且随后通过添加200μl 10mM EDTA溶液终止。之后可以通过添加200μl缓冲液S将反应溶液稀释至1∶2。整个标记反应可以通过尺寸排阻层析来纯化。
包含RHAK-6CF的IGF-I融合多肽的可以被收集和浓缩。随后可以通过质谱技术分析纯化的位点特异性修饰的IGF-I构建体的总分子量。来源于消化(Asp-N消化)的片段的分子量证实所有构建体的具有RHAK-6CF的单个、C端位点特异性修饰。

[0096] 因此，已经发现了使用胰蛋白酶-4x突变体修饰工程化的多肽(例如带有“胰蛋白酶位点”的IGF-I)的C端位点特异性修饰的新的酶催化方法。使用此新的技术，可能位点特异地修饰多肽，例如野生型人IGF-I，而没有获得不均一的、活性减弱的修饰的风险。这些不需要的副产品在过去经常限制PEG化应用。此新的酶学方法可以容易地用于PEG化蛋白质药物的制备。可以使用其他可能的亲核体来代替PEG包含于目标多肽中，如目标多肽包含/缀合有荧光染料、生物素、糖类等等。简单的添加短肽RHAK(SEQ ID NO：02)可以使这些能够用于使用胰蛋白酶-4x-突变体系统进行转移。

[0097] wt-hIGF-tryp位点-strep标签构建体的酶催化PEG化的反应条件通过减少标记(RHAK-MCa-PEG20000)的量和胰蛋白酶-4x-突变体的量以及用HEPES缓冲液替代TRIS缓冲液进一步得到优化。

[0098] 提供以下实施例、序列表和附图来帮助理解本发明，本发明的真正范围由所附权利要求阐明。要理解，可以对所述程序在不背离本发明的精神的情况下进行修饰。

[0099] 序列列表描述

[0100] SEQ ID NO：01修饰的胰蛋白酶位点(tryp位点)

[0101] SEQ ID NO：02位点特异性PEG化所需的目标肽

[0102] SEQ ID NO：03胰蛋白酶位点的置换部分

[0103] SEQ ID NO：04剩余肽序列

[0104] SEQ ID NO：05至09以及14至26 IgA-蛋白酶切割位点

[0105] SEQ ID NO：10His标签-间隔区-IgA位点-wt-hIGF-tryp位点-strep标签[0106] SEQ ID NO：11His标签-间隔区-IgA位点-wt-hIGF-tryp位点

[0107] SEQ ID NO：12His标签-间隔区-IgA位点-hIGF(K27R，K65R)-tryp位点[0108] SEQ ID NO：13和27Strep标签

[0109] SEQ ID NO：28包含N端his标签和IgA蛋白酶切割位点的单PEG化的人IGF-I的氨基酸序列

[0110] SEQ ID NO：29单PEG化的人IGF-I的氨基酸序列

[0111] 附图描述

[0112] 图1不同构建体的示意图。

[0113] 图2校准曲线RHAK-6CF(A)和产率RHAK-6CF标记(B)。

[0114] A：使用SEC分析在100mM Tris，150mM NaCl，pH 8.0中制备的具有以下浓度的稀释系列：0.5、1、5、10、25、50、100μg/ml。确定在514nm处的RHAK-6CF辐射的峰面积并相对于2
浓度制图。决定系数(R)和应用的趋势线的方程得到显示。每个数据点是3次重复实验的结果并且显示±标准差。

[0115] B：根据4.3.8准备RHAK-6CF标记的标记反应。样品通过SEC进行分析。(左)：wt-hIGF-tryp位 点-strep标 签，(中)：wt-hIGF-tryp位 点，(右)：mut-hIGF(K27R，K65R)-tryp位点。

[0116] 图3使用RHAK-6CF或RHAK-MCa-PEG20000的位点特异性修饰的产率的比较。(左)：RHAK-6CF，(右)：RHAK-MCa-PEG20000。

[0117] 图4在优化条件下C端修饰的IGF-I的依赖于时间的增加(亲核体：RHAK-MCa-PEG20000)。

[0118] 缩写：

[0119] “胰蛋白酶侧” 氨基酸序列YRHAAG

[0120] 6-CF 羧基荧光素

[0121] Gdm-HCl 盐酸胍

[0122] His标签 聚组氨酸标签

[0123] MCa 甲基香豆素

[0124] PEG 聚乙二醇

[0125] Strep 链霉抗生物素蛋白

[0126] TRIS 2-氨基-1-羟甲基-1，3-丙二醇

[0127] Tryp “ 胰蛋白酶位点”

[0128] IGF-I 胰岛素样生长因子1

[0129] 胰蛋白酶-4x-突变体 突变体胰蛋白酶D189K，K60E，N143H，E151H材料和方法：

[0130] 分析型尺寸排阻层析

[0131] 缓冲液：0.5M TRIS，0.15M NaCl，pH 7.5

[0132] 柱：SuperdexTM Peptide 10/300GL

[0133] 系统：Dionex

[0134] 方法：以0.5ml/min的流速进行等度洗脱。总的循环时间为70min。注射50μl样品。通过跟踪220和280nm处的吸光度信号来追踪分离的过程。

[0135] 标记期间的尺寸排阻层析

[0136] 缓冲液：100mM TRIS，150mM NaCl，pH 8.0

[0137] 柱：SuperdexTM Peptide 10/300GL(RHAK-6CF标记)

[0138] SuperdexTM 7510/300GL(RHAK-MCa-PEG20000标记)

[0139] 系统：Gynkotek(RHAK-6CF标记)

[0140] Dionex(RHAK-MCa-PEG20000标记，参见表8)

[0141] RHAK-6CF标记方法：以0.5ml/min的流速进行等度洗脱。总的循环时间为60min。

[0142] RHAK-MCa-PEG20000标记方法：以0.75ml/min的流速进行等度洗脱。

[0143] 总的循环时间为45min。

[0144] 注射50μl样品(250μl用于制备)。通过跟踪220nm、280nm、320nm处的吸光度信号(RHAK-MCa-PEG20000标记)以及荧光信号(消光＝490nm，发射＝514nm)(RHAK-6CF标记)来追踪分离的过程。

[0145] 实施例1

[0146] 位点特异性修饰

[0147] 使用RHAK-6CF和RHAK-MCa-PEG20000来完成IGF-I构建体的位点特异性标记。

[0148] 表2：

[0149] 位点特异性修饰的组分。给出储液的浓度和说明。

[0150]

[0151]

[0152] 表3：

[0153] 位点特异性修饰反应的对照。对每个hIGF-I构建体执行对照#1、#3a、#3b。

[0154]

[0155] 每个构建体以RHAK-6CF或RHAK-MCa-PEG20000进行标记。此外，执行根据表2的对照。

[0156] 不同化合物在最终标记反应中的浓度列于表4中。所有反应都在650μl硅化管中进行。蛋白稀释在2M TRIS缓冲液中。随后加入标记的肽和盐酸胍。此混合物(A)在30℃温育10min。由胰蛋白酶4x突变体、ZnCl2和缓冲液S(100mM TRIS，150mM NaCl，pH 8.0)组成的混合物B在与混合物A相同的条件下温育。选择必要体积的缓冲液S以使标记反应的总反应体积为400μl而对照的总反应体积为250μl。将混合物A和B合并并在30℃温育，同时轻轻振动。

[0157] 为了终止酶反应，将反应混合物与体积为其一半的10mM EDTA(制备在缓冲液S中)和相同体积的缓冲液S合并，至稀释因子为1∶2。应用的总反应时间为180min。

[0158] 表4：

[0159] 反应中用于位点特异性修饰的所有化合物的浓度。应用的标记反应的反应体积为400μl而对照的反应体积为250μl。使用RHAK-6CF或RHAK-MCa-PEG20000作为标记来进行反应。

[0160]

[0161]

[0162] 实施例2

[0163] 位点特异修饰的优化

[0164] 在室温在1000μl的体积中进行反应。胰蛋白酶-4x-突变体在ZnCl2和PEG标记的存在下在30℃预温育10min。之后加入盐酸胍和wt-hIGF-tryp位点-strep位点以获得以下给出的终浓度。反应混合物在20℃温育达54小时。24h后获得＞25％的产物产率，在52小时后达到最大的32.6％(参见图4)。

[0165] 反应条件：

[0166] 100μM wt hIGF-I胰蛋白酶位点Strep标签

[0167] 2μM胰蛋白酶4x突变体

[0168] 500μM RHAK-MCa-PEG20000

[0169] 10μM ZnCl2

[0170] 100mM HEPES

[0171] 150mM NaCl

[0172] 1mM CaCl2

[0173] 200mM Gdm HCl

[0174] 实施例3

[0175] 利用重组wt和突变体IGF-I变体和单PEG化的IGF-I的体外IGF-IR磷酸化[0176] 将磷酸-IGF-IR特异性ELISA用于量化通过不同IGF-I变体的IGF-IR的激活。血清饥饿过夜后，将表达人IGF-IR的重组NIH-3T3细胞与不同浓度的IGF-I变体温育以允许IGF-IR在细胞环境中的结合和激活。刺激后，使用冷的裂解缓冲液(25mM MES，pH 6.5，TM
150mM NaCl，2％Triton-X100，60mMβ-辛基葡糖苷，2mM Na3VO4，Complete 蛋白酶抑制剂)裂解细胞以保持磷酸化状态。将针对人IGF-IR α链的生物素化单克隆抗体(MAKhu-1a-IgG-Bi，Roche Diagnostics GmbH)用于将全部IGF-IR捕获到链霉抗生物素蛋白包被的微板表面，并将针对IGF-IR激酶结构域内的磷酸化的Tyr1135/1136的单克隆抗体(Cell Signaling#3024L)用于确定激活的IGF-IR的级分。将使用10nM人IGF-I刺激的细胞用作最大(max)对照，未受刺激的细胞作为最小(min)对照。IGF-IR的百分比激活计算作(结果-min)/(max-min)。IC50/EC50值通过曲线拟合使用GraphPad Prism 4.0软件确定。

[0177] 表5：

[0178] 不同IGF-I变体对IGF-1R的激活。

[0179]样品 EC50[nM]
rhIGF-I(K27R，K65R) 1.2
单PEG化的rhIGF-I(K27R，K65R) 8.1
wt-rhIGF-I 1.0
wt-rhIGF-胰蛋白酶位点-Strep标签 1.7
wt-rhIGF-I-YRHAK MCa PEG20000 18.4
RHAK-MCa-PEG20000 不可确定