一种产黄酮的内生真菌及其应用

摘要

本发明公开了一种内生菌株普通青霉（Penicilliumcommune）CGMCCNO.6113及其在生产黄酮中的应用。本发明提供的普通青霉（Penicilliumcommune）CGMCCNo.6113菌株及在菌学上来说与其同等的菌株生产黄酮显著，使用所述菌株进行发酵，可产生甘草苷、甘草素、异甘草素等甘草黄酮类的主要成分，能作为预防与治疗手段进行抗氧化、延缓衰老、消除炎症等应用，这为甘草黄酮类成分的开发利用提供了新途径，具有广泛的应用价值。

权利要求

1.一种生产黄酮的内生菌株，其特征在于，所述的内生菌株为普通青霉（Penicillium commune）CGMCC NO.6113。

2.如权利要求1所述的内生菌在生产黄酮中的应用，所述内生菌株为普通青霉（Penicillium commune）CGMCC NO.6113。

说明书

一种产黄酮的内生真菌及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及微生物技术领域，具体的说，本发明具体涉及一种产黄酮的内生真菌及其应用的技术领域。

背景技术

[0002] 甘草（Glycyrrhiza）属多年生豆科草本植物，是我国传统中药中最常用的草药之一，素有“国老”之誉；甘草黄酮是甘草重要的活性成分之一，具有抗氧化、抗病毒、抗肿瘤、增强免疫力等作用，在医药保健、食品添加剂、化妆品等方面应用广泛；甘草主产于我国东北、华北、西北各干旱贫瘠地区，具有固沙绿化的重要作用，因此，甘草被政府列为保护药材，禁止滥挖；近年来人工种植甘草得到较快发展，但因其生长周期长、收益慢，仍不能满足市场对甘草药材的需求。

[0003] 植物内生菌是指在其生活史中某一时期生活在健康植物组织内，但不引起植物产生病害症状的微生物，包括真菌、放线菌和细菌；内生菌可以产生与宿主植物相同或相似的生理活性物质，自1993年Stierle等从红豆杉中发现能产紫杉醇的内生真菌后，近些年相继有研究表明许多药用植物内生菌能够产生类似宿主植物药效成分的生物活性物质，且主要以内生真菌为主；与从植物中提取活性物质相比，微生物具有生长繁殖快，发酵成本低，易培养，易控制，不受气候与地域等自然条件的限制，易于通过现代生物技术改造遗传性状等优点，对保护药材资源和保证药物供应等有重要的意义；因此植物内生菌已成为筛选与宿主相同或相似的有益代谢产物的研究热点。

[0004] 目前，现有技术研究表明，有关植物内生菌的研究多集中于其生物防治能力的开发，而有关内生菌产生功能性成分的研究较为少见，甘草中也有较为丰富的内生菌资源，但利用甘草内生菌生产活性产物仍缺乏系统的研究，因此，研究行之有效的利用甘草内生菌生产活性产物具有现实的意义。

发明内容

[0005] 针对现有技术中未见专门针对利用甘草内生菌生产黄酮类物质的技术现状，本发明旨在提供一种产黄酮的内生真菌及其应用，填补了利用甘草内生菌生产黄酮的技术空白，为甘草黄酮类成分的开发利用提供了新途径，具有广泛的应用价值。

[0006] 本发明提供的一株生产黄酮的内生菌株，通过在新疆阿拉尔市辖区采集野生甘草健康植株中分离、筛选和培养，获得一批内生菌的微生物菌株，从中筛选出一株编号为ZJF-9菌株，具有稳定而显著的生产黄酮效果，经微生物学分类与鉴定，属于普通青霉（Penicillium commune）。

[0007] 本发明在获得的普通青霉（Penicillium commune）的基础上，提供了一种普通青霉（Penicillium commune）在生产黄酮的应用。

[0008] 本发明提供的一种生产黄酮的内生菌株，命名为ZJF-9，该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101；保藏日期是2012年5月14日，保藏号是CGMCC No.6113，经微生物学鉴定为普通青霉（Penicillium commune）；该菌株在察氏培养基上培养7 d后，菌落直径约2 cm，质地致密绒状，菌落黄绿色，中部有放射状或不规则褶皱沟纹，部分呈肉色，边缘呈浅灰绿色至白色，较为整齐，反面乳黄至黄褐色，分生孢子呈灰绿色；从形态特征来看，菌丝有隔，分生孢子梗从菌丝垂直生出，呈轮状分支，或生于短侧枝上，或直接从菌丝上生出，无足细胞；分生孢子串生，孢子呈卵圆形，大小约3×2 μm；孢子梗茎宽约4 μm；依照《真菌鉴定手册》对ZJF-9菌株进行形态学测定，生理生化检测确定ZJF-9菌株为普通青霉（Penicillium commune）中的成员；通过BLAST同源比对，菌株ZJF-9的ITS序列与Penicillium commune 的ITS序列的相似性最高，为99%，因而将ZJF-9菌株确定为普通青霉（Penicillium commune）。

[0009] 采用液体PDA培养基，按每瓶50 mL分装至150 mL三角瓶中，灭菌；将活化的菌种7
普通青霉（Penicillium commune）斜面用无菌水制成孢子悬液，调节孢子浓度为10 个/mL，按10%（v/v）的接种量接种至发酵培养基中，放至摇床中，30℃、120 r/min发酵，6 d后终止发酵，将发酵液于6 000 r/min下离心15 min，取上清液进行黄酮抗氧化测定及黄酮含量测定，该菌株抗氧化能力强，发酵液对DPPH·的清除率达到32.05%；该菌株发酵液中的总黄酮含量为21.56 mg/L，通过高效液相色谱法（HPLC）测定该菌株发酵液中含有甘草苷、甘草素、异甘草素等甘草黄酮成分，其中，甘草苷含量为6.78 mg/L，甘草素含量为0.04 mg/L，异甘草素含量为0.38 mg/L；经发酵培养基优选，该菌株在液体察氏培养基中发酵后，发酵液中的总黄酮含量可高达112.49 mg/L，其中含有17.36 mg/L甘草苷，0.33 mg/L异甘草苷，0.54 mg/L甘草素。

[0010] 通过实施本发明具体的发明内容，可以达到以下效果：

[0011] 通过本发明的阐述，并得到实施例进一步的验证，通过试验表明，本发明的普通青霉（Penicillium commune）CGMCC No.6113菌株及在菌学上来说与其同等的菌株生产黄酮显著，使用所述菌株进行发酵，可产生甘草苷、甘草素、异甘草素等甘草黄酮类的主要成分，能作为预防与治疗手段进行抗氧化、延缓衰老、消除炎症等应用，这为甘草黄酮类成分的开发利用提供了新途径，具有广泛的应用价值。

附图说明

[0012] 图1所示为普通青霉（Penicillium commune）CGMCC NO.6113的菌落形态图。

[0013] 图2所示为普通青霉（Penicillium commune）CGMCC NO.6113的进化树图。

具体实施方式

[0014] 下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。另外，在下述的说明中，本发明采用新疆本地产的野生甘草，如无特别说明，％皆指质量百分比。

[0015] 仪器设备：SW-CJ-2F超净工作台（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；GZX-9140MBE数显鼓风干燥箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；AR1140精密电子天平（梅特勒－托利多仪器（上海）有限公司）；SHZB金怡水浴恒温振荡器（江苏省金坛市医疗仪器厂）；LDZX-50KB立式电热压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）；PX-9272MBE数显电热培养箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；DK-8D型电热恒温水槽（上海精宏实验设备有限公司）；721可见分光光度计（上海青华科技有限公司）。

[0016] 本发明采用不同季节采集健康甘草植株，加入少量洗洁精洗涤，再用吐温80浸泡几分钟后用自来水清洗干净，分根、茎、叶三部分晾干水分备用；柚皮苷、DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)，购自美国Sigma公司；甘草素、甘草苷、异甘草素、异甘草苷标准品（纯度＞98%），购自安徽芜湖甙尔塔医药科技有限公司；其余化学试剂均为国产分析纯；内生真菌的分离用马铃薯葡萄糖（PDA）琼脂培养基，菌种形态特征鉴定用察氏培养基，发酵培养基用PDA液体培养基,实施例五中还使用液体察氏培养基、液体马丁氏培养基。

[0017] 本发明中选用的所有试剂和仪器都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。

[0018] 实施例一：普通青霉（Penicillium commune）CGMCC NO.6113的分离、筛选及鉴定[0019] 将洗净晾干的健康新鲜甘草植株根、茎、叶分别装入烧杯中，用2.5% NaClO分别将根、茎浸泡5 min、叶浸泡2 min，无菌水冲洗3次后再用75%乙醇分别浸泡5 min、1 min，再用无菌水冲洗3~4次，最后一次清洗的水涂布至培养基平板中检查表面消毒是否彻底。

[0020] 经表面消毒的甘草根茎叶分别用无菌研钵研碎，取少量均匀撒在分离培养基上，30℃下培养箱中培养，每天进行观察，菌体长出后根据菌落及菌体形态以划线法转接至新鲜PDA培养基上进行纯化，最终得到纯培养菌株，在4℃下试管斜面保藏。

[0021] 以点种法分别将高产黄酮菌株接种至察氏培养基上，培养7 d后观察菌落形态，同时，以插片法分别观察菌株的显微形态，参考《中国真菌志》对菌株进行形态特征鉴定。

[0022] 从甘草茎中获得1株高产甘草黄酮内生真菌，编号ZJF-9，是一株青霉，菌株鉴定为普通青霉（Penicillium commune），普通青霉（Penicillium commune）的保藏号CGMCC NO.6113。

[0023] 菌株ZJF-9的形态特征为：在察氏培养基上培养7 d后，菌落直径约2 cm，质地致密绒状，菌落黄绿色，中部有放射状或不规则褶皱沟纹，部分呈肉色，边缘呈浅灰绿色至白色，较为整齐，反面乳黄至黄褐色，分生孢子呈灰绿色；从形态特征来看，菌丝有隔，分生孢子梗从菌丝垂直生出，呈轮状分支，或生于短侧枝上，或直接从菌丝上生出，无足细胞；分生孢子串生，孢子呈卵圆形，大小约3×2 μm；孢子梗茎宽约4 μm。

[0024] 根据《真菌鉴定手册》对菌株ZJF-9的形状、大小、生理生化反应综合进行检测，本发明的ZJF-9菌株生物学特性如表1所示。

[0025] 表 1：高产黄酮菌株ZJF-9的生理生化特性

[0026]菌株 脂肪水解 石蕊牛奶 尿素 淀粉水解 明胶液化
ZJF-9 — + + — +
菌株 硫化氢 吲哚 甲基红 伏-普 柠檬酸盐
ZJF-9 — — — — +
ZJF-9 产酸 产气 生长情况
葡萄糖 + — +
乳糖 — — —
蔗糖 — — +

[0027] 在形态鉴定的基础上，对菌株ZJF-9进一步进行分子鉴定。

[0028] ZJF-9利用真菌ITS的引物：

[0029] ITS1：(5’ TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3’)

[0030] ITS4：(5’ TCCTCCGCTTATTGATATGC 3’)

[0031] 以ZJF-9菌株的基因组DNA为模板，进行PCR扩增；PCR反应条件为95℃ 3 min，95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 40 s，30个循环，测序；应用BLAST程序将所得的ITS序列与GenBank 数据库中的序列进行相似性比较分析；结果发现菌株ZJF-9与Penicillium commune 的ITS序列相似性最高，为99%，表明二者的亲缘关系最近。

[0032] 序列为：

[0033] TATTGATCCG AGGTCACCTG GATAAAATTT GGGTTGATCG GGAAGCGCCG GCCGGGCCTA 60[0034] CAGAGCGGGT GACAAAGCCC CATACGCTCG AGGACCGGAC GCGGTGCCGC CGCTGCCTTT 120[0035] CGGGCCCGTC CCCCGGAGAT CGGGGGACGG GGCCCAACAC ACAAGCCGGG CTTGAGGGCA 180[0036] GCAATGACGC TCGGACAGGC ATGCCCCCCG GAATACCAGG GGGCGCAATG TGCGTTCAAA 240[0037] GACTCTATGA TTCACTGAAT TTGCAATTCA CATTACGTAT CGCATTTCGC TGCGTTCTTC 300[0038] ATCGATGCCG GAACCAAGAG ATCCGTTGTT GAAAGTTTTA AATAATTTAT ATTTTCACTC 360[0039] AGACTTCAAT CTTCAGACAG AGTTCGAGGG TGTCTTCGGC GGGCGCGGGC CCGGGGGCGT 420[0040] AAGCCACCCG GCGGCCAGTT AAGGCGGGCC CGCCCAACCA ACAAGGTAAA ATAAACACGG 480[0041] GTGGGAGGTT GGACCCAGAG GGCCCTCACT CGGTAATGAT CCTTCCGCAG GTTCACCTAC 540[0042] GGAAGCT 547[0043] 通过对菌株ZJF-9的同源ITS序列进行进化分析发现与Penicillium commune DQ132843其在同一分支，其进化拓扑结构参见附图所示；结合菌株ZJF-9的形态结构特征及生理生化特性，确定其为普通青霉（Penicillium commune）。

[0044] 实施例二：普通青霉（Penicillium commune）CGMCC NO.6113的发酵产物[0045] 选用上述实施例一中的菌株普通青霉（Penicillium commune）CGMCC NO.6113，通过马铃薯葡萄糖（PDA）琼脂试管斜面进行活化，同时配制液体马铃薯葡萄糖培养基（液体PDA），按每瓶50 mL分装至150 mL三角瓶中，灭菌；将活化的菌种斜面用无菌水制成孢7
子悬液，调节孢子浓度为10 个/mL，按10%（v/v）的接种量接种至发酵培养基，放至摇床中，30℃、120 r/min发酵，做5次重复，6 d后终止发酵，将发酵液于6 000 r/min下离心15 min，除去沉淀，取上清液进行黄酮显色反应检测及黄酮测定。

[0046] 黄酮显色反应检测：

[0047] 盐酸-镁粉反应：取1 mL待测液至试管，加入少量镁粉，然后滴加浓盐酸3~4滴。

[0048] 三氯化铁反应：取1 mL待测液至试管中，加入数滴2%的FeCl3溶液。

[0049] NaOH反应：取1 mL待测液至试管中，加入4%的NaOH溶液数滴。

[0050] 显色反应的结果鉴别如下：

[0051] 表2 黄酮显色反应结果鉴别

[0052]反应类型 反应现象 结果分析
盐酸-镁粉 红→紫红泡沫 可能含黄酮、黄酮醇、二氢黄酮、二氢黄酮醇等FeCl3 酒红色 可能具有酚性羟基
NaOH 黄~橙色 黄酮
红~紫红色 查耳酮、橙酮
黄色~棕色 黄酮醇

[0053] 同时，采用比色法于415 nm下测定发酵液中的黄酮含量；取样品溶液0.5 mL加入10％ KOH溶液0.5 mL，室温放置5 min，用甲醇稀释定容至10 mL；再取各样品溶液0.5 mL，直接用甲醇定容至10 mL作为空白对照，在415 nm下测定吸光度。

[0054] 以柚皮苷为标准品，415 nm下测定吸光度。以吸光度值为横坐标，柚皮苷质量浓2
度(mg/mL)为纵坐标绘制标准曲线；得到回归方程：Y = 0.0189X + 0.0007，R = 0.9989，其中Y为黄酮含量(mg /mL)，X为吸光度值。

[0055] 该菌株发酵液的黄酮显色反应为：

[0056]

[0057] 通过比色法测定，该菌株发酵液中的总黄酮含量为21.56 mg/L。

[0058] 实施例三：普通青霉（Penicillium commune）CGMCC NO.6113发酵产物抗氧化活性检测

[0059] 根据实施例二结果，可确定普通青霉（Penicillium commune）CGMCC NO.6113可产黄酮类物质；以与实施例二相同的条件进行发酵，发酵液离心后浓缩5倍，并用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，得到黄酮粗提液，进行DPPH·抗氧化实验；DPPH用70%的乙醇配制成-56.5×10 mol/L的溶液；在具塞试管中按表2加样，摇匀，室温下反应15 min，在517 nm处测定吸光值，清除率按下式计算：

[0060] 清除率（％）＝[1-（Ai-Aj）/A0]×100％

[0061] 表3 DPPH·实验加样表

[0062]吸光值A 加样量
空白A0 4.00mL6.5×15-5mol/LDPPH乙醇溶液+0.80mL蒸馏水
Ai 4.00mL6.5×15-5mol/LDPPH乙醇溶液+0.80mL待测液
Aj 4.00mL70%乙醇溶液+0.80mL待测液

[0063] （注：Aj中“待测液”即指发酵液，离心后微孔滤膜除菌）

[0064] 结果表明，该菌株抗氧化能力强，浓缩5倍后的发酵液对DPPH·的清除率达到32.05%。

[0065] 实施例四：普通青霉（Penicillium commune）CGMCC NO.6113发酵液中主要甘草黄酮成分的测定

[0066] 采用高效液相色谱法（HPLC）检测了普通青霉（Penicillium commune）CGMCC NO.6113发酵液中甘草苷、甘草素、异甘草苷及异甘草素四种甘草黄酮主要成分的含量，发酵条件同实施例二；HPLC仪器为Waters Alliance HPLC 2695，色谱柱SinoChrom ODS-BP5μm，柱温25℃，柱压3100 pis，流速1 mL/min，检测波长260 nm，采用混合标液进样，以甲醇-水为流动相，梯度洗脱。

[0067] 用甲醇分别配制甘草苷、甘草素、异甘草苷、异甘草素溶液，再取适量进行混合，制备成不同浓度梯度的标准液，分别取10 μL进样测定，得回归方程和相关系数；甘草苷：Y = 8667.8X + 415.56，r = 0.9993；异甘草苷：Y = 60566X - 15518，r = 0.9992；甘草素：Y = 20000X – 983.89，r = 0.9998；异甘草素：Y = 11424X – 507.33，r = 0.9993；出峰顺序依次为甘草苷、异甘草苷、甘草素、异甘草素。

[0068] 通过高效液相色谱法（HPLC）测定该菌株发酵液中含有甘草苷、甘草素、异甘草素等甘草黄酮成分，其中甘草苷含量为6.78 mg/L，甘草素含量为0.04 mg/L，异甘草素含量为0.38 mg/L，异甘草苷未检出。结果如下：

[0069]

[0070] 实施例五：普通青霉（Penicillium commune）CGMCC NO.6113发酵培养基优选[0071] 选用液体PDA培养基、液体察氏培养基、液体马丁氏培养基三种不同的培养基，对菌株ZJF-9进行了发酵，其它条件同实施例二，并通过比色法和HPLC法对其发酵液中甘草黄酮进行了检测，比色法条件同实施例二，HPLC法条件同实施例四。

[0072] 结果表明，普通青霉（Penicillium commune）CGMCC NO.6113经三种培养基发酵后，察氏培养基表现较优，比色法测定其发酵液中的总黄酮含量高达112.49 mg/L，其次为马丁氏培养基，发酵液中总黄酮含量为56.99 mg/L，PDA培养基发酵后发酵液中的总黄酮含量为52.12 mg/L，其中普通青霉（Penicillium commune）CGMCC NO.6113在察氏培养基中发酵后的发酵液含有17.36 mg/L甘草苷，0.33 mg/L异甘草苷，0.54 mg/L甘草素，异甘草素未检出，几种主要甘草黄酮的总量达18.23 mg/L。具体结果如下：

[0073]