大熊猫适时人工授精时机的判断方法

摘要

本发明公开了一种大熊猫适时人工授精时机的判断方法，其通过收集和化验分析春季发情期间雌性大熊猫尿样，将雌二醇最大峰值或其后的雌二醇峰值在下降幅度达到50%以上所用的时间、雌二醇从最大峰值或其后的峰值在下降的过程中孕酮值是否呈上升趋势和大熊猫是否出现典型发情高峰行为、雌二醇最大峰值或其后的雌二醇峰值所对应的孕酮值与孕酮基础值的比值等情况同时结合起来，判断出大熊猫雌二醇真实峰值,然后在雌二醇真实峰值出现时刻之后的24～48小时内进行第一次人工授精，在第一次人工授精完成6～8小时后再进行第二次人工授精，最终大熊猫妊娠率取得了显著提高，与过去相比大熊猫人工授精妊娠率由20.41%提高到42.11%、翻了一倍多。

权利要求

1.一种大熊猫适时人工授精时机的判断方法，包括以下步骤：

（1）春季发情期间，按时间要求对雌性大熊猫进行尿样收集，同时观察大熊猫发情行为，在尿样上标记后进行冷冻或冷藏保存，然后对尿样采用酶联免疫吸附试验检测雌二醇值和孕酮值；

（2）在以大熊猫排尿时间作为横坐标、以雌二醇值和孕酮值作为纵坐标的平面坐标上，分别标出排尿时间及其对应的雌二醇值和孕酮值所确定的两组坐标点，将两组坐标点分别依次连接起来，绘制出雌二醇值变化曲线图和孕酮值变化曲线图，找出雌二醇最高峰值出现时间及其对应的孕酮值；

（3）根据雌二醇最高峰值出现时间前的孕酮值计算出发情雌性大熊猫孕酮基础值，并计算出雌二醇最高峰值或其后的雌二醇峰值对应的孕酮值与孕酮基础值的比值；

（4）依据雌二醇值变化曲线图和孕酮值变化曲线图，将雌二醇最高峰值或其后的雌二醇峰值在下降幅度达到50%以上所用的时间、雌二醇从最高峰值或其后的峰值在下降的过程中孕酮值是否呈上升趋势和大熊猫是否出现典型发情高峰行为、雌二醇最高峰值或其后的雌二醇峰值所对应的孕酮值与孕酮基础值的比值同时结合起来，共同判断出大熊猫雌二醇真实峰值；

（5）以雌二醇真实峰值的出现时刻为时间起点0小时，在之后的24小时～48小时的范围内，在出现孕酮上升并出现发情高峰行为时确定为第一次人工授精时机。

2.根据权利要求1所述的一种大熊猫适时人工授精时机的判断方法，其特征在于：若雌二醇最高峰值在10小时～20小时范围内下降幅度达到50%以上、之后雌二醇连续下降到基础值、雌二醇最高峰值对应的孕酮值与孕酮基础值的比值大于2，同时在雌二醇从最高峰值下降的过程中孕酮值呈上升趋势和大熊猫出现典型发情高峰行为，则可以确定此雌二醇最高峰值为大熊猫雌二醇真实峰值。

3.根据权利要求1所述的一种大熊猫适时人工授精时机的判断方法，其特征在于：若雌二醇最高峰值在20小时～31小时范围内下降幅度达到50%以上、之后雌二醇连续下降到基础值、雌二醇最高峰值对应的孕酮值与孕酮基础值的比值大于1.8，同时在雌二醇从最高峰值下降的过程中孕酮值呈上升趋势和大熊猫出现典型发情高峰行为，则可以确定此雌二醇最高峰值为大熊猫雌二醇真实峰值。

4.根据权利要求1所述的一种大熊猫适时人工授精时机的判断方法，其特征在于：雌二醇从最高峰值下降50%的时间在20小时以上、雌二醇最高峰值对应的孕酮值与孕酮基础值的比值小于1.8，同时雌二醇最高峰值之后出现一个或多个峰值、且雌二醇从最高峰值下降的过程中孕酮值未呈上升趋势和大熊猫未出现典型发情高峰行为，则可以确定此雌二醇最高峰值为假峰值；此时，大熊猫雌二醇真实峰值为雌二醇最高峰值之后的某一峰值，并且该峰值必须同时具备在10小时～20小时范围内下降幅度达到50%以上、之后雌二醇连续下降到基础值、该峰值对应的孕酮值与孕酮基础值的比值大于2、在雌二醇从该峰值下降的过程中该峰值对应的孕酮值呈上升趋势和大熊猫出现典型发情高峰行为。

5.根据权利要求1～4所述的一种大熊猫适时人工授精时机的判断方法，其按时间要求对雌性大熊猫进行尿样收集的过程如下：（1）观察雌性大熊猫外阴部，若外阴部出现红肿后，则每天收集1份雌性大熊猫晨尿；

（2）从雌二醇连续上升后的第4天开始，每天间隔8小时左右收集3份尿样；

（3）雌性大熊猫发情高峰行为前后，每天间隔5小时左右收集5份尿样；

（4）一旦监测到雌二醇值有下降趋势，将尿样收集间隔时间缩短为3小时左右。

6.根据权利要求5所述的一种大熊猫适时人工授精时机的判断方法，其每一次大熊猫尿样收集包括以下步骤：（1）清洁并晾干兽舍硬化地面；

（2）将需收集尿样的大熊猫放入兽舍，工作人员守候，一旦大熊猫排出小便，立即将大熊猫放到其它兽舍；

（3）用清洁注射器采集地面新鲜尿样，装入冷冻管，做好标记，然后立即放入冷冻或冷藏装置。

说明书

大熊猫适时人工授精时机的判断方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种对圈养动物进行人工授精的的技术，特别是涉及一种大熊猫适时人工授精方法。

背景技术

[0002] 大熊猫是我国特有的珍稀濒危野生动物，其自身繁殖能力偏低，雌性大熊猫一年只有一次发情期，而一次发情期中只有1～3天能接受自然交配，其排卵时间可能只有一天；同时圈养大熊猫自然交配比例偏低，目前只有50%左右的大熊猫能自然交配，有一半左右的大熊猫需要通过人工授精完成繁殖，由于大熊猫人工授精需要在麻醉状态下进行，从现有资料与数据看，在排卵前麻醉会导致动物的排卵抑制与排卵延迟，若在动物排卵前在麻醉状态下过早实施人工授精，会直接导致产仔率的下降；另一方面，由于动物排卵后卵子维持授精能力的时间要远远低于精子，若在排卵后过晚实施人工授精，卵子可能因老化从而丧失最佳受精时机导致产仔率的下降。因此，理论上讲大熊猫人工授精时机应该选择在排卵后适当的时间内进行才能确保受孕率，因此确定大熊猫适时人工授精时间是大熊猫人工授精的关键技术。

[0003] 在上世纪90年代中期以前，对大熊猫适时配种时机的判断主要根据大熊猫发情行为定性观察，凭经验确定大熊猫适时配种时机，导致对大熊猫适时人工受精时间把握不清，缺乏量化指标，这也是导致大熊猫人工授精繁殖效率低下的重要原因。

[0004] 1997年《四川大学学报》（自然科学版）34:43～47期刊登了作者为冯文和、张安居等人的文章《不同配种方式对大熊猫产仔效果的影响》，对1980～1993年圈养大熊猫155次不同繁殖方式的繁殖结果进行了统计，发现平均妊娠率仅36%左右，而全人工授精的的个体无论是采用新鲜精液、冷冻精液还是两者混合使用其妊娠率均较低，总体妊娠率仅
20.4%，结果见表1：

[0005] 表1.1980～1993年圈养大熊猫不同配种方式妊娠率结果比较

[0006]

[0007] 上世纪90年代中期以后，通过监测大熊猫发情期尿液雌激素变化规律，利用雌激素指标作为大熊猫适时配种的指标逐渐开始应用于大熊猫人工授精中，但是对采用雌激素指标作为大熊猫适时配种的指标存在很大的争议，尚无统一观点。

[0008] 目前普遍使用酶联免疫吸附试验检测大熊猫尿样雌激素。若以大熊猫尿中雌激素水平峰值当日作为0天，不同研究人员提出了不同的适时配种雌激素指标。

[0009] Hodges 等（Hodges JK,Bevan DJ,Celma M,Hearn JP,Jones DM,Kleiman DG,Knight JA,Moore DM.1984.Aspects of the reproductive endocrinology of the female Giant Panda(Ailuropoda melanoleuca)in captivity with special reference to the detection of ovulation and pregnancy.J.Zool.,Lond203:253～267.）根据3只大熊猫的研究结果提出适时配种时间可能在第1天、第2天。

[0010] 李复东、彭世媛、叶志勇、何光昕、黄祥明.1993年.雌性大熊猫发情期尿中17β-雌二醇与孕酮水平的变化及其与配种的关系.兽类学报13（3）：166-171，提出适时配种时间应该在第0天和第1天。

[0011] 李学兵、黄祥明、李光汉、李绍昌、张福祥、余建秋、钟顺隆、宋云芳、陈红卫、唐飞、南西.莎卡娜.1994a.大熊猫发情期尿激素的ELISA测定与适时配种.成都国际大熊猫学术研讨会论文集.成都：四川科学技术出版社.247-250，认为适时配种时间应该从0天开始配种一直复配至尿中促黄体生成激素LH峰值出现为止。

[0012] 上面研究人员所提出的大熊猫适时人工授精时机，均是以尿雌激素峰值出现时间为参照，大熊猫适时人工授精时机均没有足够的成功人工授精的实例来支持其观点的正确性是最大的问题。

[0013] 从目前已经报道的成功进行大熊猫人工授精实例而言，一方面对大熊猫适时人工授精时机也缺乏较为一致的看法，并且已经公开报道的人工授精的个体数量较少，从而难以充分支持其观点。

[0014] 黄炎.2001年.使用冷藏精液进行大熊猫（Ailuropoda melanoleuca）人工授精.应用与环境生物学报-2001.7(6).-558-562，报道了一例大熊猫人工授精案例，认为大熊猫人工授精的最佳时间在雌兽尿液中的雌激素达到最大峰值后的48～72小时,而在之后同一作者又否定了之前提出的这一看法。

[0015] 黄炎.2006年.雌性大熊猫发情期雌酮的研究.四川农业大学学位论文，通过对2004～2005年度对中国保护大熊猫研究中心的26只次大熊猫尿液雌酮含量进行了检测，并且分析了自然交配与人工授精发生时间与成功产仔的关系，提出雌性大熊猫交配或人工授精的最佳时间是尿液雌酮含量达到峰值的当天,即0天进行。

[0016] 喻述容等.2003年.繁殖期雌性大熊猫尿中激素变化的研究.畜牧兽医学报-2003.34(5).-452-456），对大熊猫适时配种时间又提出了不同的看法，在对39只大熊猫发情期尿液雌酮以及配种时机与产仔结果进行分析后提出，在尿液雌酮峰值下降12h内进行首次自然交配、人工授精或两者交替配种，受孕率达100％；峰值下降12—24h内进行首次自然交配、人工授精或两者交替配种，受孕率达83.3％；峰值下降24h后进行首次配种，受孕率为0。

[0017] 后两篇报道尽管报道的人工授精案例较多，并且通过自然交配以及人工授精时机与产仔成功的关系提出了适时配种时间，但是后两篇报道存在的最大问题在于两位作者均将人工授精与自然交配这两种不同的配种方式合并统计，而没有单独统计单纯人工授精时机与成功产仔的关系。由于自然交配并不需要麻醉，对排卵的影响较小，而人工授精则需要在麻醉状态下进行，若人工授精时机不当，将对排卵产生较大的影响，因此将人工授精与自然交配这两种不同的配种方式合并统计后所提出的适时人工授精时机不能真实反映合理的适时人工授精时机，因此这两位作者提出的人工授精时机尚缺乏足够依据，并且所提出的适时人工授精时机也缺乏后续应用以及产仔率结果的报道来证明其正确性。

[0018] 关于现有的大熊猫适时人工授精技术，目前提出的适时人工授精时间均以尿液雌激素峰值出现时间作为判断依据，并且所提出的适时人工授精时间指标差异较大。若以雌激素峰值出现当日作为0天，提出的适时人工授精时间分别为：第一种观点是第1天、第2天（Hodges等，1984）；第二种观点是第0天和第1天（李复东等，1993）；第三种观点是从0天开始配种一直复配至尿中LH峰值出现为止（李学兵等，1994）；第四种观点是0天（黄炎，2006）；第五种观点是若以雌激素峰值出现时刻作为0小时，适时配种时间为0～24小时，最好为0～12小时（喻述容，2003）。总结起来，若以雌激素峰值当日作为0天，对于首次人工授精时间目前的观点均为0天或者第一天。

[0019] 综上所述，现有的大熊猫适时人工授精时机的判断技术目前存在以下问题：1.目前所提出的所有观点均没有实际应用并获得足够的人工授精受孕率（或产仔率）数据来证明其观点的正确性。2.所提出的适当人工授精时机仅仅基于几个实例提出，缺乏足够数据支持导致依据不足；或者所提出的适时人工授精时间未将人工授精与自然交配分开，而是将自然交配与人工授精合并统计提出，没有单独统计单纯人工授精的时机与成功产仔的关系，因此所提出的人工授精时机尚缺乏足够依据。3.目前所提出的适时人工授精观点全部基于雌激素峰值出现时间来提出，由于大熊猫发情期雌激素变化曲线本身为波动性曲线，会出现多个峰值，并且大熊猫排卵还涉及孕激素、发情行为等其他多个因素，如果仅仅依据雌激素结果会导致实践中难以判断真实峰值的出现时间，但是目前对于如何确切判断雌激素峰值是否为真实峰值尚无任何相关报道，这为确定适时人工授精时机并提高人工授精成功率带来了极大困难。

发明内容

[0020] 本发明要解决的技术问题是一种如何判断大熊猫雌二醇真实峰值、如何在大熊猫雌二醇真实峰值出现之后进行高效人工授精的大熊猫适时人工授精方法。

[0021] 为解决上述技术问题，本发明一种大熊猫适时人工授精方法，包括以下步骤：

[0022] （1）春季发情期间，按时间要求对雌性大熊猫进行尿样收集，同时观察大熊猫发情行为，在尿样上标记后进行冷冻或冷藏保存，然后对尿样采用酶联免疫吸附试验检测雌二醇值和孕酮值；所述记录在尿样上的标记主要包括雌性大熊猫呼名、排尿时间等；所述的雌二醇值和孕酮值是指通过尿样中肌酐浓度校正测定得到的雌二醇值和孕酮浓度值结果；所述雌二醇为尿样中主要的一种雌激素，所述孕酮为尿样中主要的一种孕激素；

[0023] （2）在以大熊猫排尿时间作为横坐标、以雌二醇值和孕酮值作为纵坐标的平面坐标上，分别标出排尿时间及其对应的雌二醇值和孕酮值所确定的两组坐标点，将两组坐标点分别依次连接起来，绘制出雌二醇值变化曲线图和孕酮值变化曲线图，找出雌二醇最高峰值及其对应的孕酮值；所述的雌二醇最高峰值亦是雌二醇的最高值；

[0024] （3）根据雌二醇最高峰值出现时间前的孕酮值计算出发情雌性大熊猫孕酮基础值，并计算出雌二醇最高峰值或其后的雌二醇峰值对应的孕酮值与孕酮基础值的比值；

[0025] （4）依据雌二醇值变化曲线图和孕酮值变化曲线图，将雌二醇最高峰值或其后的雌二醇峰值在下降幅度达到50%以上所用的时间、雌二醇从最高峰值或其后的峰值在下降的过程中孕酮值是否呈上升趋势和大熊猫是否出现典型发情高峰行为、雌二醇最高峰值或其后的雌二醇峰值所对应的的孕酮值与孕酮基础值的比值等情况同时结合起来，共同判断出大熊猫雌二醇真实峰值；所述出现大熊猫雌二醇真实峰值的时刻为对应的大熊猫排尿时间；

[0026] （5）以雌二醇真实峰值的出现时刻为时间起点0小时，在之后的24小时～48小时的范围内大熊猫出现发情高峰行为时进行第一次人工授精。

[0027] 所述的一种大熊猫适时人工授精方法，其发情雌性大熊猫孕酮基础值的计[0028] 算按以下步骤进行：

[0029] ①选取大熊猫雌二醇最高峰值前的所有孕酮值，找出所选孕酮值中的最大值A，计算出所选孕酮值的算数平均值B、标准差C，然后得出B＋2C＝D；

[0030] ②如果A-D为负，此时的算数平均值B即为孕酮基础值；

[0031] ③如果A-D为正，则从选取的孕酮值中找出大于D的所有孕酮值，按①步骤的方式从剩余孕酮值中找出最大值A1，计算出剩余孕酮值的算数平均值B1、标准差C1，然后得出B1＋2C1＝D1；

[0032] ④如果A1-D1仍然为正，则重复①步骤的方式，直到An-Dn为负，此时的算数平均值Bn即为孕酮基础值，其中n代表自然数。

[0033] 所述的一种大熊猫适时人工授精方法，若雌二醇最高峰值在10小时～20小时范围内下降幅度达到50%以上、之后雌二醇连续下降到基础值、雌二醇最高峰值对应的孕酮值与孕酮基础值的比值大于2，同时在雌二醇从最高峰值下降的过程中雌二醇最高峰值对应的孕酮值呈上升趋势和大熊猫出现典型发情高峰行为，则可以确定此雌二醇最高峰值为熊猫雌二醇真实峰值。

[0034] 所述的一种大熊猫适时人工授精方法，若雌二醇最高峰值在20小时～31小时范围内下降幅度达到50%以上、之后雌二醇连续下降到基础值、雌二醇最高峰值对应的孕酮值与孕酮基础值的比值大于1.8，同时在雌二醇从最高峰值下降的过程中孕酮值呈上升趋势和大熊猫出现典型发情高峰行为，则可以确定此雌二醇最高峰值为大熊猫雌二醇真实峰值。

[0035] 所述的一种大熊猫适时人工授精方法，若雌二醇从最高峰值下降50%的时间在20小时以上、雌二醇最高峰值对应的孕酮值与孕酮基础值的比值小于1.8，同时雌二醇最高峰值之后出现一个或多个峰值、且雌二醇从最高峰值下降的过程中孕酮值未呈上升趋势和大熊猫未出现典型发情高峰行为，则可以确定雌二醇最高峰值为假峰值；此时，大熊猫雌二醇真实峰值为雌二醇最高峰值之后的某一峰值，并且该峰值必须同时具备在10小时～20小时范围内下降幅度达到50%以上、之后雌二醇连续下降到基础值、该峰值对应的孕酮值与孕酮基础值的比值大于2、在雌二醇从该峰值下降的过程中该峰值对应的孕酮值呈上升趋势和大熊猫出现典型发情高峰行为等情况。

[0036] 所述的10小时～20小时范围是指大熊猫雌二醇从真实峰值下降50%所用时间的主要判断标准，它是通过78例大熊猫发情期雌二醇变化规律的统计中总结出的，78例的数据量远远超过了以往的任何报道量，是迄今为止世界上最大的数据量，78例中有80%的大熊猫个体均在这一范围内，因此，10小时～20小时范围的判断标准具有非常高的可靠性。

[0037] 所述的大熊猫典型发情高峰行为包括明显的压尾反射（在发情高峰期大熊猫出现特殊的发情行为，即用竹竿等硬物刺激大熊猫后躯，大熊猫出现静立、翘尾反应）和待配行为（大熊猫自主出现静立、翘尾、躯干下沉现象）。

[0038] 所述的任何一种大熊猫适时人工授精方法，其按时间要求对雌性大熊猫进行尿样收集的过程如下：

[0039] （1）观察雌性大熊猫外阴部，若外阴部出现红肿后，则每天收集1份雌性大熊猫晨尿；

[0040] （2）从雌二醇连续上升后的第4天开始，每天间隔8小时左右收集3份尿样；

[0041] （3）雌性大熊猫发情高峰行为前后，每天间隔5小时左右收集5份尿样；

[0042] （4）一旦监测到雌二醇值有下降趋势，将尿样收集间隔时间缩短为3小时左右。

[0043] 所述的任何一种大熊猫适时人工授精方法，其每一次大熊猫尿样收集包括以下步骤：

[0044] （1）清洁并晾干兽舍硬化地面；

[0045] （2）将需收集尿样的大熊猫放入兽舍，工作人员守候，一旦大熊猫排出小便，立即将大熊猫放到其它兽舍；

[0046] （3）用清洁注射器采集地面新鲜尿样，装入冷冻管，做好标记，然后立即置冰箱内冷冻或冷藏装置。

[0047] 所述的任何一种大熊猫适时人工授精方法，其人工授精包括以下步骤：

[0048] （1）准备大熊猫精液；

[0049] （2）麻醉大熊猫，大熊猫仰卧保定，仔细清洗大熊猫阴门周围；

[0050] （3）将开殖器缓慢旋转插入大熊猫阴道，借助手电筒或其它光源观察阴道内子宫颈口；

[0051] （4）将大熊猫输精器缓慢插入大熊猫子宫颈口，用注射器吸取精液，连接到输精器上，将精液缓慢注入子宫颈内；取下注射器并注入少量空气，借以排尽输精器内残余精液；

[0052] （5）解开大熊猫保定绳，让大熊猫自然苏醒。

[0053] 所述的任何一种大熊猫适时人工授精方法，在第一次人工授精完成6～8小时候后进行第二次人工授精。

[0054] 现有资料无任何关于如何判断大熊猫雌激素真实峰值的报道以及相关技术与判断标准,本发明将解决如何判断大熊猫雌二醇的真实峰值，同时确定判断标准，并将雌二醇真实峰值对应的大熊猫排尿时间确定为雌二醇真实峰值的出现时间。

[0055] 大熊猫尿样采集间隔时间会直接影响到对其是否为真实峰值的判断，间隔时间过长会漏掉真实的峰值，间隔时间过短一方面会增加工作量以及对动物的干扰，另一方面会降低采样的可行性。现有资料报道的大熊猫尿样采集时间不确定且不统一，有的采集时间间隔长达1天,会导致对峰值时间的判断误差范围较大；而本发明采用的采样时间间隔方案在发情高峰期间隔时间为3小时左右，使对大熊猫雌二醇峰值时间的判断误差范围缩小到1.5小时左右，大大缩小了对大熊猫雌二醇峰值时间的判断误差。

[0056] 现有公开报道对大熊猫雌激素峰值的判断时间均单纯检测尿液雌激素水平，而没有检测发情高峰期孕激素水平与行为学指标进行综合判断。判断雌二醇是否出现真实峰值的关键是判断雌二醇是否出现真实的下降，一旦监测出现雌二醇下降，尚不能判断究竟是雌二醇波动还是真实的下降。为了解决该问题，本发明一方面在监测尿液雌二醇的同时监测尿液孕酮水平，同时确定量化雌二醇真实下降的标准，采用行为学辅助手段综合判断大熊猫尿液雌二醇是否为真实下降。

[0057] 判断雌二醇是否出现真实峰值的关键是判断雌二醇是否出现真实的下降，本发明将通过统计分析尽可能多的大熊猫发情期雌二醇数据，确定大熊猫雌二醇峰值的下降速度参考值范围来量化确定大熊猫雌二醇是否出现真实下降。

[0058] 一旦监测到大熊猫出现可疑峰值，通过加大采样密度将采样间隔时间缩短到3小时左右连续采样，监测雌二醇下降的速度来确定雌二醇是否为真实下降。

[0059] 成都大熊猫繁育研究基地多年来对共计78例大熊猫雌二醇变化规律进行了统计分析，分析雌二醇从真实峰值下降50%以上所需的时间分布，绘制出如图1所示的发情期雌性大熊猫雌二醇从真实峰值下降50%所需时间分布频率，采用百分位数法确定大熊猫尿雌二醇峰值下降50%所需时间参考值范围，结果见表2：

[0060] 表2.雌二醇真实峰值下降50%所需时间(h)

[0061]

[0062] 从表2可以看到通过对78例大熊猫发情期雌二醇变化规律的统计发现，大熊猫尿雌二醇从真实峰值下降50%所需时间的最大值为31.17小时、最小值为5.83小时，其中80%的大熊猫个体均在9.83～19.86小时范围内，即在10～20小时范围内，小于20小时；同时分析出现了雌二醇假峰值的16例大熊猫，分析雌二醇峰值下降50%所需时间及其时间分布，结果见表3：

[0063] 表3.雌二醇假峰值下降50%所需时间(h)

[0064]

[0065] 从表3可以看到，对于出现雌二醇假峰值的个体，雌二醇从假峰值下降50%所需时间要长于真峰值个体，在14.58～41.5小时范围内，其中80%的个体在20～38.7小时范围内，即在20～39小时范围内，大于20小时。

[0066] 利用这一数据对鉴别判断大熊猫尿液雌二醇是波动还是真实下降提供了有力的量化参考数据，一旦监测到大熊猫尿雌二醇从一高值在短时间内出现迅速下降，若在10小时～20小时的范围内雌二醇下降幅度达50%以上，则可判断这一下降为真实下降；而一旦出现雌二醇下降速度过慢，下降50%的时间超过20小时，可初步判断为雌二醇波动，而非真实下降。

[0067] 在现有关于大熊猫适时人工授精的公开报道中，仅仅采用了大熊猫雌激素峰值作为参考，没有同时监测尿样孕激素水平。本发明在检测大熊猫尿样雌二醇的同时，同时监测大熊猫尿样孕酮水平，一旦出现雌二醇的下降，同时查看孕酮水平变化，若孕酮无上升趋势，则判断为雌二醇的波动，而非真实下降，若孕酮出现上升趋势则雌二醇可能已经出现真实下降，将进一步缩短尿样的采集间隔时间至每3小时左右一次，直至完全确认雌二醇的真实下降时间为止，从而提高了雌二醇检测的准确性。

[0068] 为了量化确定大熊猫出现真假雌二醇峰值时对应的孕酮水平差异，用以进一步量化确定雌二醇真实峰值，比较了真假雌二醇峰值对应的孕酮值与孕酮基础值的比值的差异，结果见表4：

[0069] 表4.真假雌二醇峰值对应的孕酮值与孕酮基础值的比值比较

[0070]

[0071] 从表4可以看到，80%的个体当出现雌二醇真实峰值时，其对应的孕酮值水平升高，孕酮值与其基础值的比值在1.79～3.14之间，即大于1.8；而当出现假雌二醇峰值后，其对应的孕酮值水平较低，80%的个体孕酮值与其基础值的比值在0.94～2.13之间，即小于2，该数据可进一步量化确定雌二醇是否为真实峰值。若出现可疑的雌二醇峰值后，计算出其对应的孕酮值与孕酮基础值的比值，若大于2可进一步确认该雌二醇峰值为真实峰值，若该比值小于1.8，则该雌二醇峰值可能为假峰值，若大于1.8需要进一步结合行为学指标确定。

[0072] 现有公开报道中，没有关于采用大熊猫发情行为辅助判断雌二醇是否为真实下降的有关报道，仅在2006年科学出版社出版、页码为257页、作者为张志和与魏辅文的《大熊猫迁地保护理论与实践》中有相关说明：86.4%(19/22)的大熊猫首次自然交配的发生时间在雌激素峰值以后，大熊猫能进行自然交配的时间通常出现在发情高峰。该《大熊猫迁地保护理论与实践》表明，可辅助采用大熊猫是否出现发情高峰行为作为雌激素是否真实下降的辅助参考依据。

[0073] 本发明一旦监测到大熊猫出现雌二醇下降，孕酮上升，同时观察大熊猫发情行为，若大熊猫出现典型发情高峰行为，则可辅助判断大熊猫出现雌二醇真实下降，否则尚不能完全确认，这将进一步排除雌二醇和孕酮同时出现波动的情形。

[0074] 由于大熊猫发情期雌二醇呈现波动式变化曲线，并且一旦出现雌二醇峰值，其下降速度很快，由于在大熊猫上不可能连续采集尿样，采样存在一定的时间间隔，尽管加大了采样频率，依然可能漏掉真实的雌二醇峰值样品，造成部分个体会出现从数值上看到的雌二醇最高峰值却不一定是真实的雌二醇峰值的情形，出现假峰值。在现有的所有公开报道中，均没有关于如何剔除假峰值的技术内容。

[0075] 现有的技术仅仅单一依靠雌激素指标判断人工授精时机，存在很大局限，难以确切把握人工授精时机；本发明将采用雌二醇、孕酮、发情行为三个指标综合判断适当的人工受精时机。

[0076] 雌二醇指标：根据本发明确定雌二醇真实峰值出现时间，以雌二醇真实峰值时刻作为0小时，大熊猫适时配种时间为24～48小时之间。

[0077] 孕酮指标：若以雌二醇真实峰值时刻作为0小时，大熊猫适时配种时间需在24～48小时之间、且孕酮呈上升趋势时进行，若未出现孕酮上升，则不适宜作人工授精。

[0078] 行为学指标：若以雌二醇真实峰值时刻作为0小时，大熊猫适宜的首次人工授精时间为24～48小时之间，并且需要选择在大熊猫出现典型发情高峰行为和孕酮上升时进行。

[0079] 由于目前没有公认确切的大熊猫适时人工授精时间，因此在大熊猫人工授精实践中首次人工授精时间是变化的，若以雌激素峰值出现当日作为0天，即若以雌激素峰值出现时刻作为0小时，目前公开报道的大熊猫首次人工授精时间大约在0～48小时范围内。

[0080] 为了确定适时人工授精时间，成都大熊猫繁育研究基地从2005～2010年在大熊猫人工授精中随机选取部分健康、适龄（6～19岁）个体，进行早期人工授精（以雌二醇真实峰值时刻作为0小时，初次人工授精时间在0～24小时内进行），并将早期人工授精组作为对照组；同时随机选取部分健康、适龄大熊猫进行晚期人工授精（以雌二醇真实峰值时刻作为0小时，首次人工授精时间在24～48小时内，出现孕酮上升并出现发情高峰行为时进行），统计大熊猫产仔、流产情况，将产仔以及流产个体作为妊娠个体，否则作为未妊娠个体，计算妊娠率（妊娠胎数/人工授精个体数*100%），对两组大熊猫妊娠率进行比较，结果见表5：

[0081] 表5.不同人工授精时机大熊猫妊娠率比较

[0082]分组 妊娠个体数 未妊娠个体数 人工授精个体数 妊娠率%
早期人工授精组 7 10 17 41.18
晚期人工授精组 7 7 14 50.00
合计 14 17 31 45.16

[0083] 从表5可以看到，通过上表可以看到，无论早期还是晚期进行人工授精，均可成功繁殖后代，但是晚期人工授精的妊娠率高于早期。即在雌二醇真实峰值时刻之后的24～48小时间，在孕酮上升并出现发情高峰行为时进行初次人工授精，其妊娠率高于0～24小时。对14例适龄健康大熊猫采用人工授精技术进行人工授精，产仔率达50%，晚期人工授精组繁殖效率进一步提高，妊娠率较早期人工授精组提高了8.82%。通过上述结果可以得出：若以雌二醇真实峰值时刻作为0小时，大熊猫适宜的首次人工授精时间在24～48小时内，在孕酮上升并出现发情高峰行为时进行。

[0084] 该观点与现有公开资料相比有如下特点：

[0085] 首先，目前所有公开报道中所提出的适时人工授精时机只基于1～3个人工授精实例或者没有将自然交配与人工授精分开统计，提出的人工授精时机缺乏足够依据；而本发明提出的人工授精时机采集较多的人工授精实例，同时将自然交配与人工授精案例分开，并且只采用适龄（6～19岁）、健康雌性个体全人工授精案例分析，排除了因健康原因以及年龄不当导致的繁殖失败，并提出适时人工授精时机，因此所提出的人工授精时机依据更为充分。

[0086] 其次，若以雌二醇真实峰值时刻作为0小时，本发明首次提出大熊猫适时人工授精时间为24～48小时，与现有公开资料观点均不同，现有公开资料均没有将大熊猫首次人工授精时间确定为24小时以后，这样实际上否定了过去将大熊猫适时人工授精时间确定为0天或第一天的观点，实际上延迟了大熊猫初次人工授精时间。

[0087] 同时，本发明在确定适当的初次人工授精时机时，选择在孕酮上升期间同时出现发情高峰行为时进行，为本发明首次提出并成功实践。

[0088] 最后，本发明提出的适时人工授精时间以小时而不是以天为单位，更为准确并易于把握，现有公开资料绝大多数提出的适时人工授精时间以天为单位，时间模糊，难以确切把握。

[0089] 在2000年以后关于大熊猫人工授精公开报道中，最多的只报道了7例大熊猫人工授精案例（黄炎，2002），难以说明人工授精的妊娠率，目前只有冯文和（冯文和、张安居，1997）对1980～1993年度共计对98只次大熊猫人工授精妊娠率进行了统计。由于冯文和统计的实施人工受精的个体并没有将健康问题以及非适龄个体排除，因此，为尽量与过去数据进行比较，从2005～2010年开始在成都大熊猫繁育研究基地对包括有健康问题、年龄在5岁～22岁之间的19只大熊猫实施了本发明，实验结果与冯文和报道的数据进行对比，对比结果见表6：

[0090] 表6.不同人工授精技术产仔率比较

[0091]分组 妊娠 未妊娠 人工授精个体数 妊娠率
冯文和报道 20 78 98 20.41%
本发明技术 8 11 19 42.11%*
合计 28 89 117 23.93%

[0092] 备注：*表示差异显著（p=0.042<0.05）

[0093] 采用SPSS统计软件对本发明妊娠率与冯文和报道的大熊猫人工授精妊娠率数据采用卡方检验进行差异比较，结果概率P=0.042<0.05，概率P<0.05表示差异显著,即采用本发明技术实施人工授精与冯文和报道的结果比较可显著提高大熊猫妊娠率。

[0094] 由于本发明能够准确确立了大熊猫雌二醇真实峰值及其出现时刻，进而以大熊猫雌二醇真实峰值出现时刻为时间起点0小时，在之后的24～48小时内出现孕酮上升及发情高峰行为时进行第一次人工授精，在第一次人工授精完成6～8小时后再进行第二次人工授精，最终大熊猫妊娠率取得了显著提高，与过去相比大熊猫人工授精妊娠率由20.41%提高到42.11%、翻了一倍多。

附图说明

[0095] 下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

[0096] 图1为本发明发情期雌性大熊猫雌二醇从真实峰值下降50%所用时间分布频率示意图；

[0097] 图2为本发明雌性大熊猫个体的第一种雌二醇值和孕酮值的变化曲线图；

[0098] 图3为本发明雌性大熊猫个体的第二种雌二醇值和孕酮值的变化曲线图；

[0099] 图4为本发明雌性大熊猫个体的第三种雌二醇值和孕酮值的变化曲线图。

[0100] 图中标识：α为雌二醇值变化曲线图上大熊猫雌二醇真实峰值的坐标点，β为孕酮值变化曲线图上与α对应的坐标点，Ec ng/mg Cr表示为通过尿样中肌酐浓度校正测定得到的雌二醇浓度值结果，Pg ng/mg Cr表示为通过尿样中肌酐浓度校正测定得到的孕酮浓度值结果。

具体实施方式

[0101] 本发明在春季大熊猫发情期间每日观察雌性大熊猫外阴颜色，大熊猫外阴红肿为大熊猫发情启动的特征表现，一旦发现外阴红肿，即可初步确定大熊猫进入发情期，继续每日观察大熊猫发情行为，若出现频繁标记行为、咩叫行为则可确定大熊猫已经发情。

[0102] 大熊猫发情启动后，开始对雌性大熊猫尿样进行收集，在尿样上记录熊猫呼名、排尿时间、是否出现典型发情高峰行为等标记，并及时地对收集的大熊猫尿样进行化验分析，采用酶联免疫吸附试验检测出与大熊猫呼名及排尿时间对应的雌二醇值和孕酮值；起初每天收集1份晨尿；雌二醇值连续上升后第4天开始，每天收集3份尿样，间隔8小时左右，时间分别为7:00，15:00，23:00左右；发情高峰前后，每天尿样增加到5个左右，间隔5小时左右，收集时间分别为：6:00，11:00，16:00，21:00，1:00左右；一旦监测到雌二醇值有下降趋势，将尿样收集间隔时间缩短为3小时左右，直至最终确认雌二醇值真实下降为止。

[0103] 每一次大熊猫尿样收集都是从清洁后的硬化地面收集，先清洁并晾干兽舍地面后，将需收集尿样的大熊猫放入兽舍；然后工作人员守候，一旦大熊猫排出小便，立即将大熊猫放到其它兽舍，用清洁注射器采集地面新鲜尿样，装入冷冻管，做好标记，立即放入冰箱冷冻室冷冻保存或冷藏室冷藏保存。

[0104] 在以大熊猫排尿时间作为横坐标、以雌二醇值和孕酮值作为纵坐标的平面坐标上，分别标出排尿时间及其对应的雌二醇值和孕酮值所确定的两组坐标点，将两组坐标点分别依次连接起来，绘制出雌二醇值变化曲线图和孕酮值变化曲线图，找出雌二醇最高峰值或其后的雌二醇峰值对应的孕酮值，计算出发情雌性大熊猫孕酮基础值。

[0105] 发情雌性大熊猫孕酮基础值的计算按以下步骤进行：

[0106] ①选取大熊猫雌二醇最高峰值前的所有大熊猫雌二醇值对应的孕酮值，找出所选孕酮值中的最大值A，计算出所选孕酮值的算数平均值B、标准差C，然后得出B＋2C＝D；

[0107] ②如果A-D为负，此时的算数平均值B即为孕酮基础值；

[0108] ③如果A-D为正，则从选取的孕酮值中找出大于D的所有孕酮值，按①步骤的方式从剩余孕酮值中找出最大值A1，计算出剩余孕酮值的算数平均值B1、标准差C1，然后得出B1＋2C1＝D1；

[0109] ④如果A1-D1仍然为正，则重复①步骤的方式，直到An-Dn为负，此时的算数平均值Bn即为孕酮基础值，其中n为自然数。

[0110] 依据雌二醇值变化曲线图和孕酮值变化曲线图，将雌二醇最高峰值或其后的雌二醇峰值在下降幅度达到50%以上所用的时间、雌二醇从最大峰值或其后的峰值在下降的过程中孕酮值是否呈上升趋势和大熊猫是否出现典型发情高峰行为、雌二醇最高峰值或其后的雌二醇峰值所对应的的孕酮值与孕酮基础值的比值等情况同时结合起来，共同判断出大熊猫雌二醇真实峰值。判断大熊猫雌二醇真实峰值的方法分别有如下三种情况。

[0111] 第一种情况：如图2所示，若雌二醇最高峰值在10小时～20小时范围内下降幅度达到50%以上、之后雌二醇连续下降到基础值、雌二醇最高峰值对应的孕酮值与孕酮基础值的比值大于2，同时在雌二醇从最高峰值下降的过程中孕酮值呈上升趋势和大熊猫出现典型发情高峰行为，则可以确定此雌二醇最高峰值为大熊猫雌二醇真实峰值，即图2中的α坐标点，β为与α对应的孕酮值坐标点。

[0112] 第二种情况：如图3所示，若雌二醇最高峰值在20小时～31小时范围内下降幅度达到50%以上、之后雌二醇连续下降到基础值、雌二醇最高峰值对应的孕酮值与孕酮基础值的比值大于1.8，同时在雌二醇从最高峰值下降的过程中孕酮值呈上升趋势和大熊猫出现典型发情高峰行为，则可以确定此雌二醇最高峰值为大熊猫雌二醇真实峰值，即图3中的α坐标点，β为与α对应的孕酮值坐标点。

[0113] 第三种情况：如图4所示，若雌二醇从最高峰值下降50%的时间在20小时以上、雌二醇最高峰值对应的孕酮值与孕酮基础值的比值小于1.8，同时雌二醇最高峰值之后出现一个或多个峰值、且雌二醇从最高峰值下降的过程中孕酮值未呈上升趋势和大熊猫未出现典型发情高峰行为，则可以确定此雌二醇最高峰值为假峰值；此时，大熊猫雌二醇真实峰值为雌二醇最高峰值之后的某一峰值，并且该峰值必须同时具备在10小时～20小时范围内下降幅度达到50%以上、之后雌二醇连续下降到基础值、该峰值对应的孕酮值与孕酮基础值的比值大于2、在雌二醇从该峰值下降的过程中该峰值对应的孕酮值呈上升趋势和大熊猫出现典型发情高峰行为等情况，即图4中的α坐标点，β为与α对应的孕酮值坐标点。

[0114] 将以上三种情况分别判断出的雌二醇真实峰值的出现时刻规定为时间起点0小时，即相应的大熊猫排尿时间为0小时，在之后的24小时～48小时的范围内出现孕酮上升及发情高峰行为时进行第一次人工授精，第一次人工授精完成6～8小时后再进行第二次人工授精。

[0115] 每次人工授精都在大熊猫出现典型发情高峰行为和孕酮值呈上升趋势时进行，并按以下步骤操作：

[0116] a.准备大熊猫精液；

[0117] b.麻醉大熊猫，大熊猫仰卧保定，仔细清洗大熊猫阴门周围；

[0118] c.将开殖器缓慢旋转插入大熊猫阴道，借助手电筒或其它光源观察阴道内尿道口以及子宫颈口；

[0119] d.将大熊猫输精器缓慢插入大熊猫子宫颈口，用注射器吸取精液，连接到输精器上，将精液缓慢注入子宫颈内；取下注射器并注入少量空气，借以排尽输精器内残余精液；

[0120] e.解开大熊猫保定绳，让大熊猫自然苏醒。

[0121] 本发明可以在人工授精前利用输精器，插入雌性大熊猫尿道口，吸取并排出膀胱内积尿。