猪肌肉特异性ITGB1BP2启动子及其应用

摘要

本发明属于猪分子遗传学领域，具体涉及一种猪肌肉特异表达基因ITGB1BP2启动子的克隆鉴定与应用。本发明的步骤包括：提取大白猪不同组织总RNA，进行荧光定量PCR，确定其在肌肉组织中特异表达。以大白猪肌肉组织总DNA为模板，设计引物，PCR扩增获得猪ITGB1BP2基因5’端侧翼1442bp的序列，构建15个长度不同的ITGB1BP2启动子缺失片段的荧光素酶报告基因质粒，转染C2C12细胞，检测每个缺失片段的启动子活性，鉴定猪ITGB1BP2基因启动子。本发明克隆的猪ITGB1BP2基因启动子的核苷酸序列如序列表SEQ？ID？NO：1所示，为猪的遗传改良和转基因提供了重要的元件和手段，可强化转基因表达的肌肉组织特异性和稳定性。

权利要求

1.猪肌肉特异表达基因ITGB1BP2启动子高活性片段PGL3-P6在猪遗传改良和转基因表达中的应用，其特征在于：所述片段的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:7所示。

说明书

猪肌肉特异性ITGB1BP2启动子及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于猪基因工程技术领域，具体涉及一种新的启动子序列，该启动子可以调控目的基因ITGB1BP2表达，本发明包括猪ITGB1BP2启动子的克隆、鉴定与应用。

背景技术

[0002] ITGB1BP2(integrin beta 1 binding protein 2)编码整合素β1结合蛋白2，又名Melusin，与整合素β1胞浆区域的膜近侧区相结合，是一个肌肉组织特异性蛋白，其作用相当于整合素途径的生物力学感应器，参与调控整合素介导的细胞信号转导系统，控制基因的表达和细胞的生长与存活，在肌细胞成熟和组织形成过程中发挥着重要的作用。免疫荧光显示ITGB1BP2与integrins和vinculin一起位于包含α-辅肌动蛋白的Z线近侧的肋状体，所以其也是整合素-肌动蛋白连接复合体的重要组分之一。ITGB1BP2有着多个独特的结构域，在其C-端包含有一个integrin结合位点和一个位于C-末端的能高容量低亲和力结合钙的富含天门冬氨酸和谷氨酸的44个氨基酸残基区域，在其N-端存在保守的2+
SH3和SH2的结合位点，包含有两个结合Zn 的串联重复的CHORD结构域(通过该结构域ITGB1BP2可以与热休克蛋白共调控，如ITGB1BP2可以作为分子伴侣直接与Hsp90结合，并能与Hsp90的一个公认的互作因子Sgt1相互作用)，其可能是肌肉细胞中连接整合素受体和细胞骨架分子或转导蛋白的重要分子，作为一种接头蛋白募集其他的信号分子到整合素β1的尾区，从而调节细胞的增殖与分化。另外，ITGB1BP2还参与调控AKT/GSK3β和ERK1/2的磷酸化和转录因子NF-AT和GATA4的激活(AKT、GSK3β和ERK1/2是抗细胞凋亡的主要信号蛋白，定向过表达ITGB1BP2，可以引起AKT、GSK3β和ERK1/2的磷酸化增加)，从而控制细胞的存活和肥大。此外，Melusin还能与S100A6(又称calcyclin)、S100A1和S100A4结合(Filipek et al.Involvement of S100A6(calcyclin)and its binding partners in intracellular signaling pathways.Adv Enzyme Regul.2008，48：225-39)。Brancaccio等(1999)通过荧光素原位杂交技术将人的Melusin基因定位于Xq12.1-q13区，在老鼠中位于与人同源的X染色体D区。我们研究发现其在大白猪背最长肌中的表达量明显高于梅山猪，并获得其cDNA全长序列(GenBank登录号为DQ002920)。

[0003] ITGB1BP2基因的表达在肌细胞增殖和分化过程中受到严格的表达调控。体外实验表明，ITGB1BP2基因在正在分化的成肌细胞中不表达，而在分化了的肌肉细胞中高表达。体内研究表明，ITGB1BP2基因的表达在15天的小鼠胚胎中可以检测到，并且在初生时达到最高的表达量，在成年骨骼肌组织中表达量略有下降。在其表达量最高期，正好处于次级肌细胞(secondary myogenesis)的生成时期，大量的肌细胞以初步形成的肌小管(myotube)为支架不断融合形成次级肌管并进一步生成肌肉纤维。在成年小鼠的胫骨前肌的重生过程中，ITGB1BP2基因也有很高的表达量(Brancaccio et al.Melusin is a new muscle-specific interactor for beta 1 integrin cytoplasmic domain.J.Biol.Chem.1999，274：29282-29288)。

[0004] 真核生物的转录调控是基因表达调控的最重要途经，启动子是影响转录复合物形成和转录起始的关键DNA序列，含有基因表达调控网络的重要信息，基因表达的强度以及特异性很大程度上决定于它(Remenyi et al.Combinatorial control of gene expression.Nat Struct Mol Biol.2004，11：812-815；Kim et al.Direct isolation and identification of promoters in the human genome.Genome Res.2005，15：830-839)。ITGB1BP2在肌肉组织中特异性表达，并在肌细胞增殖和分化过程中受到严格的表达调控。
该基因的研究目前在猪中还未见报道。因此，分离克隆猪ITGB1BP2的启动子，研究其启动子的结构、功能和核心启动区的定位，是理解其基因表达调控机制及调控网络最基本、最重要的内容。利用其肌肉特异性启动子构建更有效的基因工程表达载体，可强化转基因表达的肌肉组织特异性和稳定性，应用于基因工程、育种工程等领域。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于分离克隆与鉴定猪肌肉特异表达基因ITGB1BP2的启动子，利用该启动子调控目的基因表达，本发明的启动子可应用于猪遗传改良的基因工程和育种工程等领域。

[0006] 本发明克隆得到了猪ITGB1BP2基因5’端侧翼1442bp的序列，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，分析发现其具有启动子序列特征。

[0007] 本发明通过以下技术方案实现：

[0008] 利用TRIzol(购自Invitrogen公司)从大白猪的肌肉等不同组织中提取DNA和RNA，根据猪ITGB1BP2基因的mRNA序列(登录号：DQ002920)设计如下用于猪ITGB1BP2表达谱分析的引物序列，如下所述：

[0009] 正向引物ITGB1BP2qF：5′GATTCCACTTCCTGCGTTCA 3′；

[0010] 反向引物ITGB1BP2qR：5′CGAGATGGCATCAAGGAGAC 3′。

[0011] 以大白猪不同组织RNA为模板，反转录得到cDNA序列，进行荧光定量PCR扩增，检测猪ITGB1BP2基因在大白猪不同组织中的表达谱，确定其在肌肉组织中特异表达。

[0012] 以猪ITGB1BP2基因的mRNA序列(登录号：DQ002920)为种子，在猪的基因组中进行比对，根据其5’侧翼序列设计如下用于猪ITGB1BP2启动子扩增的引物，序列如下所述：

[0013] 正向引物ITGB1BP2pF：5′GTAGGGGATTCCTCCAAT 3′；

[0014] 反向引物ITGB1BP2pR：5′CCACAGCCTTTGTTATGG 3′。

[0015] 以大白猪肌肉组织DNA为模板，进行PCR扩增，克隆，提取质粒pMD18-T-ITGB1BP2，并进行测序。

[0016] 利用生物信息学方法对所获启动子可能存在的转录因子结合位点进行分析，设计出15个长度不同的启动子缺失片段的扩增引物，其各干算序列如下所述：

[0017] PGL3-P1正向引物 5′GAAGATCTGAGGGGCGGTATTGA3′；

[0018] PGL3-P2正向引物 5′GAAGATCTGCATTCCTGAAGTC3′；

[0019] PGL3-P3正向引物 5′GAAGATCTAGCCTGGGAGAGTCA3′；

[0020] PGL3-P4正向引物 5′GAAGATCTTGGATCCAGTTAGAGC3′；

[0021] PGL3-P5正向引物 5′GAAGATCTCCGCAGAGGTCACAG3′；

[0022] PGL3-P6正向引物 5′GAAGATCTATTTTAGGTAGTTATGC3′；

[0023] PGL3-P7正向引物 5′GAAGATCTTTTGTCCCTGATAACC3′；

[0024] PGL3-P8正向引物 5′GAAGATCTCGGGGAGGCTCTGTA3′；

[0025] PGL3-P9正向引物 5′GAAGATCTATCCATCTAGACAAAAC3′；

[0026] PGL3-P10正向引物 5′GAAGATCTAATCCCATGCTGTTG3′；

[0027] PGL3-P11正向引物 5′GAAGATCTAGCAATTGGGGTACT3′；

[0028] PGL3-P12正向引物 5′GAAGATCTCTCAAAATTGGTATTCA3′；

[0029] PGL3-P13正向引物 5′GAAGATCTCTTGGAATTGGCATG3′；

[0030] PGL3-P14正向引物 5′GAAGATCTAAATGTTCCTGAGCT3′；

[0031] PGL3-P15正向引物 5′GAAGATCTCCTTCCAGGCAGCTA3′；

[0032] 反向引物(上述正向引物的共用引物)： 5′CCAAGCTTAAGGGTATTTCAAGG3′。

[0033] 然后以质粒pMD18-T-ITGB1BP2为模板，利用上述正向引物分别与反向引物配对进行PCR扩增，获得15个长度不同的ITGB1BP2启动子缺失片段。之后将15个缺失片段分别连接到PGL3-Basic载体(普洛麦格北京生物技术有限公司，即美国Promega公司中国代理)上，转染C2C12细胞检测每个缺失片段的活性，发现其核心启动子区域位于1107～1388bp之间，上述不同的缺失片段均具有活性。

[0034] 本发明确定了猪ITGB1BP2基因的转录起始位点。应用5’RACE的方法，鉴定猪ITGB1BP2的转录起始位点位于1320bp处(C)。

附图说明

[0035] 序列表SEQIDNO：1为克隆所得到的猪ITGB1BP2的启动子序列。

[0036] 序列表SEQIDNO：2为从所述SEQIDNO：1克隆得到的作为另一个启动子PGL3-P1应用的核苷酸序列。

[0037] 序列表SEQIDNO：3为从所述SEQIDNO：1克隆得到的作为另一个启动子PGL3-P2应用的核苷酸序列。

[0038] 序列表SEQIDNO：4为从所述SEQIDNO：1克隆得到的作为另一个启动子PGL3-P3应用的核苷酸序列。

[0039] 序列表SEQIDNO：5为从所述SEQIDNO：1克隆得到的作为另一个启动子PGL3-P4应用的核苷酸序列。

[0040] 序列表SEQIDNO：6为从所述SEQIDNO：1克隆得到的作为另一个启动子PGL3-P5应用的核苷酸序列。

[0041] 序列表SEQIDNO：7为从所述SEQIDNO：1克隆得到的作为另一个启动子PGL3-P6应用的核苷酸序列。

[0042] 序列表SEQIDNO：8为从所述SEQIDNO：1克隆得到的作为另一个启动子PGL3-P7应用的核苷酸序列。

[0043] 序列表SEQIDNO：9为从所述SEQIDNO：1克隆得到的作为另一个启动子PGL3-P8应用的核苷酸序列。

[0044] 序列表SEQIDNO：10为从所述SEQIDNO：1克隆得到的作为另一个启动子PGL3-P9应用的核苷酸序列。

[0045] 序列表SEQIDNO：11为从所述SEQIDNO：1克隆得到的作为另一个启动子PGL3-P10应用的核苷酸序列。

[0046] 序列表SEQIDNO：12为从所述SEQIDNO：1克隆得到的作为另一个启动子PGL3-P11应用的核苷酸序列。

[0047] 序列表SEQIDNO：13为从所述SEQIDNO：1克隆得到的作为另一个启动子PGL3-P12应用的核苷酸序列。

[0048] 序列表SEQIDNO：14为从所述SEQIDNO：1克隆得到的作为另一个启动子PGL3-P13应用的核苷酸序列。

[0049] 序列表SEQIDNO：15为从所述SEQIDNO：1克隆得到的作为另一个启动子PGL3-P14应用的核苷酸序列

[0050] 序列表SEQIDNO：16为从所述SEQIDNO：1克隆得到的作为另一个启动子PGL3-P15应用的核苷酸序列。

[0051] 图1为猪ITGB1BP2基因在大白猪不同组织中的表达谱。

[0052] 图2为猪ITGB1BP25’侧翼序列的PCR扩增结果。

[0053] 图3为猪ITGB1BP2基因转录起始位点的5’RACE鉴定结果。

[0054] 图4为用于分析猪ITGB1BP2启动子不同片段活性的PGL3-basic载体结构示意图。

[0055] 图5为猪ITGB1BP2启动子缺失片段重组质粒的双酶切鉴定：泳道M1-15分别为pGL3-P1、pGL3-P2、pGL3-P3、pGL3-P4、pGL3-P5、pGL3-P6、pGL3-P7、pGL3-P8、pGL3-P9、pGL3-P10、pGL3-P11、pGL3-P12、pGL3-P13、pGL3-P14和pGL3-P15重组质粒的酶切结果。

[0056] 图6为用于分析猪ITGB1BP2启动子不同片段活性所用的pRL-TK内参载体结构示意图。

[0057] 图7为猪ITGB1BP2启动子缺失片段重组质粒转染C2C12细胞的活性检测结果。

具体实施方式

[0058] 实施例1猪基因组DNA和RNA的提取及cDNA的合成

[0059] 利用TRIzol试剂(购自Invitrogen公司，按照该试剂提供的说明书操作)同时从大白猪(来源华中农业大学试验猪场，为常规报道品种，为引进的外来品种)的不同组织中提取DNA和RNA，具体步骤如下：

[0060] (1)将猪的不同组组织(例如肌肉、心、肝、脾、肺、肾)分别在液氮中磨碎，每50～100mg组织中加入1ml TRIzol，用匀浆仪进行匀浆。将匀浆后的样品在室温放置5min后加入氯仿(约每使用1ml TRIzol加0.2ml)，加完后立即剧烈振荡15s，室温放置3min。之后在4℃、12000×g离心15min，样品将分三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。将水相转入一新管中开始RNA的提取，剩下的可以用来提取DNA和蛋白。

[0061] (2)每使用1ml TRIzol加0.5ml异丙醇到水相中，室温放置10分钟后4℃、12000×g离心10min，弃上清；接着加75％乙醇(约每使用1ml TRIzol加1ml)，混匀后
7500×g离心5min，弃上清；在室温放置5-10min，晾干后加入50μlDEPC水，55～60℃放置10min使RNA溶解，-70℃保存。

[0062] (3)每使用1ml TRIzol加0.3ml无水乙醇到中间层和有机相中，室温放置3min后，4℃、2000×g离心5min。弃上清；用含10％乙醇的0.1M柠檬酸钠洗涤DNA沉淀(约每使用1ml TRIzol加1ml)，室温放置30min后，4℃、2000×g离心5min，弃上清，重复一次；再加入75％乙醇(约每使用1ml TRIzol加入1.5～2ml)，室温放置10～20min后(不时颠倒混合)，4℃、2000×g离心5min，弃上清；室温放置晾干DNA 5～10min，每50～70mg组织用300～600μl8mMNaOH溶解DNA，4℃、12000×g离心10min除去组织中的一些不溶物，最后用4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)调pH值至7-8并加入乙二胺四乙酸(EDTA)至
1mM，-20℃保存。

[0063] (4)用浓度测定仪直接测定所提取的RNA和DNA的浓度值和A260/A280比值。

[0064] (5)将提取好RNA用DNase I处理去除RNA中的DNA污染。

[0065] PCR反应体系和PCR反应条件分别见见表1和2所述。

[0066] 表1 PCR反应体系

[0067]

[0068]

[0069] (6)将处理过的RNA用Fermentas公司的RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit反转录成cDNA(按照该试剂盒的说明书操作)，于-20℃保存。

[0070] 表2PCR反应条件

[0071]

[0072] 实施例2 猪ITGB1BP2基因在大白猪不同组织中的表达谱

[0073] 根据猪ITGB1BP2基因的mRNA序列(登录号：DQ002920)设计如下用于猪ITGB1BP2表达谱分析的引物对：

[0074] 正向引物ITGB1BP2qF：5′GATTCCACTTCCTGCGTTCA3′；

[0075] 反向引物ITGB1BP2qR：5′CGAGATGGCATCAAGGAGAC3′。

[0076] 以2月龄大白猪的心、肝、脾、肺、肾、小肠、背最长肌、背脂cDNA为模板，以猪β-actin基因为内参，β-actin的引物如下所述：

[0077] β-actin-qPCR-F：5′CCAGGTCATCACCATCGG3′；

[0078] β-actin-qPCR-R：5′CCGTGTTGGCGTAGAGGT3′。

[0079] 采用SYBR Green I荧光染料(购自Invitrogen公司)，在Roche公司的-ΔΔCtLightCycler480仪器中进行实时定量PCR。利用2 法进行数据分析。试验结果表明猪ITGB1BP2基因主要在心肌中特异高表达(见图1)。

[0080] 定量PCR反应体系和定量PCR反应条件见表3和表4所述。

[0081] 表3 定量PCR反应体系

[0082]

[0083] 表4 定量PCR反应条件

[0084]

[0085] 实施例3 猪ITGB1BP2启动子的克隆

[0086] 以猪ITGB1BP2基因的mRNA序列(登录号：DQ002920)为种子，在猪的基因组中进行比对，根据其5’侧翼序列设计如下用于猪ITGB1BP2启动子扩增的引物：

[0087] 正向引物ITGB1BP2pF：5′GTAGGGGATTCCTCCAAT3′；

[0088] 反向引物ITGB1BP2pR：5′CCACAGCCTTTGTTATGG3′。

[0089] 以大白猪基因组DNA为模板，进行PCR扩增，结果见图2所示。

[0090] PCR反应体系和PCR反应条件见表5和表6所述。

[0091] 表5 PCR反应体系

[0092]

[0093] 使用BioTeKe公司的Gel Purification Kit(Spin-column)试剂盒(按照该试剂盒的说明书操作)对PCR扩增产物进行回收，克隆至pMD18-T载体(普洛麦格北京生物技术有限公司，即美国Promega公司中国代理)，提取质粒pMD18-T-ITGB1BP2，送上海生工生物工程技术服务有限公司进行序列测定。获得猪ITGB1BP2基因5’端侧翼1442bp的序列，其核苷酸序列见序列表SEQ ID NO：1所示。

[0094] 实施例4 猪ITGB1BP2基因转录起始位点的鉴定

[0095] 采用Clontech公司的SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit和 2PCR Kit进行5’RACE，根据试剂盒中对基因特异性引物(Gene-Specific Primers，GSPs)的要求，设计了如下反向引物：

[0096] ITGB1BP2-TSS-R：5′GGAATCAGGAAGGTTGGTTTGGGGA3′

[0097] 按试剂盒说明书进行操作，首先进行反应1，待反应1结束后将产物14000r/min离心10s接着进行反应2。反应2结束后，根据总RNA的量用Tricine-EDTA Buffer对产物进行相应的稀释。然后进行反应3，即5’RACE

[0098] 表7 反应1体系

[0099]

[0100]

[0101] 对反应3的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，对单一、明亮的目的条带进行克隆(见图3)，挑选10个阳性克隆进行测序鉴定，结果表明猪ITGB1BP2基因的转录起始位点为1320bp处的胞嘧啶碱基(C)。

[0102] 实施例5 猪ITGB1BP2启动子不同缺失载体的构建

[0103] 利用TFSEARCH(http://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html)在线预测该区域内潜在的转录因子结合位点。根据在线预测的结果应用Primer 5.0引物设计软件设计了15条上游引物和共用的1条下游引物(序列见表3所示)。根据猪ITGB1BP2基因5’端侧翼1442bp的序列特点和PGL3-basic载体(Promega)的特点，在所有的15条正向引物的5’端均添加BglII限制性酶切位点，在所述的1条共用的反向引物的5’端添加HindIII限制性酶切位点，并加上保护碱基。扩增的片段长度分别为PGL3-P1：1312bp(位置：77～1388，序列见序列表SEQ ID NO：2)，PGL3-P2：1247bp(位置142～1388，序列见序列表SEQ ID NO：3)，PGL3-P3：1217 bp(位置172～1388，序列见序列表SEQ ID NO：4)，PGL3-P4：1186 bp(位置203～1388，序列见序列表SEQ ID NO：5)，PGL3-P5：1004bp(位置385～1388，序列见序列表SEQ ID NO：6)，PGL3-P6：715bp(位置674～1388，序列见序列表SEQ ID NO：
7)，PGL3-P7：666bp(位置723～1388，序列见序列表SEQ ID NO：8)，PGL3-P8：546bp(位置843～1388，序列见序列表SEQ ID NO：9)，PGL3-P9：495bp(位置894～1388，序列见序列表SEQ ID NO：10)，PGL3-P10：438bp(位置951～1388，序列见序列表SEQ IDNO：11)，PGL3-P11：359bp(位置1030～1388，序列见序列表SEQ ID NO：12)，PGL3-P12：328bp(位置1061～1388，序列见序列表SEQ ID NO：13)，PGL3-P13：282bp(位置1107～1388，序列见序列表SEQ IDNO：14)，PGL3-P14：178bp(位置1211～1388，序列见序列表SEQ ID NO：
15)，PGL3-P15：74bp(位置1315～1388，序列见序列表SEQ ID NO：16)。缺失片段扩增引物序列见表13，表13中斜体加粗下划线部位为酶切位点。

[0104] 表13 缺失片段引物序列

[0105]

[0106] 以克隆到的1442bp ITGB1BP2(SEQ ID NO：1)5’端侧翼质粒为模板进行PCR扩增，扩增产物经回收(使用北京百泰克生物技术有限公司胶回收试剂盒，按照说明书操作)，连接到pMD18-T载体(购自宝生物工程大连有限公司)上，转化进入大肠杆菌DH5α挑取阳性克隆提取质粒(使用天根生化科技北京有限公司质粒小提试剂盒，按照试剂的说明书操作)。通过BglII和HindIII双酶切(见图5)，回收所有缺失片段及PGL3-basic空载，利用T4连接酶将缺失片段与PGL3-basic空载连接，挑取阳性克隆提取质粒(参见Omega TME.Z.N.A. Plasmid Mini Kit说明书)。PGL3-basic结构示意图见图4。

[0107] 实施例 6C2C12细胞的培养、转染及猪ITGB1BP2启动子活性鉴定

[0108] C2C12细胞(购于武汉大学中国典型培养物保藏中心)的培养方法根据日常细胞的培养方法，即根据细胞的生长密度及时更换培养液。待C2C12细胞生长至80-90％的密度后将其传代：吸出旧的培养基，用1×PBS(磷酸盐缓冲液，配制方法为：将NaCl8.0g，KCl0.2g，Na2HPO4·H2O1.56g，KH2PO40.2g倒入盛有800ml双蒸水的烧杯中，玻璃棒搅动，充分溶解，调节PH至7.4，然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至1000ml，摇匀即成新配制的PBS溶液)冲洗两次，加入200μL左右的0.25％胰酶(预先将0.25％胰酶置于37℃培养箱温浴几分钟以减少对细胞的伤害)。快速的前后旋转细胞瓶以便胰蛋白酶可以覆盖所有细胞，然后置于培养箱中约1min，加速胰蛋白酶的消化。待细胞附着松动，快速的向培养瓶中加入新鲜的10％的FBS细胞生长液，终止胰蛋白酶的作用。用吸管反复吹打细胞瓶底部，使细胞完全从瓶壁上脱离并且分散均匀。吸出细胞悬浮液加入新的细胞瓶中，进行传代。

[0109] 转染前将C2C12细胞接种到24孔板中，待其密度达到80％左右时，采用Lipofectamine 2000试剂(Invitrogen)进行细胞转染，将每孔转染的1μg质粒加入到50μL OPTI-MEM培养基(购自美国Gibco公司)中，吹打均匀；再取2.5μL的Lipofectamine2000和1/20～1/50μg的pRL-TK加入到50μg OPTI-MEM培养基中，混合均匀后室温静置5min。将上述两份混合液混合均匀，室温静置20min。吸管吸出原培养液，用1×PBS清洗细胞两次，并将清洗液吸净。每孔细胞加入混合液100μL后补足OPTI-MEM培养液至总体积为500μg，以前后左右十字交叉的姿势晃动培养板以混合均匀，37℃，5％CO2细胞培养箱培养6h后更换成不含任何抗生素的正常细胞培养基继续培养。

[0110] 本试验以PGL3-basic为阴性对照，以pRL-TK(见图6)做内参质粒(用以校正转TM染效率)，以Lipofectamine 2000做转染试剂，每个缺失片段进行3次重复以校正误差。

[0111] 待C2C12细胞转染48小时后进行细胞收集，用1×PBS清洗细胞两次。用吸管吸干PBS后，每孔加入100μL1×被动裂解缓冲液(Passive Lysis Buffer，4体积的ddH2O加入1体积的PLB原液)。室温下置于摇床温和摇动20min。将细胞裂解液转入灭过菌的1.5mL离心管中，用于测定双荧光素酶的活性。

[0112] 双荧光素酶活性测定采用Promega公司的Dual-Luciferase Assay System进行分析。将所收集的细胞裂解液吸取10μl加入酶标板，放入多功能酶标仪后，首先向每孔内快速加入50μlLARII，读取样品萤火虫荧光素酶的值M1。然后加入50μl Stop&Glo Reagent(终止缓冲剂)，读取内参质粒的海肾荧光素酶的活性值M2。比值M1/M2的大小代表启动子的活性。

[0113] 结果见图7，在C2C12细胞中，所构建的15个启动子均具有启动基因表达的能力。从PGL3-P13缩至PGL3-P14、PGL3-P14时双荧光素酶活性均有所降低，所以初步确定猪ITGB1BP2基因启动子的核心启动区位于1107～1388之间。转染C2C12细胞发现从PGL3-P4到PGL3-P5转染活性显著降低，预示缺失的该部分片段含有正调控元件；PGL3-P5到PGL3-P6的活性显著升高，预示缺失的该部分片段含有负调控元件；从PGL3-P6到PGL3-P7、PGL3-P8、PGL3-P9、PGL3-P10转染活性逐步降低，预示PGL3-P6到PGL3-P10的该部分缺失片段含有多个正调控元件；PGL3-P10到PGL3-P11、PGL3-P12、PGL3-P13的活性逐步升高，预示PGL3-P10到PGL3-P13的该部分缺失片段含有多个负调控元件。