检测雌激素受体α基因上游TA重复序列的试剂盒及检测方法

摘要

本发明公开了检测雌激素受体α基因上游TA重复序列的试剂盒及检测方法，它包括红细胞裂解液、核酸提取液、PCR扩增反应液，酶纯化液，其特征在于：所述PCR扩增反应液包括PCR缓冲液、d NTP、Taq酶、上下游引物TAF/TAR；其中，上下游引物TAF/TAR的序列为：TAF：AACTCGATTTTGGCTTCA；TAR：GATCTTCTCGGTTCACTTG。采用本发明的试剂盒对待检样本中的Erα基因进行扩增，并结合Sanger测序技术，能对人类雌激素受体α基因上游TA重复序列多态性进行检测，特异性好，准确度高。

权利要求

1.检测雌激素受体α基因上游TA重复序列的试剂盒，其特征在于：它包括红细胞裂解液、核酸提取液、PCR扩增反应液，酶纯化液，所述PCR扩增反应液包括：PCR缓冲液10μl、d NTPs1μl、Taq酶0.4μl、上下游引物TAF0.4μl / TAR0.4μl，用纯水补足至18μl；其中，上下游引物TAF/ TAR的序列为：TAF：AACTCGATTTTGGCTTCA

TAR：GATCTTCTCGGTTCACTTG；

所述酶纯化液包括EXOI 0.5μl，CIP 0.1μl，水1.4μl；

所述的红细胞裂解液10×：NH4CL 82mg/ml、NAHCO3 8.4 mg/ml、EDTA-NA2 3.72 mg/ml、DEPC-ddH2O 定容至配制体积；

所述的核酸提取液：Tris 1.2114 mg/ml、Chelex100 50 mg/ml、10%SDS 0.01%。

说明书

检测雌激素受体α基因上游TA重复序列的试剂盒及检测

方法

技术领域

[0001] 本发明属生命科学和生物技术领域，特别是检测雌激素受体α基因上游TA重复序列的试剂盒及检测方法，采用Sanger测序法技术，能对人类雌激素受体a基因上游TA重复序列多态性进行检测，特异性好，准确度高。

背景技术

[0002] 年轻女性月经过少，是妇科常见症状。其危害是影响孕卵在子宫内膜种植，导致反复流产、不孕等，是闭经的前驱症状。雌激素是调节月经的主要激素，但临床上发现一类病人其雌激素水平正常，无内外科及先天性疾病，称为原因不明月经过少。同时，对大量原因不明月经过少患者进行宫腔镜检查发现，月经过少患者中有许多病人的子宫内膜光滑菲薄，表现为生长发育不良。与传统的子宫内膜损伤、疤痕学说并不吻合。此类患者雌激素水平正常，由此我们自然想到是否雌激素受体环节出现障碍?我们的前期实验也证实了原因不明月经过少患者雌激素受体(ER)表达减弱。使我们想到ER α基因改变可能导致雌激素受体（ER）的减少。N ilsson等认为ER基因单核苷酸多态性(single nucleo t idepo lymo rph ism，SN P)可能导致基因的转录、翻译水平失调，导致ERα表达、功能异常。在ERα基因上游有多种多态性位点存在，其中2个限制性酶切片段长度多态性的确切酶切位点已被确定，在内含子1存在PvuII或X baI多态性。而且ERα基因上游1kb存在T(thym ine)，A(aden ine)重复序列，它属于基因的调控区，对基因表达起调控作用。所以我们试图从ERα基因多态性探讨原因不明月经过少的发病机制，为进一步深入研究和治疗提供理论依据。

[0003] 1999年，一位希腊学者研究了雌激素受体基因TA重复序列的变异性与子宫内膜异位症之间的关系，提出其变异性与子宫内膜异位症的病理发生机制有关。2003年，有台湾学者同样做了雌激素受体基因TA重复序列的变异性与子宫肌瘤易患性的研究，提出结论，雌激素受体基因多态性与子宫肌瘤的病理发生机制有关，且TA重复序列的长度多态性与子宫肌瘤的易患性相关，TA重复的12次与13次变异状态为子宫肌瘤的高发状态，而16次TA重复则为相对低的发病风险状态。纵观近年来国内外学者们的研究不难发现，雌激素受体基因的结构功能与疾病相关性逐渐受到关注，尤其是与激素依赖性疾病的关系，及与雌激素受体分布较多的靶器官相关的疾病关系也甚为密切。

[0004] 在临床实验室中，目前检测雌激素受体α基因TA重复序列的常用方法有测序法。

[0005] Sanger测序法。其以自动化、方法简便、分辨率高、测序片段长等优点，成为分子生物学和分子诊断的重要技术平台，并广泛应用于遗传病和肿瘤等方面的检测和诊断。成为技术检测的金标准。

[0006] 但是现有检测雌激素受体α基因上游TA重复序列的引物特异性较差，扩增条带有非特异条带干扰，影响测序结果。

发明内容

[0007] 本发明提供一种引物特异性较好，检测效果好的检测雌激素受体α基因上游TA重复序列的试剂盒。

[0008] 检测雌激素受体α基因上游TA重复序列的试剂盒，包括红细胞裂解液（本公司特有配置试剂，5ml）、核酸提取液（本公司特有配置试剂，2.5ml）、PCR扩增反应液（650μl），酶纯化液，其特征在于：

[0009] 所述PCR扩增反应液包括：PCR缓冲液、（10μl）dNTPs（1μl）、Taq酶（0.4μl）、上游引物TAF0.4μl和下游引物TAR0.4μl；其中，上下游引物TAF/TAR的序列为：

[0010] TAF：AACTCGATTTTGGCTTCA

[0011] TAR：GATCTTCTCGGTTCACTTG。

[0012] 进一步地，所述酶纯化液包括EXOI 0.5μl，CIP 0.1μl，水1.4μl。

[0013] 本发明还提供了用上述试剂盒检测雌激素受体α基因上游TA重复序列的方法，其特征在于包括以下步骤：

[0014] (1)取全血样本，加入红细胞裂解液，裂解红细胞；

[0015] (2)加入核酸提取液，提取核酸；

[0016] (3)加入PCR扩增反应液进行DNA扩增；

[0017] (4)取PCR扩增产物进行琼脂糖电泳，检测是否扩增成功，选取目的条带清晰较亮的进行酶纯化反应；

[0018] (5)采用Sanger测序法对酶纯化产物进行测序，检测出被检样本中雌激素受体α基因上游TA重复序列的重复次数。

[0019] 进一步地，步骤3的扩增反应条件为：95度5分钟；98度10秒、56度20秒、68度30秒、40个循环；68度2分钟。

[0020] 步骤4的酶纯化反应为：取扩增好的PCR产物加入酶纯化液中，反应条件为：37度50分钟，95度5分钟。

[0021] 步骤5测序反应条件为：95度4分钟；95度15秒、50度20秒、60度2分钟、25个循环。

[0022] 本发明将测序技术应用于雌激素受体α基因上游TA重复序列的检测，开发了一种新型的Erα基因上游TA重复序列检测试剂盒。

[0023] 本发明设计了将Erα基因上游TA重复序列包含在内的扩增引物，

[0024]

[0025] 对待检样本中的Erα基因进行扩增，产物扩增长度为471bp，然后采用Sanger测序法对扩增产物进行测序，最后检测出被检样本中雌激素受体α基因上游TA重复序列的重复次数。

[0026] 本发明的有益效果：采用本发明的试剂盒对待检样本中的Erα基因进行扩增，并结合Sanger测序技术，能对人类雌激素受体α基因上游TA重复序列多态性进行检测，特异性好，扩增条带单一，无非特异性条带扩增，测序结果好，准确度高。

附图说明

[0027] 图1为已有方法的旧引物电泳鉴定图。

[0028] 图2为本发明方法的新引物电泳鉴定图。

[0029] 图3为本发明测序图。

具体实施方式

[0030] 实施例1

[0031] 检测雌激素受体α基因上游TA重复序列的试剂盒，包括

[0032] （1）红细胞裂解液10×：（NH4CL 82mg/ml、NAHCO3 8.4mg/ml、EDTA-NA2 3.72mg/ml、DEPC-ddH2O定容至配制体积）

[0033] （2）核酸提取液：（Tris 1.2114mg/ml、Chelex100 50mg/ml、10%SDS 0.01%)、[0034] （3）PCR扩增反应液：包括PCR缓冲液10μl、dNTPs1μl、Taq0.4μl酶、上下游引物TAF/TAR各0.4μl；其中，上下游引物TAF/TAR的序列为：

[0035] TAF：AACTCGATTTTGGCTTCA

[0036] TAR：GATCTTCTCGGTTCACTTG

[0037] （4）酶纯化液：包括EXOI(核酸外切酶)0.5μl，CIP(碱性磷酸酶)0.1μl，水1.4μl。

[0038] 实施例2

[0039] 本发明试剂盒的使用方法：

[0040] （1）核酸提取：取500ul全血，放入到1.5ml的离心管中，加入1ml红细胞裂解液。上下翻转，使完全混匀，旋转脉动15秒后放入离心机中离心，离心速率为5000rpm，10min.。
倒掉上层液，可见离心管底部有血色沉淀。加入500ul红细胞裂解液，重复此裂解步骤一次。离心5000rpm，5min，最后用移液管吸净所有上层液弃去，以使离心管底部的血色沉淀不再残留有裂解液，在沉淀里加入60ul核酸提取液（取之前反复吹打），用枪头混匀，金属浴
100度10分钟，12000rpm，5min，取上清-20度保存待用。

[0041] （2）PCR扩增：PCR扩增体系：2*Buffer 10μl，dNTPs1μl，Taq酶0.4μl，上游引物0.4μl，下游引物0.4μl，纯水5.8μl，加2μl步骤一提取的DNA到18μl扩增体系中，总体积为20μl。反应条件为95度5分钟；98度10秒、56度20秒、68度30秒、40个循环；68度2分钟。

[0042] （3）电泳：取PCR扩增产物3微升进行琼脂糖电泳，检测是否扩增成功，选取目的条带清晰较亮的进行酶纯化反应。

[0043] （4）酶纯化：试剂：EXOI(核酸外切酶)，CIP(碱性磷酸酶)，酶纯化体系为：EXOI0.5μl，CIP 0.1μl，水1.4μl。取9μl扩增好的PCR产物加入到2μl反应体系中，反应条件：37度50分钟，95度5分钟。

[0044] （5）测序反应

[0045] 试剂：Bigdye Terminator V3.1（美国Applied Biosystems公司）

[0046] 每个样本取0.2ml PCR反应管2个，分别标记上下游（双向测序），每管分别加入1μlBigdye Terminator V3.1，1μl水，酶纯化产物2μl，及上游或下游引物1μl，共5μl体系。反应条件为95度4分钟；95度15秒、50度20秒、60度2分钟，25个循环。

[0047] （6）酒精纯化

[0048] 试剂：无水乙醇，75%乙醇EDTA.

[0049] 测序反应结束，打开管盖，每管先加入2μl EDTA，静置5分钟，终止测序反应，随后加入15μl无水乙醇，13500rpm离心30分钟，离心结束倒去液体，并甩干，加入50μl75%乙醇，13500rpm离心15分钟，离心结束倒去液体，甩干，为了避免剩余酒精对后续实验的影响，需烘干。

[0050] （7）上机

[0051] 测序仪：ABI 3100 Genetic Analyzer

[0052] 在烘干的离心管中加入10μl HiDi，振荡混匀，短暂离心收集，将液体全部转移至96空板上上机测序。测序图示例如图1、2所示。图1中已有方法旧引物有非特异条带，图
2中本发明的新引物无非特异条带。

[0053] 实施例3

[0054] 采用本发明试剂盒检测临床标本

[0055] 取全血标本186份，按实施例2所述方法检测雌激素受体a基因上游TA重复序列的重复次数。结果如下表：

[0056]标本例数（总186） TA<14 TA=14 TA>14
第一批对照组30 14 5 11
第二批对照组113 43 25 45
第三批实验组43 21 6 16

[0057] 采用本发明的试剂盒对待检样本中的Erα基因进行扩增，并结合Sanger测序技术，能对人类雌激素受体α基因上游TA重复序列多态性进行检测，特异性好，准确度高，可作为原因不明月经过少及其他一些激素依赖性相关疾病的早期预防、早期诊断的辅助性指标及筛选方法。