人尿酸氧化酶蛋白及其制备方法和其聚乙二醇结合物

摘要

本发明公开的人尿酸氧化酶蛋白，由SEQ ID NO.3的氨基酸序列组成。本发明所得到的人尿酸氧化酶蛋白，回复人尿酸氧化酶基因中的突变密码，将回复突变后的人尿酸氧化酶基因导入工程菌中实现人尿酸氧化酶基因的表达，产生具有酶活性的尿酸氧化酶蛋白。本发明公开的聚乙二醇人尿酸氧化酶蛋白结合物及药物组合物，具有氧化分解尿酸的活性，可用于治疗高尿酸血症及由于高尿酸引起的疾病(如痛风)。

权利要求

1.一种人尿酸氧化酶蛋白，其特征在于由SEQ ID NO.3 的氨基酸序列组成。

2.一种核酸序列，其特征在于编码权利要求1的人尿酸氧化酶蛋白的核酸序列。

3.一种核酸载体，其特征在于包含权利要求2所述的核酸序列。

4.如权利要求3所述的核酸载体，其特征在于所述的核酸载体的出发载体采用pET 系列载体、PEPTIDE、pMAL-c2x、pGEX4T、pGEX5X、pGEX6P、pQE30、pTrcHisB、pTWIN、pBV220、pPICZα、pPIC9K、PGAPZα、pYES2/CT、Bacmid DNA、pcDNA3.1、pcDNA4.0 或EGFP。

5.一种宿主细胞，其特征在于包含权利要求4所述的核酸载体。

6.一种制备如权利要求1所述的人尿酸氧化酶蛋白的方法，其特征在于包括宿主细胞表达所述核酸序列的培养条件下培养权利要求5的宿主细胞步骤，以及分离纯化所表达的人尿酸氧化酶蛋白的步骤。

7.一种聚乙二醇人尿酸氧化酶蛋白结合物，其特征在于它包含权利要求1所述的人尿酸氧化酶蛋白，所述人尿酸氧化酶蛋白与聚乙二醇分子共价连接。

8.如权利要求7 所述的聚乙二醇人尿酸氧化酶蛋白结合物，其特征在于所述的人尿酸氧化酶蛋白的每个亚基包含2～12 个聚乙二醇分子。

9.如权利要求7 所述的聚乙二醇人尿酸氧化酶蛋白结合物，其特征在于所述的聚乙二醇分子的分子量为5kd～100kd。

10.如权利要求7 所述的聚乙二醇人尿酸氧化酶蛋白结合物，其特征在于所述的聚乙二醇分子经活化后与人尿酸氧化酶蛋白上氨基共价连接。

11.如权利要求7 所述的聚乙二醇人尿酸氧化酶蛋白结合物，其特征在于所述的聚乙二醇分子经活化后与人尿酸氧化酶蛋白上巯基共价连接。

12.如权利要求7至11任一项权利要求所述的聚乙二醇人尿酸氧化酶蛋白结合物，其特征在于聚乙二醇分子为分枝型或直线型。

13.一种药物组合物，其特征在于该药物组合物包含权利要求1所述的人尿酸氧化酶蛋白。

14.一种药物组合物，其特征在于该药物组合物包含权利要求7至12任一项权利要求所述的聚乙二醇人尿酸氧化酶蛋白结合物。

说明书

人尿酸氧化酶蛋白及其制备方法和其聚乙二醇结合物

技术领域

[0001] 本发明涉及基因工程技术制备的具有尿酸分解活性的蛋白酶，更具体地说，本发明涉及一种新的尿酸氧化酶蛋白及其制备方法。

背景技术

[0002] 尿酸氧化酶(urate oxidase、尿酸酶、uricase，E.C.1.7.3.3) 是生物体内嗦吟降解代谢途径中的一种酶，催化尿酸氧化为溶解度更高的尿囊素，尿囊素的溶解度比尿酸高约10 倍，是更容易排泄的嘌呤代谢物。许多物种体内均发现有尿酸氧化酶，但在高等哺乳动物灵长类体内和人体缺乏此酶，因此尿酸是嘌呤代谢的终产物。尿酸及其盐类在水中溶解度很低，血液中积累过多会导致高尿酸血症，如果尿酸在软组织、关节、器官等处形成结晶而沉积，会导致疼痛性关节炎( 痛风)、毁形性尿酸沉积( 结节瘤) 和肾衰竭。

[0003] 现有的人尿酸氧化酶蛋白，由于在进化中编码人尿酸氧化酶氨基酸序列第33 位和第187 位的氨基酸基因序列发生了突变，产生了终止密码，使人尿酸氧化酶基因无法产生具有功能的尿酸氧化酶蛋白。

[0004] 随着经济的发展和人们生活水平的提高，高尿酸血症和痛风的发病率一直在上升。据美国国立卫生研究院NIH 的报道，痛风约占所有关节炎病例的5％，是一种最疼痛的风湿疾病，预计约500 万美国人患有痛风，其中50,000 ～ 70,000 名患者禁忌常规疗法或常规治疗无效。痛风是由结缔组织和关节中的针状尿酸结晶沉淀引起的，这些沉淀导致炎症性关节炎，从而引发关节肿胀、发红、发热、疼痛和僵硬，并对受疾病侵袭的关节造成损伤。另外肿瘤疾病及其治疗过程会引发高尿酸血症。高尿酸血症已经成为人类面临的又一代谢性疾病，寻找有效的治疗方法显得非常迫切。

[0005] 用于高尿酸血症和痛风治疗的药物首先是降尿酸药，适用于难治性痛风石性痛风治疗的药物一类主要是通过抑制黄嘌呤氧化酶而使尿酸生成减少的别嘌醇，另一类促进尿酸排泄的药物，如丙磺舒、苯磺唑酮和苯溴马龙多，但因患者存在大量痛风石或较严重的肾功能不全而不适于使用。不少患者对别嘌醇过敏、无效或不能耐受。近年来又有新型降尿酸药上市，非布索坦(febuxostat) ：是一种特异性黄嘌呤氧化酶抑制剂。非布索坦能在2 周内明显降低尿酸水平，近60％的患者能在3 个月内达到治疗目标，即血尿酸水平降到6mg/dl。该药不适合于肝功能损害患者，而对轻中度肾功能不全者安全有效。最常见的不良反应是肝功能异常、腹泻、头痛、恶心、呕吐、腹痛、头晕、关节痛和肌肉骨骼症状。

[0006] 有研究表明，尿酸氧化酶降低体内尿酸水平的幅度和速度远远优于其他药物，因此体内补充尿酸氧化酶是治疗高尿酸血症的最佳策略。目前临床上用的尿酸氧化酶来自黄曲霉菌，因有免疫原性，应用大受限制。某些来自于植物或者微生物的尿酸氧化酶更易溶解于医学上可接受的溶剂中。然而，注射微生物酶会很快引起免疫反应，这种免疫反应可能会导致致命的变态反应、使酶失活或者被迅速从血液循环中清除[Donadio，et al.，(1981) ；Leaustic，et al.，(1983)]。来源于哺乳动物( 包括猪和狒狒)、昆虫[ 如黑腹果蝇(Drosophila melanogaster) 和拟暗果蝇(Drosophila pseudoobscura)] 氨基酸序列的酶由于免疫原性和在生理pH 条件下不溶性问题，没有成为可用于临床的候选药物。中国专利申请99811738.2 公布了猪和狒狒的尿酸氧化酶序列嵌合的尿酸氧化酶，中国专利申请03109150.4 是一种重组假丝酵母尿酸氧化酶的制备方法，拉布立酶(rasburicase) 是基因重组的黄曲霉尿酸氧化酶，仍然具有免疫原性和发生过敏的可能性，不适合长期使用。

[0007] 不少人都考虑用修饰尿酸氧化酶以降低其免疫原性，但经修饰后催化活性大大下降，而且免疫原性却未能全消。美国风湿病学会(ACR)2005 年度会议发布的II 期观察研究结果显示，高血尿酸和难治性痛风患者经Savient 制药公司的试验药物聚乙二醇一尿酸酶治疗后，血尿酸浓度可持续显著降低，在已公布的II 期开放性标记试验的两个病例中，观察聚乙二醇- 尿酸酶治疗可溶解痛风石。虽然取得了疗效，但该公司开发的产品pegloticase 仍然有产生过敏反应的危险性。

[0008] 因此治疗高尿酸血症及长期用药治疗痛风需要免疫原性更低，安全性更高的尿酸氧化酶以降低过敏反应性和提高治疗的效果。

发明内容

[0009] 本分明的目的是提供一种人尿酸氧化酶蛋白，这种人尿酸氧化酶蛋白回复人尿酸氧化酶基因中的突变密码，将回复突变后的人尿酸氧化酶基因导入工程菌中实现人尿酸氧化酶基因的表达，产生具有酶活性的尿酸氧化酶蛋白。

[0010] 本发明所设计的人尿酸氧化酶蛋白，由SEQ ID NO.3 的氨基酸序列组成。

[0011] 作为优选，本发明所设计的人尿酸氧化酶蛋白包含在氨基末端或者羧基末端或者氨基和羧基末端两者截短1-20 个氨基酸的SEQ ID NO.3 的氨基酸序列。

[0012] 作为优选，本发明所设计的人尿酸氧化酶蛋白包含33 位、46 位、110 位、140 位、200位、220 位、240 位氨基酸置换的SEQ ID NO.3 的氨基酸序列。

[0013] 本发明所得到的人尿酸氧化酶蛋白，是人体自身应该进化产生的蛋白质氨基酸序列，最接近人体蛋白质序列，因此对人体的免疫原性是最低的。本发明所得到的人尿酸氧化酶蛋白，回复人尿酸氧化酶基因中的突变密码，将回复突变后的人尿酸氧化酶基因导入工程菌中实现人尿酸氧化酶基因的表达，产生具有酶活性的尿酸氧化酶蛋白。

[0014] 本发明所设计的一种核酸序列，编码上述的人尿酸氧化酶蛋白的核酸序列。

[0015] 本发明所设计的一种核酸序列，包含所述的核酸序列。

[0016] 作为优选，所述的核酸载体，所述的核酸载体的出发载体采用pET 系列载体、pPEPTIDE、pMAL-c2x、pGEX4T、pGEX5X、pGEX6P、pQE30、pTrcHisB、pTWIN、pBV220、pPICZα、pPIC9K、PGAPZα、pYES2/CT、Bacmid DNA、pcDNA3.1、pcDNA4.0 或EGFP。

[0017] 本发明所设计的一种宿主细胞，包含上述的核酸载体。本发明提供宿主细胞，该宿主细胞具有包含人尿酸氧化酶编码核酸的核酸载体，宿主细胞为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母、昆虫细胞或者动物细胞。本发明的人尿酸氧化酶蛋白可以直接在宿主细胞中表达，也可以通过翻译后加工修饰分泌到宿主细胞外，还可以以融合蛋白形式表达，再通过酶切加工获得人尿酸氧化酶蛋白。

[0018] 本发明所设计的一种制备上述人尿酸氧化酶蛋白的方法，包括宿主细胞表达所述核酸序列的培养条件下培养上述的宿主细胞步骤，以及分离纯化所表达的人尿酸氧化酶蛋白的步骤。

[0019] 本发明所设计的一种聚乙二醇人尿酸氧化酶蛋白结合物，它包含上述的人尿酸氧化酶蛋白，所述人尿酸氧化酶蛋白与聚乙二醇分子共价连接。

[0020] 作为优选，所述的人尿酸氧化酶蛋白的每个亚基包含2～12个聚乙二醇分子。

[0021] 作为优选，所述的聚乙二醇分子的分子量为5kd ～ 100kd。

[0022] 作为优选，所述的聚乙二醇分子经活化后与人尿酸氧化酶蛋白上氨基共价连接。活化聚乙二醇是单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯(mPEG-SS)、单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯(mPEG-SC)、单甲氧基聚乙二醇N- 羟基琥珀酰亚胺酯(mPEG-2-NHS)、单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺丙酸酸酯(mPEG-SPA)、单甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG-ALD)、Y 型聚乙二醇NHS 酯、Y 型聚乙二醇乙醛、葡萄糖聚乙二醇NHS 酯、半乳糖聚乙二醇NHS 酯、甲氧基聚乙二醇乙酸酯(mPEG-SCM)、甲氧基聚乙二醇碳酸酯(mPEG-SC)、单甲氧基聚乙二醇对甲苯磺酸酯(mPEG-Ots)、单甲氧基聚乙二醇对硝基苯酚碳酸酯(mPEG-OCOOPhNO2)、单甲氧基聚乙二醇五氟苯酚酯衍生物、α- 甲氧基- 聚乙二醇-ω- 氨甲基(mPEG-CH2NH2)、α- 甲氧基- 聚乙二醇-ω- 丙酸(mPEG-PA)、α- 甲氧基- 聚乙二醇-ω- 丁酸(mPEG-BA)、α- 甲氧基- 聚乙二醇-ω- 琥珀酰酯酸(mPEG-S)、α- 甲氧基- 聚乙二醇-ω- 琥珀酰酯酸琥珀酰亚胺酯mPEG-SS)、α- 甲氧基- 聚乙二醇-ω-[3-(3- 马来酰亚胺基-1- 氧丙基) 氨基]丙基醚(mPEG-PPMAL)。

[0023] 作为优选，所述的聚乙二醇分子经活化后与人尿酸氧化酶蛋白上巯基共价连接。活化聚乙二醇包括：甲氧基聚乙二醇巯醇(mPEG-SH)、甲氧基聚乙二醇巯酯(mPEG-VS)、Y 型聚乙二醇马来酰亚胺、单甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺(mPEG-MAL)。

[0024] 作为优选，聚乙二醇分子为分枝型或直线型。

[0025] 本发明所设计的一种药物组合物，该药物组合物包含上述的人尿酸氧化酶蛋白。

[0026] 本发明所设计的一种药物组合物，该药物组合物包含上述的聚乙二醇人尿酸氧化酶蛋白结合物。

[0027] 本发明所得到的人尿酸氧化酶蛋白及其聚乙二醇结合物，具有氧化分解尿酸的活性，可用于治疗高尿酸血症及由于高尿酸引起的疾病( 如痛风)。

附图说明

[0028] 图1、SDS-PAGE 分析重组人尿酸氧化酶蛋白的表达量。

[0029] 1、蛋白分子量Marker，从下往上分别为14.4、20、26、33、45、66.2、94kDa ；2、未诱导菌体全蛋白；3-10、诱导菌体全蛋白。

[0030] 图2、SDS-PAGE 分析人尿酸氧化酶蛋白的纯度。

[0031] 1-5、纯化重组人尿酸氧化酶蛋白；6、蛋白分子量Marker，从下往上分别为14.4、20、33、45、67、97kDa。

[0032] 图3、SDS-PAGE 分析人尿酸氧化酶蛋白的分子量。

[0033] 1、蛋白分子量Marker，从下往上分别为14.4、20.1、31、43、66.2、97.4kDa ；2、纯化重组人尿酸氧化酶蛋白。

[0034] 图4、SDS-PAGE 分析融合表达重组人尿酸氧化酶蛋白的表达量。

[0035] 1、蛋白分子量Marker，从下往上分别为14.4、20.1、31、43、66.2、97.4kDa ；2、未诱导菌体全蛋白；3-10、诱导菌体全蛋白。

[0036] 图5、重组人尿酸氧化酶蛋白大鼠体内药代动力学曲线。

[0037] 图6、聚乙二醇重组人尿酸氧化酶蛋白大鼠体内药代动力学曲线。具体实施例

[0038] 实施例一，人尿酸氧化酶基因和表达载体的构建

[0039] 人尿酸氧化酶基因的获得

[0040] 根据Genbank(NCBI Reference Sequence ：NR 003927.1)、GenBank ：S94095.1 和GenBank ：AH003594.1 公布的人尿酸氧化酶假基因序列拼接的人尿酸氧化酶假基因序列见SEQ IDNO.1。将SEQ ID NO.1 人尿酸氧化酶假基因第99 位的“A”和第561 位的“A”改为“G”得到人回复突变的人尿酸氧化酶基因，见SEQ ID NO.2。采用化学合成法合成人尿酸氧化酶基因，其编码的氨基酸序列见SEQ ID NO.3。先合成25 段互补的寡核苷酸片段，基因5’端片段加上Nde I 酶切位点，3’端引入BamH I 酶切位点，用T4 噬菌体多核苷酸激酶37℃处理30min，磷酸化的各寡核苷酸片段以等摩尔混合，94℃变性5min，立即65℃退火10min，然后加入T4 连接酶，16℃连接过夜( 精编分子生物学实验指南，第五版，奥斯伯等主编，金由辛等译校，2008 年，科学出版社)。

[0041] 用于人尿酸氧化酶基因PCR 扩增的合成寡核苷酸引物如下：

[0042] 5‘-TATACATATG GCCCACT ACCATAA(SEQ ID NO.4)

[0043] 5‘-TCTGGATCC TCACAGTCTTGAAGACA(SEQ ID NO.5)

[0044] 合成寡核苷酸片断连接过夜的产物加入100ul PCR反应体系中，再加入扩增引物，2mmol/L 的dNTP，10ul，10X 反应缓冲液10ul，Taq DNA 聚合酶5U。PCR 条件为94℃变性
1分钟，55℃退火1 分钟，72℃延伸3 分钟，35 个循环后，再72℃延伸10 分钟。电池检测扩增产物，大小约1000bp，与设计基因序列大小符合。产物经序列分析，与设计序列一致。
人尿酸氧化酶基因向pET 表达载体的克隆。

[0045] pET-22b 质粒用Nde I、BamH I 双酶切回收5500bp 大片段，PCR 扩增回收的人尿酸氧化酶基因片段用Nde I、BamH I 双酶切回收910bp 片段，将两个片断连接，20μL 反应体系基因片段与载体大片段的比例为10 ∶ 1，加T4DNA 连接酶300 单位，16℃连接过夜得到重组质粒pET-22b-rhUOX。

[0046] 实施例二，高表达宿主菌的获得

[0047] 将重组表达质粒pET-22b-rhUOX 转化进大肠杆菌宿主菌。制备转化用细菌细胞，包括挑取一个BL21(DE3) 菌落接种入3ml LB 培养基，37℃ 250rpm 振荡培养过夜；吸取.2ml入20ml LB 扩大培养，37℃ 250rpm 振荡培养至OD600 为0.4-0.6 ；无菌条件下将细菌转移至冰预冷的无菌50ml 试管中，冰上放置10 分钟以使培养物冷却至0℃ ；4℃下4000rpm 离心10 分钟，回收细菌；倒出培养液，将试管倒置1 分钟以使残留的培养基流尽；10ml 0.1mol/LCaCl2 重悬菌体沉淀，冰上静置10 分钟；4℃下4000rpm 离心10 分钟，回收细菌；倒出培养液，将试管倒置1分钟以使残留的培养基流尽；加入1ml 0.1mol/L CaCl2，重悬菌体，分装后保存于-70℃备用。

[0048] 取200μl 感受态细胞溶液于预冷试管中，加入5μl 连接DNA 溶液，轻轻旋转混匀后冰浴30 分钟；42℃热休克90 秒，立即移入冰浴中2 分钟，加入800μl LB，37℃200rpm振荡培养45 分钟；4℃下2500rpm 离心收集细菌，加入含氨苄青霉素(100μg/ml) 的LB200μl 重悬菌体；将20μl 和180μl 菌液分别涂布于LB/Amp 琼脂平板上，选择培养过夜；次日观察平板；挑取白色菌落，同时将相应的克隆培养于3ml LB/Amp 中，用于小量制备质粒和鉴定分析。

[0049] 氨苄青霉素做抗性筛选，得到阳性克隆pET-22b-rhUOX。提取质粒，用限制性内切酶进行鉴定。阳性转化子用通用引物进行序列分析，结果克隆序列与设计序列一致。

[0050] 实施例三，重组人尿酸氧化酶

[0051] 宿主菌的培养和诱导表达

[0052] 配制培养基：Trypton 10g/L、Yeast extract 5g/L、NaCl 5g/L，pH7.0。培养基配好后于121℃温度下湿热灭菌20min。灭菌结束后待培养基冷却不烫手时于超净台中加Amp使其终浓度为50μg/mL，冷却后置4℃冰箱中备用。

[0053] 种子培养：在超净台中无菌操作下挑取单菌落接种于20ml LB 培养基( 含Amp)中，然后置于37℃下，180rpm 摇床培养过夜。

[0054] 放大培养：从培养过夜的种子培养物取1ml 接种量转接于20ml LB 培养基中，剩余的种子培养物置于4℃冰箱中保存。放大培养转接物置于37℃下，180rpm 培养3 小时，培养液的OD600 约为0.8。然后往放大培养转接物中加入IPTG 至终浓度1.0mmol/L。将放大培养转接物都继续培养诱导5 小时，然后离心收集l 菌液(10,000rpm×1min)。

[0055] 取对照菌体和诱导菌体，先分别加入150微升蒸馏水，用移液枪吹吸，使菌体悬浮，然后分别加入150 微升平时常用的样品缓冲液(×2)，漩涡1min，离心6000rpm×0.5min，然后置于沸水中煮5min，室温下放置25min，然后离心6000rpm×1min，SDS-PAGE 分析表达量，结果见图1。

[0056] 人尿酸氧化酶的分离纯化

[0057] 收集菌体，进行超声破碎，然后收集上清和沉淀，用12％ SDS-PAGE 电泳分析，结果目标蛋白主要存在于破菌后的上清液中，根据电泳结果的条带分析，诱导全菌的目标蛋白的表达量应该在30％以上。将收集到的破菌上清液用离子交换层析法分离纯化，其过程为用pH 值为8.5 的20mmol/L Tris.CL 缓冲液稀释，使其电导率小于5mS/cm。用同样的缓冲液平衡DEAE 柱，上样后用平衡缓冲液洗至基线，用0.01 ～ 0.5mol/LD NaCL 梯度洗脱，收集目标蛋白峰，层析图谱见图3。

[0058] 将离子交换目标蛋白峰稀释后使目标蛋白的电导率小于5mS/cm，调样品pH 到4.5，用pH4.5 的Hac-NaAc 缓冲液平衡SP 柱，上样后用平衡缓冲液洗至基线，用0.01 ～
0.5mol/LDNaCL 梯度洗脱，收集目标蛋白峰。

[0059] 得到的SP 峰经Sephadex G-25 脱盐交换缓冲液，平衡液为20mmol/L PB，pH7.4。样品脱盐后即为高纯度的人尿酸氧化酶蛋白，SDS-PAGE 电泳分析结果见图2。

[0060] 实施例四，重组人尿酸氧化酶的分析

[0061] 分子量

[0062] 高度纯化的人尿酸氧化酶蛋白15％ SDS-PAGE 电泳分析，结果见图3，以标准蛋白分子量的对数对蛋白质迁移率制作标准曲线，根据标准曲线计算人尿酸氧化酶蛋白的分子量为34kd。

[0063] 等电点

[0064] 采用聚丙烯凝胶水平电泳进行测定，等电点标准的pH 范围为3-10，铺制胶板，凝胶聚合后直接点样40μg，以120V 15min，220V 10min，450V 60min 进行电泳。电泳完毕取出凝胶，置于固定液中浸泡固定，凝胶用双蒸水漂洗，然后染色液中染色40 分钟，再脱色直至蛋白条带显色完全。以阴极为原点，测定各标准蛋白带的迁移距离，等电点对迁移距离作出pH 梯度曲线图。测量蛋白质样品的迁移距离，从pH 梯度曲线图中求出蛋白质样品的等电点。人尿酸氧化酶蛋白的等电点为8.5。

[0065] N 末端序列分析

[0066] 用Edman 降解法进行人尿酸氧化酶蛋白的N 末端氨基酸序列分析，进行15 个循环，结果为：MAHYHNNYKKNDEVE

[0067] 酶活性分析

[0068] 用紫外分光光度法分析纯化后人尿酸氧化酶蛋白的酶活性，酶活性通过测定由尿酸氧化成尿囊素引起的292nm 吸光值的减少来确定。酶活性单位定义为：每分钟将1μmol尿酸氧化为尿囊酸所需的酶量为一个酶活性单位。酶比活性(U/mg) 以每毫克蛋白的酶活性单位数表示。

[0069] 在3ml 缓冲液体系中含尿酸0.18μmol，pH 8.9，30℃保温，检测波长292nm，加入1mg/mL 的酶1μL，反应结束后测吸收值，根据标准曲线计算酶分解的尿酸，蛋白质含量测定采用Lowry 法，计算酶比活性为13.1U/mg。

[0070] 实施例五，截断型人尿酸氧化酶的表达

[0071] 将含pET-22b-rhUOX 重组质粒的工程菌株进行平板纯化，挑取单菌落过夜培养后进行质粒的小量抽提。以提取质粒为模板，用以下引物(SEQ ID NO.6 和SEQ ID NO.7)PCR扩增获得截断型人尿酸氧化酶基因(SEQ ID NO.8)。

[0072] 5’CTTCGAATTCATGAACTATAAAA AGAATG(SEQ ID NO.6)

[0073] 5’AATT GCGGCCGCTCACAGTCTT GAA(SEQ ID NO.7)

[0074] 用EcoR I 和Not I 双酶切PCR 产物，连接至同样用E coR I 和No t I 双酶切的pPIC9K 载体中，转化大肠杆菌TGi 感受态细胞。提取质粒DNA，用EcoR I 和Not I 双酶切进行鉴定，筛选出含人尿酸氧化酶截短型基因的阳性重组克隆，命名为pPIC9K-rhUOX。用DraI 对重组表达质粒pPIC9K-rhUOX 和空载体pPIC9K 进行酶切线性化。依照Inv itrogen 公司说明书介绍的方法，用山梨醇制备酵母电击转化感受态细胞，将线性化的pPIC9K-rhUOX和pPIC9K 电击转化酵母菌GS115 菌株，涂MD 平板，倒置，30 培养48h。设置含不同浓度G418的YPD 培养基对在MD 平板中生长良好的酵母菌进行抗性筛选、再进行酵母重组子PCR 鉴定。鉴定好的阳性转化子单菌落分别点种至MM 平板和MD 平板以鉴定转化子的甲醇利用表型，即Mu t+ 表型( 甲醇利用正常型) 或Muts 表型( 甲醇利用缓慢型)。阳性整合子的诱导表达采用Muts 表型酵母诱导表达的方法，表达培养基为BMGY 和BMMY，分别挑取1 株阳性酵母整合子进行诱导表达，在诱导培养后的0，24，48，72，96，120 小时分别取样1mL，12000r/min 离心30s，收集上清液-20℃保存，备用。取各时间段上清液
20μL 与2X SDS-PAGE 上样缓冲液20μL 混匀，沸水煮5min 后进行SDS-PAGE 电泳，检测不同诱导时间目的蛋白的表达情况，结果表达产物分子量为约为32KD，酶比活性12.9IU/mg。

[0075] 实施例六，人尿酸氧化酶的融合表达

[0076] 合成以下引物：

[0077] 5’TATA GGA TCC GAC GAC GAC GAC AAG GCCCACT ACCATAA(SEQ ID NO.9)[0078] 5”TCT GAATTC TCA CAGTCTTGAAGACA(SEQ ID NO.10)

[0079] 碱裂解法小量提取质粒pET-22b-rhUOX，BamH、EcoR 双酶切，琼脂糖电泳回收目的基因。BamH I、EcoR I 双酶切质粒pGEX-2T，回收载体，T4DNA 连接酶于16℃连接，过夜，将连接产物转化到E.coli DH5，挑取单菌落，接种于含氨苄西林(Amp)100μg/mL 的LB 培养基，小量提取质粒双酶切进一步鉴定。将重组质粒转化到E.coli BL21(DE3)，得到基因工程表达菌BL21(DE3)/pGEX2rhUOX，从平板上挑取单菌落，接种于2×YT 液体培养基100mL中，Amp 浓度为100μg/mL，，200r/min，37℃培养至A600 约为0.6。然后将带有重组质粒的宿主菌BL21、阴性对照BL21 和空质粒按1％的浓度接种到2×YT 培养基3mL 中，Amp 浓度为100μg/mL。37℃，200r/min 振荡培养至菌液的A600 为1.0 左右，加IPTG 至终浓度为1mmol/L，25℃诱导表达15h。将诱导表达后的培养物离心，收集菌体，用12％ SDS2PAGE 电泳检测，结果见图4。

[0080] 实施例七，聚乙二醇修饰重组人尿酸氧化酶

[0081] 将活化聚乙二醇NHS 酯(mPEG 10000)250mg 与50mg(2.5mg/ml) 纯化的人重组尿酸氧化酶蛋白溶于硼酸缓冲液(0.1mol/L，pH 9.2) 中，在常温下磁力搅拌反应4h，加入甘氨酸终止反应。4℃下磷酸缓冲液(0.05mol/L，pH 8.0) 中透析24h( 透析袋截留分子质量10000Da)，得到修饰的mPEG- 人重组尿酸氧化酶。

[0082] TNBS 法测定酶的平均氨基修饰率，Lowry 法测定蛋白浓度。修饰率(％ ) ＝ (1- 修饰后的A258 值/ 修饰前的A258 值)×100％。

[0083] 实施例八，不同分子量聚乙二醇修饰人尿酸氧化酶

[0084] 分别将分子量为5000、10000、20000 和40000Da 的活化聚乙二醇NHS 酯250mg 与50mg(2.5mg/ml) 纯化的人重组尿酸氧化酶蛋白溶于硼酸缓冲液(0.1mol/L，pH 9.2) 中，在常温下磁力搅拌反应4h，加入甘氨酸终止反应。4℃下磷酸缓冲液(0.05mol/L，pH8.0) 中透析24h 得到修饰的mPEG- 人重组尿酸氧化酶。

[0085] 对修饰产物进行酶活性分析，结果分子量为5000、10000、20000 和40000Da 的活化聚乙二醇NHS 酯修饰的人尿酸氧化酶的酶比活性分别为8.2IU/mg、7.0IU/mg、5.4IU/mg、3.7IU/mg。

[0086] 实施例九，不同的活化聚乙二醇修饰人尿酸氧化酶

[0087] 用分子量为10000 的活化单甲氧基聚乙二醇NHS 酯修饰重组人尿酸氧化酶，将聚乙二醇NHS 酯250mg 与50mg(2.5mg/ml) 纯化的重组人尿酸氧化酶蛋白溶于硼酸缓冲液(0.1mol/L，pH 9.2) 中，在常温下磁力搅拌反应4h，加入甘氨酸终止反应。4℃下磷酸缓冲液(0.05mol/L，pH 8.0) 中透析24h 得到单甲氧基聚乙二醇NHS 酯修饰的mPEG- 重组人尿酸氧化酶。测定酶比活性为6.7IU/mg，Lowry 法进行蛋白质含量的测定。

[0088] 用分子量为10000 的单甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺修饰重组人尿酸氧化酶，将单甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺250mg 与30mg(2.0mg/ml) 纯化的重组人尿酸氧化酶蛋白溶于Bicine 缓冲液(0.1mol/L，pH 7.5) 中，在室温下磁力搅拌反应24h。4℃下磷酸缓冲液(0.05mol/L，pH 8.0) 中透析24h 得到单甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺修饰的mPEG- 重组人尿酸氧化酶。测定酶比活性为5.3IU/mg，Lowry 法进行蛋白质含量的测定。

[0089] 实施例十，人尿酸氧化酶的动物体内药代动力学

[0090] 以大鼠为试验动物进行重组人尿酸氧化酶和聚乙二醇修饰的重组人尿酸氧化酶动物体内药代动力学研究，大鼠股静脉注射以生理盐水溶解人尿酸氧化酶样品，按1.0mg/kg 剂量给药，注射体积为10ml/kg 体重，每组6 只大鼠，重组人尿酸氧化酶组每只动物在注射前及注射后1、10、30、45、60min 从颈动脉取血，每次0.6ml，共6 次。聚乙二醇修饰的重组人尿酸氧化酶组在注射前及注射后1、10、30、60min 及1.0、4.0、8.0、16、24、48 及72h 从颈动脉取血，每次0.6ml，共6 次离心取血清。血清样品于4℃保存至该动物样品全部收集完毕后立即检测或-20℃保存1 周内检测。每份血清样品均进行尿酸氧化酶酶活性的测定，根据酶比活性换算成酶蛋白质含量，结果见图5 四和图6。