真菌FimetariellarabenhorstiiA20在诱导白木香产生愈创木醇中的应用

摘要

本发明公开了一种真菌F.rabenhorstii A20在诱导白木香产生愈创木醇中的应用。本发明的真菌F.rabenhorstii A20能诱导白木香产生愈创木醇，这对剖析沉香形成机理，研究人工结香技术有重要理论和实践意义。

权利要求

1.真菌Fimetariella rabenhorstii A20在诱导白木香Aquilaria sinensis(Lour.)Gilg产生愈创木醇中的应用，所述的真菌Fimetariella rabenhorstii A20从广东省信宜市采集的白木香中分离得到，经ITS序列分析对比鉴定为F.rabenhorstii，基因登录序列号为EU781677，菌种保藏于广东微生物研究所，编号为A20。

2.一种诱导白木香产生愈创木醇的方法，其特征在于，将真菌F.rabenhorstii A20接种到白木香树干上，经过培养后，白木香能够产生愈创木醇，所述的真菌Fimetariella rabenhorstii A20从广东省信宜市采集的白木香中分离得到，经ITS序列分析对比鉴定为F.rabenhorstii，基因登录序列号为EU781677，菌种保藏于广东微生物研究所，编号为A20。

说明书

真菌Fimetariella rabenhorstii A20在诱导白木香产生

愈创木醇中的应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术和农业领域，具体涉及真菌（Fimetariella rabenhorstii）A20在诱导白木香（Aquilaria sinensis(Lour.)Gilg）产生沉香组成成分愈创木醇中的应用。背景技术：

[0002] 沉香是一种名贵中药，其药用始载于《名医别录》，列为上品。其味辛、苦，性微温，具行气止痛、温中止呕、纳气平喘功效，用于治疗胸腹胀闷疼痛、胃寒呕吐呃逆、肾虚气逆喘急等症（国家药典，2010）。此外，它还是一种在亚洲广受欢迎和广泛应用的传统名贵天然香料。沉香的化学成分主要包括倍半萜类和2-(2-苯乙基)色酮类，其中倍半萜类有愈创木醇（其结构式如式Ⅰ所示）、沉香螺旋醇、白木香酸、白木香醛等(Naef R，2011)。沉香是白木香树干在受到损伤或刺激的情况下分泌的一种黑色树脂，白木香（Aquilaria sinensis (Lour.)Gilg））又称土沉香，属瑞香科沉香属植物，为我国特有的热带及亚热带常绿乔木，是我国生产沉香的唯一植物来源。目前，白木香形成沉香的具体原因和过程并不清楚。 [0003]

[0004] 不少研究显示，沉香属植物结香与真菌相关。自20世纪30年代，从沉香属植物结香部位分离到的真菌有葡萄座腔菌（Botryosphaeria rhodina）、色二孢菌（Diplodia sp.）、镰 刀 菌（Fusarium sp.）、曲 霉（Aspergillus sp.）、毛 霉（Mucor sp.）、青 霉（Penicillium sp.）、木霉（Trichoderma sp.）、裂褶菌（Schizophyllum sp.）等（张争等，2010）。目前，已有一些真菌 能诱导白木香产沉香的报道。如专利“应用真菌诱导白木香树产生沉香的方法”中，涉及到真菌镰孢属Fusarium sp.A-11和头孢霉属Cephalosporium sp.A-17可以诱导白木香树干分泌产生黄褐色的沉香。文章“两批接菌法所产沉香挥发油化学成分的气相色谱法-质谱联用分析”（林峰等，2010）发现，白木香树干接种黄绿墨耳真菌M.flavolivens半年、一年后，乙醚提取挥发油中有倍半萜类、芳香族化合物和脂肪酸。专利“一种沉香诱导剂及其制备方法”中，提供了沉香诱导菌株可可毛色二孢菌Lasiodiplodia theobromae作为沉香诱导剂的制备方法。
发明内容：

[0005] 本发明的第一个目的是提供真菌F.rabenhorstii A20在诱导白木香产生愈创木醇中的应用。

[0006] 本发明通过实验发现，在白木香（Aquilaria sinensis(Lour.)Gilg）树干上接种真菌F.rabenhorstii A20，经过一段时间培养后，再对样品进行前处理并进行GC-MS分析，发现真菌F.rabenhorstii A20能诱导白木香产生沉香组份愈创木醇。

[0007] 因此，本发明的第二个目的是提供一种诱导白木香产生愈创木醇的方法，其特征在于，将真菌Fimetariella rabenhorstii A20接种到白木香树干上，经过培养后，白木香能够产生愈创木醇。

[0008] 所述的真菌Fimetariella rabenhorstii A20从广东省信宜市采集的白木香中分离得到，经ITS序列分析对比鉴定为F.rabenhorstii，基因登录序列号为EU781677，菌种保藏于广东微生物研究所，编号为A20。

[0009] 本发明的真菌F.rabenhorstii A20能诱导白木香产生愈创木醇，这对剖析沉香形成机理，研究人工结香技术有重要理论和实践意义。

[0010] 本发明的真菌F.rabenhorstii A20属于现有技术中菌株，其公开在科技文献中：陶美华、李冬利、章卫民、谭建文、魏孝义，白木香内生真菌Fimetariella rabenhorstii化学成分研究，中药材，2011，34（02），221～223.该菌株本申请人也持有，并保证自申请日起
20年内向公众提供。
附图说明：

[0011] 图1是作用20天后，菌株F.rabenhorstii A20接种到白木香枝条的实验组和两个对照组的总离子流图，其中Ⅰ为菌株F.rabenhorstii A20接种到白木香枝条的实验组；Ⅱ为在PDA培养皿中培养7d的菌株F.rabenhorstii A20对照组；Ⅲ为未接真菌F.rabenhorstii A20，相同处理的新鲜白木香枝条对照组；

[0012] 图2是作用30天后，菌株F.rabenhorstii A20接种到白木香枝条的实验组和两个对照组的总离子流图，其中Ⅰ为菌株F.rabenhorstii A20接种到白木香枝条的实验组；Ⅱ为在PDA培养皿中培养7d的菌株F.rabenhorstii A20对照组；Ⅲ为未接真菌F.rabenhorstii A20，相同处理的新鲜白木香枝条对照组；

[0013] 图3是质谱比对图，其中Ⅰ为NIST05质谱库中愈创木醇；Ⅱ为实施例2和1中保留时间为21.15，21.20min处的样品。具体实施方式：

[0014] 以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

[0015] 实施例1：

[0016] 由白木香根部分离得到的内生真菌F.rabenhorstii A20保藏于4℃低温冰箱中，挑取少量保藏的斜面菌种接种到经高压灭菌的PDA平皿培养基上，28℃培养7d进行菌种活化。将白 木香粗约0.5-1cm的新鲜枝条切成约8cm左右的小段，先在0.1%升汞溶液中浸泡5min，取出后用无菌水漂洗3次，再放入体积分数75%乙醇水溶液中浸泡5min，无菌水漂洗3次，然后用灭过菌的打孔器在白木香枝条上打孔。将打孔后白木香枝条放入有湿润无菌滤纸的平板上，用1ml无菌水冲洗真菌F.rabenhorstii A20斜面菌种，大头吸管吸取菌液注入到白木香枝条上的孔中，接种后平板用保鲜膜封口并且在黑暗、27℃环境中放置20d。将培养后的白木香枝条放入三角瓶中，加入体积分数95%乙醇水溶液浸泡过夜，提取液旋转蒸发仪蒸发至干，用1.5ml氯仿溶解后过0.22μm微孔滤膜，然后将滤液进行气质联用仪分析。其中气相色谱条件为Agilent毛细管色谱柱DB-5MS（30m×0.25mm×0.25μm）；
色谱柱程序升温条件：初始柱温60℃（保持2min），以5℃/min升至150℃，再以1℃/min升至160℃（保持15min），再以8℃/min升至250℃（保持20min）；传输线温度250℃，载气为高纯氦气，流速1.0ml/min；进样量1μl，程序升温汽化不分流进样，初始温度60℃，
14.5℃/min升温至250℃。质谱条件为电子轰击（EI）离子源，离子源温度230℃；扫描质量范围（m/z）40～500。各实验组分采用NIST05质谱库检索进行定性。同时设置未接真菌F.rabenhorstii A20，相同处理的新鲜白木香枝条对照组和在PDA培养皿中培养7d的菌株F.rabenhorstii A20对照组，每个实验组设置3个平行，培养物的物质提取和分析与实验组相同。结果如图1所示，从图1可以发现，将菌株F.rabenhorstii A20接种到白木香枝条的实验组在保留时间为21.20min处能检测到沉香组成成分愈创木醇（保留时间为
21.20min馏分的质谱图和NIST05质谱库中愈创木醇质谱比对图见图3所示，由图3说明，保留时间为21.20min的馏分为愈创木醇），而未接真菌F.rabenhorstii A20，相同处理的新鲜白木香枝条对照组和在PDA培养皿中培养7d的菌株F.rabenhorstii A20对照组均为发现此组份，由此说明将真菌F.rabenhorstii A20接菌 至白木香枝条，可以诱导白木香产生沉香组成成分愈创木醇。

[0017] 实施例2

[0018] 由白木香根部分离得到的内生真菌F.rabenhorstii A20保藏于4℃低温冰箱中，挑取少量保藏的斜面菌种接种到经高压灭菌的PDA平皿培养基上，28℃培养5d进行菌种活化。将白木香粗约0.5-1cm的新鲜枝条切成约8cm左右的小段，先在0.1%升汞溶液中浸泡7min，取出后用无菌水漂洗4次，再放入体积分数75%乙醇水溶液中浸泡7min，无菌水漂洗
4次，然后用灭过菌的打孔器在白木香枝条上打孔。将打孔后白木香枝条放入有湿润无菌滤纸的平板上，用1ml无菌水冲洗真菌F.rabenhorstii A20斜面菌种，大头吸管吸取菌液注入到白木香枝条上的孔中，接种后平板用保鲜膜封口并且在黑暗、27℃环境中放置30d。
将培养后长满菌的白木香枝条放入三角瓶中，加入体积分数95%乙醇水溶液浸泡过夜，提取液旋转蒸发仪蒸发至干，用1.5ml氯仿溶解后过0.22μm微孔滤膜，然后进行气质联用仪分析。其中气相色谱条件为Agilent毛细管色谱柱DB-5MS（30m×0.25mm×0.25μm）；
色谱柱程序升温条件：初始柱温60℃（保持2min），以5℃/min升至150℃，再以1℃/min升至160℃（保持15min），再以8℃/min升至250℃（保持20min）；传输线温度250℃，载气为高纯氦气，流速1.0ml/min；进样量1μl，程序升温汽化不分流进样，初始温度60℃，
14.5℃/min升温至250℃。质谱条件为电子轰击（EI）离子源，离子源温度230℃；扫描质量范围（m/z）40～500。各实验组分采用NIST05质谱库检索进行定性。同时设置未接真菌F.rabenhorstii A20，相同处理的新鲜白木香枝条对照组和在PDA培养皿中培养7d的菌株F.rabenhorstii A20对照组，每个实验组设置3个平行，培养物的物质提取和分析与实验组相同。结果如图2所示， 从图2可以发现将菌株F.rabenhorstii A20接种到白木香枝条的实验组在保留时间为21.15min处能检测到沉香组成成分愈创木醇（保留时间为
21.15min馏分的质谱图和NIST05质谱库中愈创木醇质谱比对图见图3所示，由图3说明，保留时间为21.15min的馏分为愈创木醇），而未接真菌F.rabenhorstii A20，相同处理的新鲜白木香枝条对照组和在PDA培养皿中培养7d的菌株F.rabenhorstii A20对照组均为发现此组份，由此说明将真菌F.rabenhorstii A20接菌至白木香枝条，可以诱导白木香产生沉香组成成分愈创木醇。