一种用于防治缺血再灌注损伤的组合物

摘要

本发明公开了一种用于防治缺血再灌注损伤的组合物，该组合物，是将促红细胞生成素（EPO）与硒按照EPO︰硒=1万IU︰28.5~7310.6μg的比例组合。EPO的器官保护作用和硒的抗氧化作用是EPO和硒二者组方合理性的基础。该复方组合对缺血再灌注损伤具有协同保护作用，体现在肾脏方面为降低血浆BUN水平，减轻肾小管损伤，改善肾脏病理性变化；其中EPO的作用更明显，是主药；亚硒酸钠作用较EPO小，是辅药；二者合用的疗效明显优于EPO或亚硒酸钠单用。

权利要求

1.一种用于防治缺血再灌注损伤的组合物，其特征在于，是将EPO与硒按照EPO︰硒=1万IU︰28.5～7310.6μg的比例组合。

2.如权利要求1所述的用于防治缺血再灌注损伤的组合物，其特征在于，EPO与硒按照EPO∶硒=1万IU︰400～500μg的比例组合。

3.如权利要求1所述的防治缺血再灌注损伤的药物组合物，其特征在于，所述的硒是以亚硒酸盐或硒代硫酸盐的形式与EPO进行组合。

4.如权利要求3所述的防治缺血再灌注损伤的药物组合物，其特征在于，所述的亚硒酸盐为亚硒酸钠或亚硒酸氢钠，所述的硒代硫酸盐为硒代硫酸钠。

5.如权利要求1所述的防治缺血再灌注损伤的药物组合物，其特征在于，所述的硒是以亚硒酸钠的形式与EPO进行组合，EPO与亚硒酸钠的组合比例为EPO︰亚硒酸钠=1万IU︰1000μg。

6.一种用于防治缺血再灌注损伤的注射液，其特征在于，在100mL注射液中包括30～

100万IU的EPO、30～100mg的亚硒酸钠、0.5～2g人血白蛋白、0.2～0.6g氯化钠、10～

50mmol/L枸橼酸盐缓冲液；pH为6.0～7.0。

7.如权利要求6所述的防治缺血再灌注损伤的注射液，其特征在于，在100mL注射液中包括100万IU的EPO、100mg的亚硒酸钠、1g人血白蛋白、0.4g氯化钠、10～50mmol/L枸橼酸盐缓冲液。

8.一种防治缺血再灌注损伤的注射液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将

30～100万IU的EPO用10～50mmol/L枸橼酸盐缓冲液溶解，再加入30～100mg亚硒酸钠，搅拌溶解，然后加入0.5～2g人血白蛋白和0.2～0.6g氯化钠，充分搅拌混匀，调整体积至100mL，并调节pH至6.0～7.0，过滤除菌，最后灌封。

9.权利要求1所述的防治缺血再灌注损伤的组合物用于预防或治疗肾缺血再灌注损伤的药物的制备的应用。

说明书

一种用于防治缺血再灌注损伤的组合物

技术领域

[0001] 本发明属于医药技术领域，涉及一种用于防治缺血再灌注损伤的组合物。

背景技术

[0002] 近年来，随着休克治疗的进步以及动脉搭桥术、溶栓疗法、经皮腔内冠脉血管成形术、心脏外科体外循环、心肺脑复苏，断肢再植和器官移植等方法的建立和推广应用，使许多组织器官缺血后重新得到血液再灌注。多数情况下，缺血后再灌注可使组织器官功能得到恢复，损伤的结构得到修复，患者病情好转康复；但有时缺血后再灌注．不仅不能使组织、器官功能恢复，反而加重组织、器官的功能障碍和结构损伤。这种在缺血基础上恢复血流后组织损伤反而加重，甚至发生不可逆性损伤的现象称为缺血-再灌注损伤（ischemia reperfusion injury，IRI）。如何减轻或避免IRI已成为近年倍受关注的问题。通过建立实验模型，研究药物和缺血预处理干预来减轻或防止脏缺血再灌注损伤具有十分重要的临床应用意义。

[0003] 促红细胞生成素（hemopoietin，EPO）是由肾脏和肝脏分泌的一种激素样物质，能够促进红细胞生成。近年来学者们发现EPO有抑制细胞凋亡、抑制炎症反应、诱导缺血耐受等功能，对各组织脏器（如脑、心脏、肾、肺、肠等）的缺血再灌注损伤均有保护作用。在缺血再灌注组织中，EPO与其受体结合通过丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、JAK2/NFκB和磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K/Akt）等细胞内路径发挥调节细胞凋亡的作用。

[0004] 硒（Selenium，Se）是人体必需的微量元素，它的生物学功能主要是作为谷胱甘肽过氧化酶、硫氧还蛋白还原酶、脱碘酶、硒蛋白P和W等酶或蛋白的活性中心或必要组成成份发挥其抗氧化功能。

发明内容

[0005] 本发明解决的问题在于提供一种用于防治缺血再灌注损伤的组合物及其应用，该组合物对缺血再灌注损伤发挥良好的协同保护作用。

[0006] 本发明是通过以下技术方案来实现：

[0007] 一种用于防治缺血再灌注损伤的组合物，将EPO与硒按照EPO︰硒=1万IU︰28.5~7310.6μg的比例组合。

[0008] 进一步，EPO与硒按照EPO︰硒=1万IU︰456μg的比例组合。

[0009] 所述的硒是以亚硒酸盐或硒代硫酸盐的形式与EPO进行组合。

[0010] 所述的亚硒酸盐为亚硒酸钠或亚硒酸氢钠，所述的硒代硫酸盐为硒代硫酸钠。

[0011] 所述的硒是以亚硒酸钠的形式与EPO进行组合，EPO与亚硒酸钠的组合比例为EPO︰亚硒酸钠=1万IU︰1000μg。

[0012] 一种用于防治缺血再灌注损伤的注射液，在100mL注射液中包括30~100万IU的EPO、30~100mg的亚硒酸钠、0.5~2g人血白蛋白、0.2~0.6g氯化钠和10~50mmol/L枸橼酸盐缓冲液；pH为6.0~7.0。

[0013] 所述的防治缺血再灌注损伤的注射液，在100mL注射液中包括100万IU的EPO、100mg的亚硒酸钠、1g人血白蛋白、0.4g氯化钠、10~50mmol/L枸橼酸盐缓冲液。

[0014] 一种防治缺血再灌注损伤的注射液的制备方法，包括以下步骤：

[0015] 将30~100万IU的EPO用10~50mmol/L枸橼酸盐缓冲液溶解，再加入30~100mg亚硒酸钠，搅拌溶解，然后加入0.5~2g人血白蛋白和0.2~0.6g氯化钠，充分搅拌混匀，调整体积至100mL，并调节pH至6.0~7.0，过滤除菌，最后灌封。

[0016] 所述的防治缺血再灌注损伤的组合物用于预防或治疗缺血再灌注损伤的药物的制备的应用。

[0017] 与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

[0018] 本发明提供的用于防治缺血再灌注损伤的组合物，是将EPO和硒进行组合，进行组合之后在术前进行注射，能够降低血浆中的BUN的水平，显示出改善肾缺血再灌注损伤所致的肾功能，减轻肾小管损伤，并且可改善肾缺血再灌注损伤所致的肾功能和肾脏的病理学改变，说明二者合用对缺血再灌注损伤具有保护作用，为缺血再灌注损伤的防治开辟新的途径。

[0019] 本发明提供的用于防治缺血再灌注损伤的组合物，该复方组合可EPO和亚硒酸钠的降糖作用相互协同，EPO和亚硒酸钠的器官组织保护作用相互加强，对缺血再灌注损伤具有协同保护作用。其中EPO的保护作用更明显，是主药；亚硒酸钠是辅药，二者合用的疗效明显优于EPO或亚硒酸钠单用。

附图说明

[0020] 图1为EPO和亚硒酸钠对缺血再灌注所致大鼠血浆尿素氮（BUN）水平的影响。

[0021] 图2为EPO和亚硒酸钠对缺血再灌注所致大鼠肾脏皮质损伤的保护作用（HE染色，X400）。A，假手术组；B，缺血再灌注组；C，EPO组；D，亚硒酸钠组；E，EPO+亚硒酸钠小剂量组；F，EPO+亚硒酸钠中剂量组；G，EPO+亚硒酸钠大剂量组。

具体实施方式

[0022] 本发明提供一种防治缺血再灌注损伤的药物组合物，是将EPO与硒进行复方组合，并进一步制成注射液，EPO的器官保护作用和硒的抗氧化作用是EPO和硒二者组方合理性的基础。该复方组合可改善肾缺血再灌注损伤所致的肾功能，EPO和亚硒酸钠的降糖作用相互协同，复方EPO硒注射液的肾功能保护作用强于二者单用。下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

[0023] 1、EPO与硒组合物的组合配比及其对缺血再灌注损伤的保护作用

[0024] 1.1EPO与硒的组合基础

[0025] EPO因其促进红细胞生成作用，在临床上主要用于严重贫血。近年来学者们发现EPO还有非促红细胞生成作用，如抑制细胞凋亡、抑制炎症反应、诱导缺血耐受等功能，对各组织脏器（如脑、心脏、肾、肺、肠等）的缺血再灌注损伤均有保护作用。

[0026] 硒是人体必需的微量元素，其抗氧化功能使得硒可能成为缺血再灌注损伤联合用药的备选药。亚硒酸钠是用于硒缺乏症和日常补硒的药物。

[0027] 将EPO与硒进行复方组合，有可能会起到更好的缺血再灌注损伤防治的效果，其中EPO的器官保护作用和硒的抗氧化作用是EPO和硒二者组方合理性的基础。

[0028] 1.2EPO与硒的组合对缺血再灌注损伤的保护的验证

[0029] 1.2.1以肾的缺血再灌注作为具体的缺血再灌注模型，动物模型的复制如下：

[0030] 健康雄性昆明种小鼠，体重18~22g，每组10只，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。腹腔注射20%乌拉坦溶液进行麻醉，行腹部手术：仰卧位固定，消毒。做腹部切口，暴露双侧肾脏，切除右侧肾脏，钝性分离左侧肾周组织，用无损伤动脉夹夹闭左侧肾蒂，造成左肾缺血。60min后，松开动脉夹实行再灌注（肉眼可见肾脏由暗红色变为鲜红，表明再灌注成功）。再灌注4h后经摘眼球取血处死。

[0031] 1.2.2EPO与硒的组合及处理的动物分组：

[0032] 涉及到EPO与硒的组合，具体的EPO采用重组人红细胞生成素（rhEPO，recombinant human erythropoietin），而硒是以亚硒酸盐或硒代硫酸盐的形式与EPO进行组合，通常亚硒酸盐为亚硒酸钠或亚硒酸氢钠，所述的硒代硫酸盐为硒代硫酸钠。所述的亚硒酸盐或硒代硫酸盐都是为了能够提供硒与EPO的组合，并没有其他实质的区别。具体的采用亚硒酸钠来进行组合，并进一步采用权重配比组方研究，确定EPO和亚硒酸钠的最佳配比比例。

[0033] 利用均匀设计表，选取EPO给药量与亚硒酸钠（硒：78.96；亚硒酸钠：172.94）给药4
量两个因素各设6个水平，选用U6(6)均匀设计表进行试验（具体如表1所示）。

[0034] 给药方式：术前3天腹腔注射，1次/d，连续3d，随后进行缺血再灌注手术处理。观测指标：摘眼球取血，离心后取血浆，检测血浆尿素氮（BUN）水平。

[0035] 表1.均匀设计组方试验方案

[0036]组别 EPO(IU/kg) 亚硒酸钠(μg/kg)
EPO+Se① 125 50
EPO+Se② 250 400
EPO+Se③ 500 25
EPO+Se④ 1000 200
EPO+Se⑤ 2000 12.5
EPO+Se⑥ 4000 100

[0037] 3）EPO和亚硒酸钠注射液的复方组合及其制备方法

[0038] 根据中国药典2010年版二部中重组人促红素注射液（CHO细胞）的处方以及表1中EPO与硒组合物的组方配比，设计复方EPO和亚硒酸钠注射液的复方组合及其制备方法。具体的设计如表2所示：

[0039] 表2复方EPO和亚硒酸钠注射液的复方组合

[0040]

[0041]

[0042] 复方EPO和亚硒酸钠注射液的制备方法，包括以下步骤：

[0043] 将处方量的EPO用10~50mmol/L枸橼酸盐缓冲液溶解；

[0044] 再加入处方量的亚硒酸钠，搅拌溶解；

[0045] 然后加入处方量的人血白蛋白和氯化钠，充分搅拌混匀，调整体积至100mL，并调节pH至6.0~7.0，过滤除菌，最后灌封，即得。

[0046] 4）EPO和亚硒酸钠注射液的复方组合对肾缺血再灌注损伤血浆BUN水平的影响[0047] BUN是蛋白质代谢的主要终末产物。尿素中氮含量为28/60，几乎达到一半。肾脏为排泄尿素的主要器官，血浆BUN是反映肾功能的主要检测指标之一。当肾功能损害早期，血浆BUN可在正常范围。当肾小球率过滤下降至正常的50%以下时，血浆BUN的浓度会迅速升高。肾缺血再灌注损伤会导致急性肾功能不全，血浆BUN升高的程度一般与病情严重程度一致，血浆BUN越高，肾功能损伤越重。因此可以采用检测血浆BUN水平作为反映缺血再灌注导致肾功能损伤的指标。

[0048] 术前3天，每天腹腔注射上述复方EPO和亚硒酸钠注射液，观察对其对小鼠肾缺血再灌注损伤所致血浆BUN水平的影响（采用脲酶法BUN试剂盒进行检测），结果发现各种组方均可降低血浆BUN水平，其中最大效应为第5种组方，详见表3。

[0049] 表3复方EPO与亚硒酸钠组方的对小鼠血浆BUN的影响

[0050]Group BUN(mmol/L) 1/BUN
EPO+Se① 15.13±1.48 0.067±0.006
EPO+Se② 14.16±3.13 0.074±0.018

[0051]EPO+Se③ 16.29±1.71 0.062±0.007
EPO+Se④ 10.74±1.65 0.098±0.017
EPO+Se⑤ 9.09±2.35 0.117±0.031
EPO+Se⑥ 9.76±1.66 0.112±0.020

[0052] 表3的结果显示，在术前进行EPO与亚硒酸钠组合的注射，能够降低肾缺血再灌注损伤血浆BUN作用，其中EPO与硒的配比换算为：

[0053] EPO︰硒=1IU︰0.0114～0.0731μg（1万IU︰114～731μg），其中优化的配比为：EPO 1万IU︰硒456μg。

[0054] 而进一步对结果进行统计学处理：采用DAS1.0软件对EPO和硒的配比进行权重配比组方分析（表4），得到EPO和硒的最佳组方比例为：

[0055] EPO︰亚硒酸钠=10︰1=1︰0.1（1IU︰0.1μg）。

[0056] 表4EPO和亚硒酸钠在组方中的作用及其相互作用定性分析

[0057]

[0058] 对EPO和亚硒酸钠复方组合对肾缺血再灌注损伤血浆BUN的作用进行权重配比组方分析，结果显示，EPO和亚硒酸钠最佳配比比例为10︰1，其中EPO为主药，亚硒酸钠为辅药，二者对肾缺血/再灌注损伤具有协同保护作用。理论优化组方为EPO（4000IU/kg）和亚硒酸钠（400μg/kg），最佳组方比例为：1︰0.1。

[0059] 2、EPO与硒组合物对肾缺血再灌注的协同保护作用

[0060] 在EPO为主药，亚硒酸钠为辅药的基础上，对二者进一步进行拆方研究，对EPO与硒组合物与各自单用进行比较。动物模型制备：大鼠腹腔注射20%乌拉坦溶液进行麻醉，行腹部手术：仰卧位固定，消毒。做腹部切口，暴露双侧肾脏，切除右侧肾脏，钝性分离左侧肾周组织，用无损伤动脉夹夹闭左侧肾蒂，造成左肾缺血。60min后，松开动脉夹实行再灌注（肉眼可见肾脏由暗红色变为鲜红，表明再灌注成功）。再灌注4h后经腹主动脉取血处死。观测指标：腹主动脉取血，离心后取血浆，检测血浆BUN；切除左肾，上部置于10%福尔马林固定液中石蜡包埋后常规切片，HE染色，光镜下观察肾组织病理变化。

[0061] 动物分组及处理：健康雄性SD大鼠，体重180~220g，每组10只，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。分组如下：①假手术组（Sham group：切除右侧肾脏，钝性分离左侧肾周组织，不夹闭；生理盐水0.5ml/100g体重，术前3天腹腔注射，1次/d，连续3d）；②缺血再灌注组（也即模型组，I/R group：生理盐水0.5ml/100g体重）；③EPO组（EPO group：1500U/kg）；④亚硒酸钠组（Se group：150μg/kg）；⑤EPO+亚硒酸钠小剂量组（EPO+Se small dose group：EPO 750U/kg+Na2SeO3 75μg/kg）；⑥EPO+亚硒酸钠中剂量组（EPO+Se middle dose group：EPO 1500U/kg+Na2SeO3 150μg/kg）；⑦EPO+亚硒酸钠大剂量组（EPO+Se large dose group：EPO 3000U/kg+Na2SeO3 300μg/kg）。均为术前3天腹腔注射，1次/d，连续3d。

[0062] 各处理组对大鼠血浆尿素氮（BUN）含量的检测结果的直方图如图1所示。模型组大鼠血浆BUN含量明显升高（P<0.05，与假手术组比较），提示模型制备成功；单独给予EPO和亚硒酸钠对血浆BUN的影响不明显（P>0.05，与模型组比较），而二者联用后即复方EPO和亚硒酸钠注射液各剂量组均可使大鼠血浆BUN含量明显降低（P<0.05，与模型组比较），且具有一定的剂量关系，复方EPO和硒注射液可降低血浆BUN水平，其作用强于单用EPO和亚硒酸钠（P<0.01），也强于二倍量EPO和亚硒酸钠单用（P<0.05），即A+B>2A，A+B>2B，提示EPO和亚硒酸钠联用对急性肾缺血再灌注损伤有协同保护作用。

[0063] 肾组织病理改变

[0064] 光镜下可见假手术组肾间质无充血、水肿及炎症细胞浸润，肾小管排列整齐，未发现明显的病理改变。模型组肾组织损伤明显加重，肾皮质区近曲小管上皮细胞水肿，局部有上皮细胞变性、坏死脱落，部分细胞核染色质边集、脱落、形成凋亡小体；大量肾小管上皮细胞肿胀，小管内可见大量蛋白管型和坏死脱落细胞，间质充血、水肿，局灶性炎性细胞浸润；部分肾小球、间质可见玻璃样变性，肾小球囊可见丝状渗出物。EPO和Se单用或复方大、中、小剂量组肾组织损伤明显减轻，以肾小管肿胀为主，个别呈坏死样改变，小管内蛋白管型明显减少；肾间质充血、水肿、炎性细胞浸润不明显。与模型组比较，各处理组均能明显减轻缺血再灌注损伤，表现为减少肾小管上皮细胞的坏死，减轻间质充血、水肿，减少蛋白管型，减少炎细胞侵润，具体的结果如图2所示。

[0065] 3、复方EPO和亚硒酸钠注射液的组合及其制备方法

[0066] 根据上述实验结果，优化的组合如下：EPO 100万IU，亚硒酸钠100mg，人血白蛋白1g，氯化钠0.4g，10~50mmol/L枸橼酸盐缓冲液加至100mL。

[0067] 鉴于EPO和硒的组合需要在术前进行注射，因此，提出一种用于防治缺血再灌注损伤的注射液的制备方法，包括以下步骤：

[0068] 将30~100万IU的EPO用10~50mmol/L枸橼酸盐缓冲液溶解，再加入30~100mg亚硒酸钠，搅拌溶解，然后加入0.5~2g人血白蛋白和0.2~0.6g氯化钠，充分搅拌混匀，调整体积至100mL，并调节pH至6.0~7.0，过滤除菌，最后灌封，即得。