一种紫外光谱法测定三聚氰胺含量的方法

摘要

本发明公开一种紫外光谱法测定三聚氰胺含量的方法，步骤：配制pH值4~10Tris-HCl缓冲溶液；用Tris-HCl配制0~10μg/L的三聚氰胺溶液、1.0×10-5~1.5×10-4mol/LDNA溶液，以及三聚氰胺与DNA的混合溶液，以试剂空白为参比,测定各溶液的吸光度；以三聚氰胺浓度为横坐标、以DNA的吸光度与三聚氰胺与DNA的混合溶液吸光度差值为纵坐标建立工作曲线；将三聚氰胺待测液加入DNA溶液中，测吸光度，根据工作曲线计算三聚氰胺浓度换算出待测液中三聚氰胺相应含量。该方法采用基于三聚氰胺与脱氧核糖核酸相互作用而建立紫外光谱检测技术，方法准确，简单方便，具有可重复性。

权利要求

1.一种紫外光谱法测定三聚氰胺含量的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：

（1）配制pH值4～10的三羟甲基氨基甲烷-HCl缓冲溶液；

（2）用步骤（1）配制的三羟甲基氨基甲烷-HCl缓冲溶液分别配制浓度范围为0～-5 -4

10μg/L的三聚氰胺溶液、浓度范围为1.0×10 mol/L～1.5×10 mol/L的DNA溶液，以及三聚氰胺与DNA的混合溶液,摇匀,放置2～30min,以试剂空白即步骤（1）配制的三羟甲基氨基甲烷-HCl缓冲溶液为参比,在200～500nm波长范围扫描紫外光谱，测定各溶液在260nm的吸光度；

（3）以三聚氰胺溶液的浓度为横坐标、以不加三聚氰胺时DNA在260nm的吸光度即DNA溶液在260nm的吸光度与三聚氰胺与DNA的混合溶液在260nm的吸光度的差值为纵坐标，建立工作曲线；

（4）将三聚氰胺待测提取液加入与上述步骤（2）配置的浓度相同的DNA溶液中，测定体系在260nm的吸光度，根据工作曲线计算待测液中三聚氰胺的浓度，换算出待测提取液中三聚氰胺的相应含量；所述的DNA为鲱鱼精DNA、小牛胸腺DNA的任意一种。

2.根据权利要求1所述的一种紫外光谱法测定三聚氰胺含量的方法，其特征在于：步骤（1）所述的三羟甲基氨基甲烷-HCl缓冲溶液中三羟甲基氨基甲烷的浓度为0.05mol/L。

说明书

一种紫外光谱法测定三聚氰胺含量的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种光谱法测定三聚氰胺的分析方法。特别是基于三聚氰胺与脱氧核糖核酸(DNA)相互作用而建立的简单、快捷、准确的紫外光谱法测定三聚氰胺含量的方法。

背景技术

[0002] 三聚氰胺(Melamine,以下简称MM，分子式C6H6N6是一种用途广泛的化工原料，分子中含氮量达66.6％。一些不法企业将其添加到牛奶、奶制品、饲料中，造成粗蛋白质虚高的假相，不仅对奶制品、养殖业等产业产生不利影响，对人类健康也存在着严重威胁。虽然2008年9月发生的令人震惊的“三聚氰胺”事件在国家相关部门的高度重视下，应急处理工作已告一段落，但有关三聚氰胺的检测技术的研究一直是近年来的热点话题。

[0003] 研究和建立测定食品、乳制品及组织样品中的三聚氰胺含量的高灵敏度、快速简便的方法具有十分重要的意义。目前关于三聚氰胺的测定方法有GC-MS,HPLC,LC-MS,毛细管电动色谱等，这些方法中有的需要比较复杂的样品预处理，操作繁琐，有的方法检测灵敏度比较低（通常的检测灵敏度在10.9μg/kg~0.25mg/kg之间），难以满足日常的快速检测。

发明内容

[0004] 本发明针对现有技术的不足，提供一种准确有效测定，并且可靠、快速、操作简单的紫外光谱法测定三聚氰胺含量的方法。

[0005] 为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种紫外光谱法测定三聚氰胺含量的方法，该方法包括以下步骤：

[0006] （1）配制pH值4~10的三羟甲基氨基甲烷(Tris)-HCl缓冲溶液；

[0007] （2）用步骤（1）配制的Tris-HCl缓冲溶液分别配制浓度范围为0~10μgL的三聚-5 -4氰胺溶液、浓度范围为1.0×10 mol/L~1.5×10 mol/L的DNA溶液，以及三聚氰胺与DNA的混合溶液,摇匀,放置2~30min,以试剂空白（即步骤（1）配制的Tris-HCl缓冲溶液）为参比,在200~500nm波长范围扫描紫外光谱，测定各溶液的吸光度（A）；

[0008] （3）以三聚氰胺溶液的浓度为横坐标、以不加三聚氰胺时DNA的吸光度即DNA溶液的吸光度与三聚氰胺与DNA的混合溶液的吸光度的差值（ΔA）为纵坐标，建立工作曲线；

[0009] （4）将三聚氰胺待测提取液加入上述步骤（2）浓度相同的DNA溶液（此处的DNA溶液具体指的是与步骤（2）中配置的DNA溶液浓度相同的溶液，确保与标准曲线建立时用的DNA浓度一致即可）中，测定体系的吸光度，根据工作曲线计算待测液中三聚氰胺的浓度，换算出待测提取液中三聚氰胺的相应含量。

[0010] 其中，所述DNA为鲱鱼精DNA、小牛胸腺DNA（均为市售产品）的任意一种，其纯度通过比较260nm和280nm处的吸光度来确定(A260/A280＝1.8～1.9/1)，用pH＝7.00的Tris(0.05mol/L)-HCl缓冲溶液配制成DNA溶液，浓度通过测定260nm处的吸光度计算而得-1 -1(ε=6600L·mol ·cm )，储备液置于4℃保存。

[0011] 进一步，本发明所述DNA的使用浓度范围为：1.0×10-5mol/L~1.5×10-4mol/L（此处DNA的使用浓度即是指加入缓冲液后DNA在溶液中的浓度，同理，三聚氰胺和三聚氰胺与DNA混合溶液均为配制后最终浓度）；三聚氰胺的检测线性范围为：0-2.0μg/L，方法检测限为0.056μg/kg。

[0012] 上述步骤（1）中三羟甲基氨基甲烷在缓冲液中的浓度优选为0.05mol/L，配置的pH优选＝7.00。

[0013] 上述步骤（2）所述三聚氰胺与DNA的混合溶液是指：在步骤（1）配置的三羟甲基氨基甲烷(Tris)-HCl缓冲溶液中加入DNA和三聚氰胺，使得配制后的混合溶液中三聚氰胺-5 -4的浓度为0~10μgL、DNA的浓度为1.0×10 mol/L~1.5×10 mol/L。本发明的优点和有益技术效果为：

[0014] 本发明的三聚氰胺与脱氧核糖核酸(DNA)会发生相互作用，并使得DNA在～260nm处的特征吸收峰位置出现小的红移(～2nm)和减色效应(吸光度A减小～0.05，～10%)，且其减色效应与三聚氰胺浓度符合朗伯-比尔定律，因此，通过紫外光谱法可以实现三聚氰胺的含量准确有效测定，并且可靠、快速、操作简单。

附图说明

[0015] 图1是本发明三聚氰胺与DNA之间的相互作用的紫外光谱图。如图所示：（1）-5 -7DNA(c(DNA) ＝6.4×10 mol/L),(2)MM-DNA(c(MM) ＝ 6.7×10 mol/L),(3)MM-DNA(c(MM)-6 -6
＝ 3.3×10 mol/L),(4)MM-DNA(c(MM) ＝ 6.7×10 mol/L),(5)MM-DNA(c(MM) ＝-5 -5 -4
1.0×10 mol/L),(6)MM-DNA(c(MM)＝1.3×10 mol/L),(7)c(MM)＝1.00×10 mol/L,(8)-5 -5
MM+DNA(c(MM)＝1.00×10 mol/L,c(DNA)＝6.7×10 mol/L)理论值)。

[0016] 图2是本发明以三聚氰胺的浓度与吸光度的差值（ΔA）的建立的工作曲线。

具体实施方式

[0017] 下面根据本发明的具体实施例详细说明本发明，本发明的目的和效果将更加明显。

[0018] 实施例1：

[0019] 三聚氰胺与DNA相互作用的方法建立

[0020] （1）用pH＝7.00的Tris(0.05mol/L)-HCl缓冲溶液分别配制MM溶液,DNA溶液,DNA-MM的混合溶液,摇匀,放置20min,以试剂空白为参比,扫描电子吸收光谱（即紫外光谱）；

[0021] （2）在1cm比色皿中,加入3.00mL DNA溶液，通过滴定法扫描电子吸收光谱或测定吸光度，每次滴加MM 10μL,可忽略体积效应。

[0022] （3）测定pH＝7.00的Tris(0.05mol/L)-HCl缓冲溶液中加入MM前后DNA的电子光谱，见附图1。MM溶液滴加到DNA溶液中后，观察到DNA在～260nm处的特征吸收峰位置出现小的红移(～2nm)和减色效应(吸光度A减小～0.05，～10%)，且DNA-MM体系的吸光度小于同浓度DNA与MM吸光度的理论值加和值(附图1(1)DNA,(5)MM-DNA实验结果和(8)理论值加和结果)，说明测得的MM-DNA吸收曲线并非为MM和DNA紫外-可见光谱的简单加和，而是二者之间发生了一定的相互作用。

[0023] （4）固定DNA浓度,改变MM浓度,在260nm处测定吸光度。根据双倒数公式：1/(A0-A)＝1/A0＋1/[K×A0×c(MM)](式中A0和A分别为加入MM前后体系的吸光度,K为5 -1
结合常数),以1/(A0-A)～1/c(MM)作图,计算得到结合常数K＝1.02×10L·mol ，比以经典的嵌插作用与DNA结合的溴化乙啶、道诺霉素低1~2个数量级，说明MM可能通过氢键与DNA沟槽结合方式作用。

[0024] 实施例2：

[0025] 紫外光谱法测定三聚氰胺的方法建立

[0026] 在3.00mL浓度为6.4×10-5mol/L的DNA溶液中加入一系列三聚氰胺溶液使三聚氰胺的浓度为0.084~1.68μg/L。测定加入三聚氰胺前后DNA溶液在260nm的吸光度。数据列于表1。以三聚氰胺的浓度为横坐标、以不加三聚氰胺时DNA的吸光度与加入一定浓度三聚氰胺的DNA溶液的吸光度的差值（ΔA）为纵坐标，建立工作曲线。结果列于附图2。从结果可知，ΔA与三聚氰胺浓度符合朗伯-比尔定律，在0.084~1.68μg/L浓度范围内呈现良好的线性关系；根据国际IUPCA的定义：检出限为CDL=3SB/k，其中SB为空白标准偏差，平行测定11次，k为标准曲线斜率，计算得到方法检出限为0.056μg/kg。本方法简单、快捷、准确。

[0027] 表1紫外光谱法测定三聚氰胺的标准曲线

[0028]编号 CMM(μg/L) A ΔA
1 0.00 0.42175 0
2 0.084 0.41871 0.00304
3 0.168 0.41649 0.00526
4 0.252 0.41412 0.00763
5 0.336 0.41258 0.00917
6 0.42 0.41041 0.01134
7 0.504 0.41002 0.01173
8 0.588 0.40707 0.01468
9 0.672 0.40669 0.01506
10 0.756 0.4061 0.01565
11 0.84 0.40391 0.01784
12 0.924 0.40197 0.01978
13 1.008 0.39981 0.02194
14 1.092 0.39855 0.02320
15 1.176 0.39802 0.02373
16 1.26 0.39588 0.02587
17 1.344 0.39373 0.02802
18 1.428 0.39263 0.02912
19 1.512 0.39054 0.03121
20 1.596 0.39037 0.03138
21 1.68 0.38908 0.03267

[0029]

[0030] 实施例3：

[0031] 饲料样品中三聚氰胺残留的检测

[0032] 准确称取5g饲料于50mL离心管中。加入20mL二甲亚砜（DMSO），振荡1小时，离心取上1mL清液，用Tris(0.05mol/L)-HCl缓冲溶液配制稀释至10mL备用。取50.00μL-5上述溶液于3.00mL DNA溶液（浓度为6.4×10 mol/L的DNA溶液）中，摇匀，静止20分钟，测其在260nm的吸光度。根据所建立的标准曲线，计算样品中三聚氰胺残留含量。所测5种饲料样品中三聚氰胺残留量及其与农业部饲料中的三聚氰胺的测定（NY1372-2007）方法（该标准中HPLC法最低定量限为2.0mg/kg，GC-MS法最低定量限为0.05mg/kg）的比较列于表2。

[0033] 表2饲料样品中三聚氰胺残留量测定结果

[0034]样品编号 本专利方法(mg/kg) NY1372-2007方法(mg/kg)
1 0.072 0.068（GC法）
2 0.005 未检出
3 0.012 未检出
4 未检出 未检出
5 未检出 未检出

[0035] 实施例4：

[0036] 奶、蛋白粉及其制品中三聚氰胺残留的检测

[0037] 准确称取奶粉（或蛋白粉、豆粉、米粉、面粉，或鲜奶、酸奶、乳饮料或蛋白饮料）5g于50mL离心管中。加入20mL 0.3%的三氟乙酸水溶液；超声提取20min。在此提取液中加入5mL乙酸锌（220g/L）与5mL亚铁氰化钾溶液（106gL）,振荡20分钟，离心取上1mL清液，用Tris(0.05mol/L)-HCl缓冲溶液配制稀释至10mL备用。取50.00μL上述溶液于3.00mL -5DNA溶液（浓度为6.4×10 mol/L的DNA溶液）中，摇匀，静止20分钟，测其在260nm的吸光度。根据所建立的标准曲线，计算样品中三聚氰胺残留含量。所测5中饲料样品中三聚氰胺残留量及其与国家标准：原料乳中三聚氰胺快速检测液相色谱法（GB/T 22400-2008）方法（该标准定量检测范围为0.30mg/kg～100.0mg/kg，方法检测限为0.05mg/kg）的比较列于表3。

[0038] 表3奶、蛋白粉及其制品中三聚氰胺残留量测定结果

[0039]样品编号 本专利方法(mg/kg) GB/T 22400-2008方法(mg/kg)
1 0.090 0.088
2 0.095 0.092
3 0.012 未检出
4 0.008 未检出
5 未检出 未检出

[0040] 上述实施例用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。