一种猪用亚洲I型口蹄疫病毒灭活疫苗佐剂及制备方法

摘要

本发明涉及一种猪用亚洲I型口蹄疫病毒灭活疫苗的佐剂及制备方法，这种佐剂中有重组猪白介素2（PorcineInterleukine-2，pIL-2）。本发明的猪用亚洲I型口蹄疫病毒灭活疫苗佐剂是由猪白介素2被一种脂质基质和乳化剂包裹构成的粒径为50-1000nm的纳米颗粒。

权利要求

1.一种猪用亚洲I型口蹄疫病毒灭活疫苗佐剂的制备方法，其特征在于将100mg的氢化蓖麻油和20mg的聚乙丙交脂溶于1mL的三氯甲烷中作为有机相，将该有机相加热到

30-40℃；纯化后的pIL-2蛋白溶于pH=8的磷酸缓冲液中，使终浓度为20mg-50mg/ml；取

200µL的前述液体为水相，然后在充分搅拌条件下把水相缓慢加入到前述的有机相中，冰浴中超声形成（w/o）相的乳液，将制备的乳液加入到5mL的质量百分比为1%的聚乙烯醇水溶液中，进一步乳化形成（w/o/w）相的乳液，再在室温下充分搅拌，使有机溶剂完全挥发，固化得到聚合物纳米粒分散体系，加入5-10倍体积的灭菌水收集纳米粒，并用3～5mL的蒸馏水重悬，冷冻干燥获得所要的佐剂。

2. 权利要求1的制备方法制备的猪用亚洲I型口蹄疫病毒灭活疫苗佐剂。

说明书

一种猪用亚洲I型口蹄疫病毒灭活疫苗佐剂及制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种疫苗用佐剂，特别是一种兽用疫苗的佐剂。确切讲本发明涉及一种猪用亚洲I型口蹄疫病毒灭活疫苗的佐剂及制备方法，这种佐剂中有重组猪白介素2（Porcine Interleukine-2，pIL-2）。

背景技术

[0002] 佐剂是一种先与抗原或与抗原混合后同时注入到人或动物体内，能够增强机体对该抗原的特异性免疫应答，发挥辅助作用的物质。佐剂是疫苗的主要组成成分，在疫苗的质量提高和改进中扮演着重要的作用。

[0003] 白介素2（Interleukine-2，IL-2）是一种多种功能的细胞因子，能够通过自分泌或旁分泌形式作用于一些细胞的表面，从而启动机体内细胞的信号通路，发挥免疫调节作用。IL-2是由T细胞产生的多功能的活性糖蛋白，能够促进T、B淋巴细胞的增殖；增强细胞毒T细胞的杀伤活性；促进免疫球蛋白的产生；刺激许多免疫细胞产生多种细胞因子；能够增强机体的细胞和体液免疫应答。近年来研究表明，IL-2可提高机体对疫苗的免疫应答和控制疾病的发生。可应用于多种疫苗中作为免疫增强剂，如猪口蹄疫疫苗、流感疫苗、狂犬病疫苗、疱疹病毒疫苗等。国外学者报道了单次或多次注射重组牛IL-2对BHV-1副流感病毒二联苗及牛病毒腹泻病毒苗的作用，结果表明单次或多次注射均可增强两种疫苗的免疫效果，但是多次注射效果会更好。这些研究表明重组IL-2作为疫苗分子佐剂，不仅能够高效特异地调节机体对疫苗的反应，而且可调节体液和细胞免疫应答（lofthouse S A, et al,1996）。然而重组蛋白用于疫苗佐剂也存在以下的缺点：半衰期较短，易受内外环境的影响而活性降低，需要多次注射；另外，一次性大剂量的使用还可导致发热、炎症等副作用，这都给细胞因子重组蛋白在临床实践应用中带来不便。

发明内容

[0004] 本发明提供一种含有重组猪白介素2的猪用亚洲I型口蹄疫病毒灭活疫苗佐剂，本佐剂克服现有重组pIL-2作为疫苗佐剂的不足，而且具有安全、高效、廉价的优点；同时提供一种这种佐剂的制备方法。

[0005] 本发明的一种猪用亚洲I型口蹄疫病毒灭活疫苗佐剂，这种佐剂是由猪白介素2被一种脂质基质和乳化剂包裹构成的粒径为50-1000nm的纳米颗粒。

[0006] 本发明的猪用亚洲I型口蹄疫病毒灭活疫苗佐剂所用的脂质基质为氢化蓖麻油，所用的乳化剂为聚乙丙交脂和聚乙烯醇，所用的猪白介素2为酵母表达系统表达的重组蛋白。

[0007] 本发明的猪用亚洲I型口蹄疫病毒灭活疫苗佐剂是由10重量份的氢化蓖麻油和2重量份的聚乙丙交脂包裹0.5-1重量份的重组pIL-2。

[0008] 本发明的佐剂可用于亚洲I型口蹄疫病毒灭活抗原混合物构成的亚洲亚洲I型口蹄疫病毒灭活疫苗。

[0009] 本发明的佐剂的制备方法采用了复乳溶剂挥发法制备。一种具体的制备方法是：将100mg的氢化蓖麻油和20mg的聚乙丙交脂溶于1mL的三氯甲烷中作为有机相，将该有机相加热到30-40℃；纯化后的重组pIL-2溶于pH=8的磷酸缓冲液中，使终浓度为20mg-50mg/ml；取200µL的前述液体为水相，然后在充分搅拌条件下把水相缓慢加入到前述的有机相中，冰浴中超声形成（w/o）相的乳液，将制备好的该乳液加入到5mL的1%的聚乙烯醇水溶液中，进一步的利用乳化仪乳化形成（w/o/w）相的乳液，再在室温下充分搅拌，使有机溶剂完全挥发，固化得到聚合物纳米粒分散体系，加入5-10倍体积的灭菌水收集纳米粒，并用3～
5mL的蒸馏水重悬，冷冻干燥获得所要的佐剂。

[0010] 本发明实际上是一种固体脂质纳米粒（Solid Lipid Nanoparticle，SLN）。SLN是一类以固态天然或半合成类酯（如卵磷脂）、脂肪酸（如硬脂酸）或甘油三脂等广义脂质为载体原料，利用不同方法制成粒径为50-1000nm的固态胶粒给药体系。与脂质体和微乳相比目前的产物由于被包封于SLN的固体骨架中而实现了更好的控释和缓释效果；其最突出的优点在于它具有固态基质，这样可以保护化学性质不稳定的物质不被分解破坏，并可以调节药物的释放。由于在制备过程中蕴含了大规模生产的基础，使SLN更具有吸引力。 [0011] 本发明与现有技术相比，具有明显的特点和优势：首先，按本发明制造的SLN-pIL-2新型纳米佐剂是一种粒径在300-500nm的类球形粒子，其中既含有重组pIL-2，也含有脂质材料及聚合物聚乙丙交脂, 这些材料也可发挥一定佐剂效应。其次，该纳米佐剂的重组pIL-2被包裹在脂质核内从而保护其免受外界环境的影响而降解。此外，脂质材料和聚合物聚乙丙交脂可在体内生物降解，而使包裹的重组pIL-2持续的缓慢释放，起到微量长期作用于机体免疫相关细胞，从而提高其免疫佐剂效应，同时也避免了大量一次性释放所引起的毒副作用。最后，制备这种纳米佐剂过程简单易行，而且所用的材料价格低廉，因此成本也较低。

[0012] 对于新型的SLN-pIL-2纳米佐剂，可以缓慢释放被包裹的pIL-2，且具有较低毒副作用，且免疫佐剂效应明显的提高：具体表现在（1）用制备的SLN-pIL-2加入到BHK细胞中，当浓度达到7.5mg/mL时作用24h时后，其细胞生长状态良好；（2）在体外可以持续释放12d以上；（3）与猪用亚洲I型口蹄疫病毒灭活抗原配伍制备疫苗，免疫小鼠后，与未包裹的重组pIL-2相比较，既可提高特异性抗体的水平，也可促进小鼠脾淋巴细胞的增殖以及干扰素的分泌，包裹后的pIL-2可达到完全弗氏佐剂的效果。

[0013] 本发明中将重组pIL-2包裹于SLN中(即SLN-IL-2)，以脂质纳米粒作为载体以便保护重组蛋白在体内不被快速降解，提高了重组pIL-2的免疫佐剂效果，延缓其释放，从而提高其免疫佐剂效果，同时本发明的佐剂还具有毒性低的优点。

附图说明

[0014] 图1、利用透射电镜观测纳米粒的粒径大小。

[0015] 图2、在BHK细胞中检测SLN-pIL-2和 SLN的毒性实验曲线。

[0016] 图3、包裹pIL-2的粒子在体外释放pIL-2的检测曲线。

[0017] 图4、免疫脾淋巴细胞IFN-γ的分泌水平图。

[0018] 图5、免疫脾淋巴细胞中IL-4的分泌水平图。

[0019] 图6、流式细胞仪检测脾淋巴细胞增殖反应能力图。

具体实施方式

[0020] 本发明的实例分成2个部分完成，实例一：含有重组猪白介素2固体脂质纳米粒的制备特征表征；实例二 ：制备的纳米粒作为亚洲I型口蹄疫病毒灭活抗原的佐剂构成的疫苗免疫效果试验。

[0021] 实例一：重组猪白介素2固体脂质纳米粒的制备特征表征

[0022] 1．1固体脂质纳米粒的制备及特征与表征

[0023] 通过采用复乳溶剂挥发法制备过程如下：称取100mg氢化蓖麻油和20mg的PLGA溶于1mL的三氯甲烷中作为有机相，并将该有机相加热到30-40℃；将纯化的IL-2蛋白溶解在PBS中（pH=8），取200µL的作为水相；然后把水相缓慢加入到有机相中，边加边用磁力搅拌器搅拌，在冰浴中超声50s（300w）及形成（w/o）形式的乳液；将制备好的该乳液加入到5mL的1%的聚乙烯醇（PVA）水溶液中，进一步的利用乳化仪乳（rpm3000,1min）乳化化形成（w/o/w）相的乳液，并在显微镜下观察乳化为均匀分布的液滴；再在室温下利用磁力搅拌器充分搅拌6-8h，使有机溶剂完全挥发，固化得到聚合物纳米粒分散体系；加入30～50mL灭菌水（12000rpm，离心1h，4℃）收集纳米粒，并用3～5mL的蒸馏水重悬，然后利用冷冻干燥仪冻干。

[0024] 空的SLN微球利用200µL的PBS代替含有重组pIL-2的水相，其他制备方法一样。 [0025] 1.1.1利用透射电镜观察粒子的形状，利用纳米粒度仪测定其粒径。 [0026] 制备好的固体脂质纳米粒体的电镜照片见图1，由图可见所制备的含有pIL-2的纳米粒为类球形，通过纳米粒度仪测定其粒径为300-500nm之间。

[0027] 1.1.2固体脂质纳米粒体外毒性的检测

[0028] 体外毒性的测定采用四唑盐比色法（MTT）法。采用BHK细胞，用含有10%的胎牛4
血清完全培养基以2×10 个/孔的浓度接种于96孔板中，每孔体积为100µL，预培养细胞生长18-22h后，含有IL-2固体脂质纳米粒的悬混液及空白对照培养基（浓度分别为），培养
24h后，观察细胞的形态，之后每孔加入MTT溶液20µL，然后孵育4h后加入DMSO溶解，利用酶标仪在570nm处测定吸光度。

[0029] 将本发明的SLN-pIL-2纳米粒用培养基稀释后处理细胞，不同稀释度的SLN-pIL-2处理细胞24h后，细胞的形态与正常对照组无显著差异，即纳米粒达到7.5mg/mL时细胞的形态仍然良好，而且存活率仍然达到98%左右。而根据MTT测定细胞的生长情况发现，不同稀释度的空SLN纳米粒和SLN-pIL-2纳米粒处理细胞后的OD值与未处理细胞的比较，发现即使纳米粒浓度在7.5mg/mL时其与细胞对照的差异不显著，这也说明本发明的固体脂质颗粒具有良好的生物相容性，无毒副作用，参见图2。

[0030] 1.1.3固体脂质纳米粒体外释放特性的研究

[0031] 取制备的SLN -pIL-2 20mg，溶于300µL 的0.1M的PBS中，然后在37℃摇床上150rpm振摇12h后，12000rpm离心30min，沉淀继续加入相同量的PBS振摇，不同时段离心取上清重复前面的步骤，利用BCA试剂盒测定所取上清的A570值，计算释放pIL-2的百分数，绘制释放曲线。

[0032] 包裹pIL-2的粒子在体外释放pIL-2的检测（依据所测的A570值计算释放蛋白占包裹蛋白的百分数绘制）曲线表明，粒子在初始的48h释放的pIL-2较多，占总蛋白约40%多，随后逐渐降低，到后期释放的量达稳定，且持续到12d时仍然在释放，因此说明该粒子起到缓慢释放的效果，参见图3。

[0033] 实例二 ：制备的纳米粒作为亚洲I型口蹄疫病毒灭活抗原的佐剂构成的疫苗免疫效果试验

[0034] 2.1 材料与方法

[0035] 2.1.1 疫苗的制备

[0036] 本发明中的受试疫苗由前述实施例制备的含有重组pIL-2纳米粒（SLN-pIL-2）、空SLN、重组pIL-2、以及市场购买的完全弗氏佐剂（FCA）作为不同的佐剂与亚洲I型FMDV病毒灭活抗原（以下试验中简称Ag，由农威特生物科技股份有限公司提供)震荡混合后制备含有不同佐剂的疫苗，加入的佐剂与抗原的体积比为1：1。

[0037] 2.1.2 试验动物与免疫

[0038] 60只6~8周龄的雌性BALB/c小鼠购自兰州生物制品研究所实验动物中心，经检测FMDV抗体阴性。每组10只 共分为SLN-pIL-2+Ag疫苗组、重组pIL-2+Ag疫苗组、Ag+SLN疫苗组、单一Ag组、Ag+ FCA疫苗组、PBS对照组，将2.1.1中制备好的不同佐剂的疫苗在0天和14天小鼠大腿两侧肌肉注射免疫，二免后不同的时间尾静脉采血，间接ELISA法检测特异性抗体滴度。

[0039] 通过间接ELISA方法测定小鼠体内针对亚洲I型FMDV疫抗体水平，结果显示在二次免疫后的第2周至第9周，以SLN-IL-2作为佐剂的疫苗组的抗体水平明显高于未包裹的重组pIL-2作为佐剂的疫苗组组以及抗原对照组，尤其是在第2、3、5、9周。该实验结果表明以制备的SLN-IL-2作为佐剂能非常显著的提高亚洲I型口蹄疫病毒灭活疫苗的抗体水平，参见表1。

[0040] 2.1.3免疫脾淋巴细胞细胞因子含量的检测

[0041] 试验组小鼠颈椎脱臼处死，在70%乙醇中浸泡3分钟，取出小鼠置于无菌培养皿上，无菌取出红色长条状的脾脏；用眼科剪将脾脏剪碎置200目的不锈钢网上，用注射器内芯轻轻研磨脾脏，然后用PBS或者无血清的1640培养基冲洗细胞；将获得的脾细胞悬液用淋巴细胞分离液分离（淋巴细胞分离液与脾细胞悬液体积比为3：4），然后2500 rpm离心15分钟；中间出现一层白色的膜状夹层，轻轻地用吸管吸取置于另一新的离心管中；加入PBS轻轻混匀，然后1500 rpm离心5分钟；弃去上清，重复上述步骤2次；离心管内加入RPMI1640不完全培养液后，取一定量胎盘蓝染色并在显微镜下计数，并调整细胞的浓度为7
1×10/mL。

[0042] 取上述制备好的小鼠脾淋巴细胞加入在96孔细胞培养板中，每孔加入100 μL细胞悬液；实验组和对照组各设3个重复孔，其中每孔加口蹄疫抗原10 μL作为实验组；加RPMI1640 10 μL作为空白对照组；加PHA至终浓度为5 μg/mL作为阳性对照组, 在5% CO2培养箱中37℃培养，于48 h收集上清。用小鼠的IFN-γ、IL-4ELISA试剂盒检测脾细胞分泌IFN-γ和IL-4的含量。

[0043] 二次免疫后的14d，通过ELISA试剂盒检测脾淋巴细胞中IFN-γ分泌量，结果表明，SLN-pIL-2作为佐剂的疫苗组能有效地诱导免疫脾细胞分泌IFN-γ，高达1385.86±77.113 pg/mL，明显高于未包裹重组pIL-2 作为佐剂的疫苗组而且是该组的4倍，差异显著（p＜0.05）；并且是单一抗原组的10倍和SLN+Ag组的4倍以上，参见图4。而IL-4仅达到10.12pg/mL是抗原对照的2.1倍，也高于未包裹重组pIL-2 作为佐剂的疫苗组，但是差异不显著（p＞0.05），参见图5。这些表明重组pIL-2被包裹入SLN形成的纳米粒作为疫苗佐剂主要促进Th1型免细胞因子分泌，明显提高细胞免疫应答。 [0044] 2.1.4 免疫脾淋巴细胞增殖反应

[0045] 取上述制备好的实验组小鼠脾淋巴细胞2×105/每个样本，在37 ℃条件下，用终浓度为5 μM CFSE避光染色10 min；加入冰冷的PBS或者是胎牛血清终止反应2 min，1500 rpm 离心5 min后，弃上清；用PBS洗2次，加入1mL 的完全培养基将每个不同的样品在24孔细胞培养板培养，实验组和对照孔各设3个重复孔；在实验组中加10 μL口蹄疫灭活抗原，阳性对照组中加入ConA 至终浓度为5 μg/mL，37 ℃，5 % CO2 培养48 h；1500 rpm，5 min离心收集细胞，PBS洗2次加入300 μLPBS或不完全培养液重悬细胞，用流式细胞仪检测分析。用流式细胞仪检测免疫脾淋巴细胞被抗原再次刺激的增殖情况。每个处理样本检测10 000个细胞，统计新增殖脾淋巴细胞数占总细胞的比率。

[0046] 流式细胞技术检测免疫后的14d的脾淋巴细胞增殖结果， SLN-pIL-2作为佐剂疫苗组的增殖百分率高达7.0±0.84%，约为重组pIL-2 作为佐剂的疫苗组（2.6±0.14%）的2.5倍且差异显著（p＜0.05），但是与完全弗氏佐剂疫苗组相比差异不显著。这些表明SLN-pIL-2粒子作为疫苗佐剂，能够提高pIL-2的促淋巴细胞的增殖应答，达到了FAC佐剂的水平，参见附图5。

[0047] 本发明的相关实验结果分析表明包裹后的SLN-IL-2粒子作为佐剂与重组pIL-2相比，前者不仅能够显著增强小鼠抗亚洲I型口蹄疫抗原的体液免疫应答，而且也可以促进细胞免疫应答，而且与市售的FCA差异不显著，达到了该佐剂的水平；并且其毒性和价格都低于FCA。在特异性抗口蹄疫抗体水平方面利用SLN-IL-2作为疫苗佐剂组明显高于未包裹的IL-2蛋白作为疫苗佐剂组以及抗原对照组。在细胞免疫应答方面，IFN-γ是由Th1型细胞分泌的主要介导细胞免疫应答因子，也是产生Th1型免疫应答的主要标志；IL-4是Th2型细胞分泌的介导体液免疫应答的因子，二者在细胞因子网络中有重要的作用。而利用SLN-IL-2作为疫苗佐剂能够促进IFN-γ细胞因子的分泌，约是未包裹pIL-2佐剂组的4倍，是抗原对照组的10倍；而在IL-4分泌方面SLN-IL-2作为疫苗佐剂只是略高于未包裹pIL-2佐剂组， 这些显示了包裹后的pIL-2纳米粒佐剂能够促进细胞免疫应答而且主要以Th1型应答为主。促进T淋巴细胞增殖应答也是体液免疫应答的指标之一，SLN-pIL-2+Ag作为佐剂的疫苗组的增殖百分率也明显高于未包裹的IL-2蛋白作为疫苗佐剂组以及抗原对照组，这也反映了通过包裹后的pIL-2作为佐剂能够进一步的提高机体细胞免疫应答水平。总之，通过利用甘油脂氢化蓖麻油， PLGA等材料，以及溶剂乳化蒸发法将pIL-2包裹其内，可以提高其佐剂效应。

[0048] 表1间接ELISA免疫小鼠血清中特异性抗体水平OD490值（x±S） [0049]

[0050] 当SLN-pIL-2+Ag 与Ag ,PBS组相比时差异显著（P<0.05 ）标记为a[0051] 当SLN-pIL-2+Ag 组与重组p IL-2 +Ag, SLN+Ag组表差异显著时标记为b（p<0.05）