利用非暗培养叶片构建棉花BAC文库的方法

摘要

本发明涉及分子生物学领域，本发明具体涉及利用非暗培养叶片构建棉花BAC文库的方法。所述方法包括步骤：1）棉株叶片的选取；2）高分子量细胞核DNA的提取；3）高分子量DNA的部分消化及两次选择；4）大片段DNA的回收、连接及转化；5）插入片段的检测。该方法适用于构建所有棉花材料的BAC文库，包括种子量少或无种子但宿生保存的棉花材料。

权利要求

1.利用非暗培养叶片构建棉花BAC文库的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1）棉株叶片的收集：选用不需要暗处理的棉株的叶片，摘取田间或花盆正常生长、刚平展的幼嫩棉花叶片；

2）提取高分子量细胞核DNA，将细胞核包埋在低熔点琼脂糖中，然后裂解释放核DNA，具体步骤如下：取叶片40g，迅速转入液氮中研磨约1h，然后将粉末转入400mL预冷的Washbuffer，配方为：0.08M KCl，0.01M Trizma base，0.01M EDTA Na2，1mM Spermidine，1mM Spermine，

0.5M Sucrose，2%PVP40，0.13%DIECA，0.15%β–巯基乙醇和0.5%TritonX-100，冰上轻轻搅拌15-20min，用两层纱布和2层微细滤布过滤到预冷的50mL离心管中，4℃、3200rpm、离心

20min，去除上清，如果此次离心沉淀时还有一些绿色沉淀，用毛刷将表层的绿色沉淀轻轻刷出，然后用Wash buffer对沉淀再次悬浮，并且降低离心速度，去除绿色沉淀；

向沉淀中加入500μL1×HB，配方为：0.08M KCl，0.01M Trizma base，0.01MEDTA Na2，

1mM Spermidine，1mM Spermine，0.5M Sucrose，2%PVP40，0.13%DIECA，0.15%β–巯基乙醇，悬浮沉淀，合并各离心管的悬浮液于一个离心管中，向离心管中加满1×HB混匀，4℃、

4000rpm、离心15min，用1×HB重复此步骤3次，最后在沉淀中加入不含β–巯基乙醇的

1×HB调整细胞核的浓度，将细胞核悬浮液和1.5%的低熔点琼脂糖于45℃水浴5min，然后两者等体积混匀，45℃水浴5min，迅速将混合液加入plug mold中，冰上冷却30min，待其充分凝固后，将胶块放入含有蛋白酶K的裂解液中，蛋白酶K的浓度为1mg/mL，在50℃杂交炉中裂解36h，中间换一次裂解液，去除裂解液，加入含浓度PMSF的50mL预冷的T10E10，其中PMSF的浓度为1mM，T10E10的配方为10mM Tris-HCl、10mM EDTA，冰上轻轻震荡2次，每次1h，再将胶块放在不含PMSF的T10E1中冰上清洗4次，其中，T10E1的配方为10mM Tris-HCl、1mM EDTA，每次1h，随后将胶块置于T10E1中，4℃保存备用；

3）高分子量核DNA的酶切及两次选择，采用脉冲场凝胶电泳分离，

对于第一次选择：脉冲的起始时间10s，第一次选择中，脉冲条件为：1%琼脂糖，

0.5×TBE缓冲液，11℃，泵70，角度120°，6v/cm，10s-50s，18h，选出120～300kb的DNA片段，分成120～200kb和200～300kb两个范围进行第二次选择，对于第二次选择：起始和终止时间分别为4s-4s，第二次选择中，脉冲条件为：1%琼脂糖，0.5×TBE缓冲液，11℃，泵70，角度120°，6V/cm，电泳时间14h，选出120～200kb和

200～300kb的DNA片段；

4）分别对存在于胶块中的120～200kb，200～300kbDNA进行回收，与载体连接，然后转化感受态细胞；

5）检测阳性克隆的插入片段是否满足实验需要。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤3）中，第二次选择中，使用普通琼脂糖凝胶进行脉冲电泳。

说明书

利用非暗培养叶片构建棉花BAC文库的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及分子生物学领域，本发明具体涉及利用非暗培养叶片构建棉花BAC文库的方法。

背景技术

[0002] 目前，所构建的棉花细菌人工染色体(Bacterial artificial chromosome,BAC)文库大多是栽培种，且所选材料都为棉花种子催芽后暗培养得到的黄化苗子叶。暗培养处理可大大减少了叶绿体及酚类物质的生成，降低了其在DNA提取过程中的影响且使细胞易于破裂，用暗培养的幼苗比较容易获得较纯的DNA。然而，传统的棉花BAC文库构建方法取材范围较窄，而且需要对材料进行暗培养处理，操作复杂、费时；构建BAC文库对材料的需求量大，一般需要大于40g，传统的棉花BAC文库构建方法用种量大，很难用于种壳较硬，发芽较难的材料，不能用于种子量少或是没有种子的棉花材料BAC文库构建。

[0003] 为了简化BAC文库构建方法，并且使此方法适合任何棉花BAC文库的构建，较为有效的方法是选用不需要暗处理的现有棉株叶片作为构建BAC文库的材料，这样既节省了种子，又避免了发芽及暗培养操作，还可以用于种子量少的材料或没有种子的野生棉BAC文库的构建。本发明的发明人发现，选用不需要暗处理的棉株叶片为材料，对BAC文库构建过程中的某些环节进行改进，也可以成功构建棉花BAC文库。

发明内容

[0004] 本发明的发明人长期探索棉花BAC文库构建方法，选用不需要暗处理的棉株的叶片，对BAC文库构建过程中的细胞核DNA的提取、酶切片段的两次选择进行了一些改进，形成了一套成熟的棉花BAC文库构建技术体系。该方法适用于所有棉花材料的BAC文库的构建，包括繁殖种子量少或无种子宿生保存的棉花材料的BAC文库的构建，即利用非暗培养棉株叶片构建BAC文库的方法。

[0005] 因此，本发明的目的是提供利用非暗培养棉株叶片构建BAC文库的方法。根据本发明的方法，包括以下步骤：

[0006] 1）棉株叶片的收集：摘取田间或花盆正常生长、刚平展的幼嫩棉花叶片；

[0007] 2）提取高分子量细胞核DNA，将细胞核包埋在低熔点琼脂糖中，然后裂解释放核DNA；

[0008] 3）高分子量核DNA的酶切及两次选择，采用脉冲场凝胶电泳分离，[0009] 对于第一次选择：脉冲的起始时间10s，选出120～300kb的DNA片段，分成120～200kb和200～300kb两个范围进行第二次选择，

[0010] 对于第二次选择：起始和终止时间分别为4s-4s，电泳时间14h，选出120～200kb和200～300kb的DNA片段；

[0011] 4）分别对存在于胶块中的120～200kb，200～300kb DNA进行回收，与载体连接，然后转化感受态细胞；

[0012] 5）检测阳性克隆的插入片段是否满足实验需要。

[0013] 根据本发明的具体实施方式，所述方法包括步骤如下：

[0014] 1）棉株叶片的选取：选取田间或花盆生长正常、无病、无虫害的幼嫩叶片。

[0015] 2）高分子量细胞核DNA的提取：采用一种能尽可能去除叶绿体、线粒体以及防止酚类氧化的细胞核提取方法，提取完整的细胞核，将细胞核包埋在低熔点琼脂糖中形成胶块防止核DNA的机械断裂。将胶块置于裂解液中于50℃下将细胞核裂解，使核DNA释放出来。

[0016] 3）高分子量DNA的部分酶切及两次选择：构建BAC文库所需要的是120～300kb范围内的DNA，需要将完整的细胞核DNA进行酶切，根据本发明的具体实施例，所用的限制性内切酶为HindIII，采用一系列的酶浓度来确定最适的酶切浓度，选取酶切后大部分DNA片段集中到120～300kb的酶浓度为最适酶浓度，以此最适酶浓度对所有胶块进行大量酶切；

[0017] 为了使插入片段整齐一致，对酶切后的DNA采用两次选择，采用脉冲场凝胶电泳这一技术来分离大片段。第一次选择选出120～300kb的DNA，分成120～200kb，200～300kb两个范围进行第二次选择。

[0018] 4）大片段DNA的回收、连接及转化：采用一种对DNA分子粘性末端破坏程度较小的电洗脱的方法分别对存在于胶块中的120～200kb，200～300kbDNA进行回收；通过设置多种DNA和载体的连接比例来确定最适连接摩尔比，然后以最适连接摩尔比进连接；连接产物采用一种转化效率高的电转化方法转化感受态细胞。

[0019] 5）插入片段的检测：随机挑取阳性克隆，采用碱裂解法提取质粒，检测阳性克隆的插入片段的大小及有无。

[0020] 与传统BAC文库构建方法相比，本发明具以下优点：

[0021] 1）避免了传统BAC文库构建过程中利用种子发芽进行暗培养处理来获取大量黄化苗子叶这一复杂步骤。

[0022] 2）首次利用非暗培养的成株叶片进行棉花BAC文库构建，避免了大量发芽，使得材料的获取简单易行。

[0023] 3）利用非暗培养的成株叶片作为实验材料，对于有种子的棉花材料而言所需种子量减小；对于没有种子的棉花材料而言就不需要用种子了，只要棉花植株即可。

[0024] 4）从取材方面来看，利用成株叶片构建BAC文库，解决了某些野生棉发芽困难的问题，使无种子或种子量少的材料构建BAC文库成为可能。

[0025] 5）在传统BAC文库构建方法基础上进行改进，扩大了BAC文库构建的材料来源，该法可适用于所有棉花材料，包括栽培棉和野生棉，也包括栽培棉的无毒棉（低酚棉）类型。

[0026] 6）BAC文库构建过程中，对第一次选择这一环节的时间进行了改进，即将之前使用的起始脉冲时间50s改为了10s，结果回收到了以前实验过程中期望得到，但是一直没有得到的100～200kb范围内的DNA片段，回收到的片段很集中（图4），大大提高了转化效率。

[0027] 7）BAC文库构建过程中，对第二次选择时凝胶的选取进行了改进：将之前在低熔点琼脂糖凝胶中进行，改为在普通琼脂糖中进行，通过下一步电洗脱过程中适当延长洗脱时间可对DNA进行了较好的回收。这一改进大大简化了实验步骤，节省了实验费用。

附图说明

[0028] 图1：非暗培养毛棉成株叶片细胞核包埋制备的胶块。

[0029] 图2：大片段DNA的质量检测。M：PFGE Marker；2-8泳道为将胶块切成1/2、1/4、1/8胶块中的DNA。

[0030] 图3：大片段DNA最适酶用量的确定。M：PFGE Marker；2-7泳道为1/2plug分别用0.4U、0.8U、1.2U、3U、4U、5U的酶切结果。

[0031] 图4-1：脉冲时间改进前后两次选择对比，改进前的两次选择：其中，A为DNA酶切后第一次选择，B为第二次选择，第一次选择脉冲电泳条件为：起始时间50s，终止时间50s；第二次选择脉冲电泳条件为：起始时间4s，终止时间4s。

[0032] 图4-2：脉冲时间改进前后两次选择对比，改进后的两次选择：其中，A为DNA酶切后第一次选择，B为第二次选择。第一次选择脉冲电泳条件为：起始时间10s，终止时间50s；第二次选择脉冲电泳条件与改进前相同。

[0033] 图5：电洗脱回收的大片段DNA浓度估测。1-9泳道为λDNA，数字代表λDNA的浓度（ng/μL）；10和11泳道为回收的120-200kb的待测DNA。

[0034] 图6：120～200kb DNA片段连接产物转化结果。

[0035] 图7：BAC克隆插入片段大小检测。1-14泳道为BAC单克隆；15-16为混合克隆的NotI酶切结果。

具体实施方式

[0036] 实施例1利用毛棉非暗培养成株叶片构建BAC文库

[0037] 1．毛棉成株材料的选取：

[0038] 选取大田生长正常、无病、无虫害的非暗培养幼嫩叶片作为实验材料。

[0039] 2．高分子量细胞核DNA的提取：

[0040] 取叶片40g，迅速转入液氮中研磨约1h，然后将粉末转入400mL预冷的Washbuffer（0.08M KCl，0.01M Trizma base，0.01M EDTANa2，1mM Spermidine，1mMSpermine，0.5M Sucrose，2%PVP40，0.13%DIECA，0.15%β–巯基乙醇和0.5%TritonX-100）中，冰上轻轻搅拌15-20min，用两层纱布和2层微细滤布过滤到预冷的50mL离心管中，4℃、3200rpm、离心20min，去除上清。如果此次离心沉淀时还有一些绿色沉淀，可用毛刷将表层的绿色沉淀轻轻刷出，然后用Wash buffer对沉淀再次悬浮，并且适当地降低离心速度，就可去除绿色沉淀。

[0041] 向沉淀中加入500μL1×HB（只是不含0.5%TritonX-100，其他配方与Washbuffer相同），用小毛刷轻轻悬浮沉淀，合并各离心管的悬浮液于一个离心管中，向离心管中加满1×HB混匀，4℃、4000rpm、离心15min，用1×HB重复此步骤3次，最后在沉淀中加入适量的
1×HB（不含β-巯基乙醇）调整细胞核的浓度。将细胞核悬浮液和1.5%的低熔点琼脂糖于45℃水浴5min，然后两者等体积混匀，45℃水浴5min，迅速将混合液加入plug mold中，冰上冷却30min，待其充分凝固后，将胶块放入含有蛋白酶K（1mg/mL）的裂解液中，在50℃杂交炉中裂解36h，中间换一次裂解液。去除裂解液，加入含PMSF（1mM）的50mL预冷的T10E10(10mM Tris-HCl、10mM EDTA)，冰上轻轻震荡2次，每次1h，再将胶块放在不含PMSF的T10E1(10mMTris-HCl、1mM EDTA)中冰上清洗4次，每次1h，随后将胶块置于T10E1中，4℃保存备用。

[0042] 随机挑取两个胶块进行脉冲电泳，检测胶块质量。脉冲电泳条件为1%琼脂糖，0.5×TBE缓冲液，11℃，泵70，角度120°，6v/cm，50s-50s，18h。

[0043] 此法以非暗培养成株叶片为材料，采用细胞核包埋法来制备胶块，虽然胶块颜色发褐，可能有部分酚类物质的氧化（图1），然而经脉冲场凝胶电泳检测，大片段DNA较为集中且主带明显，DNA发生降解或机械断裂较少(图2)，这说明提取的DNA能够满足后面实验的需要，酚类物质的存在对提取高分子量的细胞核DNA几乎无影响。

[0044] 3．部分酶切最佳酶量的确定

[0045] 如果胶块已放置了较长时间，在部分酶切前应先进行预电泳以除去一些小片段，预电泳条件为：电压6V/cm，5s-5s，4h，然后进行部分酶切，所用的限制性内切酶为HindIII。把一个胶块平分为2块，放入HindIII酶切缓冲液(1×HindIII buffer，2mMspermidine，0.1mg/mL BSA)中，冰上轻摇1h，更换一次酶切缓冲液，继续摇1h，再把小胶块切成大小相同的4块，每4小块为一个反应，加入酶量分别为0.4U、0.6U、1.2U、2.4U、
3.6U、4.8U的内切酶，冰上轻摇1h，37℃酶切30min，脉冲电泳检测，脉冲电泳条件：1%琼脂糖，0.5×TBE缓冲液，11℃，泵70，角度120°，6v/cm，10s-50s，18h。根据所得到的最适酶量，进行大量酶切。

[0046] 如图3所示，每1/2胶块的酶用量为1.2U时，酶切片段集中在100～300kb之间，因此，确定酶浓度1.2U为最适酶用量。

[0047] 4大片段DNA的两次选择与回收

[0048] 大量酶切后的DNA经第一次选择后，以marker为对照，分别切下120～200kb，200～300kb范围的胶块，将切下的胶块分别放入合适大小的胶孔中进行第二次选择，电泳结束后切下两边含部分DNA样品的胶块进行溴化乙啶染色，以染色的部分DNA样品条带所在位置为对照，从未染色的凝胶中切下目的片段并回收。

[0049] 第一次选择脉冲电泳条件：改进前的起始时间50s，改进后为10s，其他条件同部分酶切的电泳条件。第二次选择的脉冲电泳条件为：起始和终止时间分别为4s-4s，电泳时间14h，其他条件同部分酶切的电泳条件。采用电洗脱方法回收胶块中的大片段DNA，以未酶切的已知浓度的λDNA浓度梯度为对照，用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测回收的大片段DNA的浓度。

[0050] 如图4-1中“B”所示为起始脉冲时间改进前的结果图，第二次选择后200～300kb、300～400kb的DNA片段会更加集中，然而100～200kb这部分DNA片段拖尾严重，没有主带，所以没法进行切胶回收。片段越小转化效率越高，与其他两个范围DNA相比，100～
200kb这部分DNA片段转化效率较高，是我们希望得到的。

[0051] 如图4-2中“B”所示为起始脉冲时间改进后的结果图，第二次选择后200～300kb、300～400kb的DNA片段也会很集中。而且100～200kb的DNA片段也很集中，主带明显，可以进行切胶回收。说明脉冲时间的改变对会影响100～200kb这部分DNA片段的回收，经后续步骤检测后发现这部分片段转化后插入片段大小能满足实验需要，这一改进大大提高了转化效率，节省了实验时间且降低了实验费用。

[0052] 本发明对BAC文库构建过程的大片段DNA第二次选择时，凝胶的选取进行了改进：之前的实验过程中第二次选择是在低熔点琼脂糖凝胶中进行，因为低熔点琼脂糖筛孔相对较大，利于DNA的回收，然而其价格较贵，凝胶时间过长，一般需要过夜凝固，胶凝固后过于柔软。操作中我们需要进行切胶、胶块回收、染色、完整凝胶的拼接、凝胶照相等步骤，凝胶柔软且容易断裂，不仅操作复杂麻烦有时会造成凝胶中DNA的丢失。因此本次实验用普通琼脂糖代替了低熔点琼脂糖，虽然普通琼脂糖糖凝胶筛孔较小，但是可以在下一步的电洗脱过程中适当延长洗脱时间对DNA进行了较好的回收，用已知浓度的λDNA为对照，用0.8%琼脂糖胶估计待测DNA的浓度（图5），DNA浓度与5和6泳道亮度相当，估测其浓度为5.5ng/μL，完全满足实验的需要。这一改进大大降低了实验操作的困难性也降低了实验费用。

[0053] 5.大片段DNA的连接与转化

[0054] 根据测得的回收片段的浓度，将其与pIndigoBAC-5载体按照插入片段与载体的摩尔比为1:6，1:9，1:10，1:12的比例进行连接。载体与大片段DNA混匀后于55℃水浴10min，然后4℃冷却约15min，加入10×T4DNA连接酶缓冲液、T4DNA连接酶及ATP(1mM)，
16℃连接16h，最后65℃水浴20min，灭活酶活性。连接产物用0.025μm的滤膜悬浮在ddH20中冰上脱盐2h，然后悬浮在30%PEG8000（T10E1配制）中冰上浓缩1h。取2.5μL连接产物加入到18-20μL DH10B感受态细胞中进行电转化，电压360V。转化产物转移到1mL SOC培养基中，37℃、225r/min复苏1h，培养液涂布在含有12.5μg/mL氯霉素、60μg/mL X-gal和
14μg/mL IPTG的LB平板上，37℃避光培养16h。

[0055] 实验中发现对连接产物进行脱盐浓缩这一步很重要，与不进行浓缩和脱盐的连接产物相比能有效地提高转化效率和减少假阳性。

[0056] 对于浓缩后的连接产物，需要尽快转化以免降低转化效率，转化后每200μLSOC复苏液涂一个培养皿(d=12cm)。120-200kb的片段1次转化2.5μL连接产物可得到6000个左右的克隆（图6），重组率大于96%，而200～300kb的DNA只能得到800个左右的克隆。这说明片段越大，连接转化效率越低。

[0057] 6插入片段的检测

[0058] 从LB平板中随机挑取白色单菌落接种到含12.5μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，过夜培养20h。采用碱裂解法提取质粒，NotI酶切，脉冲电泳检测插入片段的有无及大小，电泳条件：1%琼脂糖，11℃，5s-15s，0.5×TBE，120°，6V/cm，16h。当确定插入片段适合构建BAC文库时，立即进行大量转化。用灭菌的牙签挑取单克隆，接种到含冷冻培养基的384孔板中，37℃过夜培养，于-80℃保存。

[0059] 在本实施例所构建的BAC文库中，随机挑取一定量的单克隆提取质粒，NotI酶切检测插入片段的大小及有无，检测结果显示（图7）：插入片段大多数集中在100-150kb，空载率小于4%。