大肠癌特异性抗原肽及大肠癌检测试剂盒

摘要

本发明公开了一种大肠癌特异性抗原肽、大肠癌特异性抗原肽的表达载体以及制备方法，包含表达载体的大肠癌特异性自身抗体酶联免疫检测试剂盒及其操作方法。利用噬菌体将大肠癌cDNA文库展示到噬菌体表面，并经亲和筛选和血清学分析从中筛选出大肠癌特异性抗原肽的表达载体，作为主要组分，与阴性对照、酶标板、显色剂及终止液等构成检测试剂盒。本发明的大肠癌特异性抗原肽的表达载体，有效表达大肠癌特异性抗原肽，包被在酶标板上，具有检测大肠癌病人血清中由于肿瘤刺激所产生的自身抗体的能力，从而达到早期检测和筛选大肠癌病人的目的。

权利要求

1.一种大肠癌特异性抗原肽，其特征在于，所述大肠癌特异性抗原肽的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

2.一种用于表达权利要求1所述的大肠癌特异性抗原肽的表达载体，其特征在于，由T7噬菌体和编码大肠癌特异性抗原肽的cDNA片段构成，所述cDNA片段的序列如SEQ ID No.3所示。

3.一种大肠癌特异性自身抗体酶联免疫检测试剂盒，包括T7TAILER单克隆抗体、酶标板、阴性对照、酶联物、显色剂A和显色剂B、终止液，其特征在于，所述试剂盒还包括5个大肠癌特异性抗原肽的表达载体，所述5个大肠癌特异性抗原肽的表达载体均由T7噬菌体和编码大肠癌特异性抗原肽的cDNA片段构成，所述cDNA片段的序列分别如SEQ IDNo.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9所示，且所述阴性对照为空噬菌体，所述酶联物为HRP耦联的山羊抗人IgG。

说明书

大肠癌特异性抗原肽及大肠癌检测试剂盒

[0001] 本申请是中国专利申请号为201010275415.1、申请日为2010年9月7日、发明名称“大肠癌特异性抗原肽及大肠癌检测试剂盒”的分案申请。

技术领域

[0002] 本发明涉及医用检测试剂技术领域，涉及一种大肠癌特异性抗原肽的表达载体及构建方法、大肠癌特异性自身抗体酶联免疫检测试剂盒及操作方法。

背景技术

[0003] 大肠癌是常见的恶性肿瘤之一，其全球发病率位于第三，在我国则有逐年上升的趋势，在上海已位居恶性肿瘤发病率第二位。根据中国卫生部卫生信息2007年统计数据表明，发病率占全部恶性肿瘤的第3位，大肠癌死亡率为10.25／10万，占癌症致死第5位。大肠癌根据TNM分期不同可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期，各期大肠癌预后相差很大，早期大肠癌复发及转移率低，预后良好，术后5年生存率可达97%，进展期大肠癌术后5年生存率仅为40%-50%。因此探索大肠癌早期诊断和筛查方法非常重要。

[0004] 目前常用的大肠癌检查方法有直肠指诊、粪便隐血实验、结肠镜及影像学检查。而这些检查都存在有不足之处，直肠指诊范围局限，粪隐血实验敏感性及特异性差，结肠镜检查有一定痛苦，患者较难接受，影像学检查对于早期肿瘤不敏感。目前常用的肿瘤标志物如癌胚抗原（CEA），CA19-9等指标缺乏敏感性及特异性，不能对大肠癌进行早期诊断。因此建立能高通量诊断大肠癌的特异检查方法是当务之急。

发明内容

[0005] 肿瘤发生后，肿瘤细胞表面的特征抗原或肿瘤细胞分泌的特征抗原刺激机体产生抗体，这些抗体可存在于尚无症状的早期肿瘤患者血清中。通过寻找大肠癌特征抗原，利用它来检测患者血清中的特异性自身抗体，从而做为分子标志，可以早期发现大肠癌,与现行的其他方法相比,具有微创、简单、经济、敏感度及特异度高等特点,方便用于社区人群的筛查,从而达到早期检测大肠癌的目的。

[0006] 本发明的第一个目的在于提供一种大肠癌特异性抗原肽，利用它来检测患者血清中的特异性自身抗体，从而作为分子标志来早期发现大肠癌。

[0007] 本发明的第二个目的在于提供一种大肠癌特异性抗原肽的表达载体。

[0008] 本发明的第三个目的在于提供该表达载体的构建方法。

[0009] 本发明的第四个目的在于提供包含表达载体的大肠癌特异性自身抗体酶联免疫检测试剂盒，用于检测早期大肠癌。

[0010] 本发明的第五个目的在于提供该试剂盒的制备及其操作方法。

[0011] 本发明提供的大肠癌特异性抗原肽，其氨基酸序列如SEQ ID No.2、SEQ IDNo.4、SEQ ID No.6、SEQ ID No.8，或SEQ ID No.10所示。

[0012] 本发明提供的大肠癌特异性抗原肽的表达载体，由噬菌体和编码大肠癌特异性抗原肽的cDNA片段构成，所述cDNA片段的序列如SEQ ID No.1、SEQ IDNo.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7或SEQ ID No.9所示。优选的，所述噬菌体为T7噬菌体。

[0013] 本发明提供的大肠癌特异性抗原肽表达载体的构建方法，包括：

[0014] a）构建大肠癌噬菌体展示肽库：

[0015] 抽提30例新鲜大肠癌组织总RNA，等量混合成1mg后抽提mRNA，应用oligodT引物反转录为cDNA，将cDNA末端进行平齐，加EcolⅠ和Hind III接头，双酶切后去除小片断，然后接入T7噬菌体双臂，进行体外包装，构建大肠癌噬菌体展示肽库；

[0016] b）亲和筛选大肠癌特异抗原肽：

[0017] 取10μl A/G的琼脂糖珠置于一1.5ml 离心管中，用pH7.4的500μl PBS洗2次，1%BSA4℃封闭1h，琼脂糖珠分别与15μl大肠癌患者及对照患者的血浆4℃孵育过夜，500μl PBS洗涤3次后，用10μl PBS溶解富集到的抗体，10管大肠癌的抗体及10管非大肠癌的抗体各自合并成一管，取所述噬菌体展示肽库扩增液20μl，先与20μl的非大肠癌抗体孵育1h，未结合的上清再与20μl大肠癌抗体结合，保留结合到琼脂糖珠上的噬菌体，并用100μl 1%SDS洗脱，将其转染细菌至扩增，完成一轮亲和筛选，重复上述步骤，反复进行五轮亲和筛选；

[0018] c）血清学筛选大肠癌早期检测分子标志：

[0019] c1）混合血样初筛：

[0020] 筛选后得到的噬菌体展示肽库用LB液体培养基1:108稀释后，取100μl噬菌体液、250μl新摇好的BLT5403细菌，3ml保温55℃的顶层琼脂，混匀后立刻倒入铺有LB的平皿中，冷却后，37℃温箱孵育4小时，可见有单个的噬菌斑形成，每1个1.5ml 离心管中，加入1ml 新摇好的细菌BLT5403，随机挑取单个的、边界清晰的噬菌体于1个1.5ml 离心管中，共随机挑选噬菌体克隆2000个，并按顺序编号，挑好的噬菌体置37℃恒温振荡器摇4小时以上，直至每一管液体均变澄清为止，挑选好的噬菌体克隆置4℃保存，用T7引物进行PCR反应，扩增所挑选噬菌体克隆的插入片段，挑取扩增片段200bp以上的噬菌体克隆进行ELISA实验进一步筛选；

[0021] 所述ELISA实验的步骤为：

[0022] 将T7TAILER 抗体用pH7.4的PBS按1：1000来稀释，每孔取100μl包被于96孔酶标板，4℃摇床轻摇过夜；

[0023] 用洗液洗板，每孔300μl，洗四次，每次约1分钟，拍干；采用200μl 2%BSA/PBS于26℃封闭2小时；

[0024] 用洗液洗板，每孔300μl，洗四次，每次约1分钟，拍干；加入用1%BSA以1：5比例稀释的噬菌体100μl，每个标本加4孔；每次试验均加入没有插入片段的空噬菌体作为阴性对照4孔和空白对照2孔，室温孵育2小时，弃去孔内液体，拍干；

[0025] 每个噬菌体标本加入100μl 1%BSA以1：500比例稀释的大肠癌组混合血浆、对照组混合血浆各2孔，所用大肠癌组、对照组的混合血浆的患者信息同步骤b）亲和筛选所用的患者，室温孵育1小时；

[0026] 洗板后每孔加入100μl 1：10000稀释的HRP耦联的山羊抗人IgG，于26℃室温孵育1小时；

[0027] 洗板后每孔加入温度平衡至室温的显色剂A、B各2滴，混匀后，37℃孵育5分钟，加入终止液25μl，立刻用酶标仪检测，取波长450nm，先用空白孔调零，然后读取各孔的OD值，并记录结果，每次进行ELISA按下列公式计算并判断结果：样品平均OD值／阴性对照平均OD值，比值≥2．0，判断为阳性结果；样品平均OD值／阴性对照平均OD值，比值<2．0，判断为阴性结果；找出与大肠癌混合血清反应为阳性，而与对照混合血清反应为阴性的有意义的噬菌体克隆；

[0028] c2）独立血清复筛：

[0029] 将经步骤c1）初筛后的所述有意义的噬菌体应用30例大肠癌患者血清及30例健康对照血清进行ELISA复筛，步骤同c1中所述ELISA实验的步骤，不同之处在于筛选所用的血清为独立的，而不是混合血清，对比所述有意义的噬菌体与各大肠癌患者血清及对照血清的反应性，应用独立样本t 检验的方法，挑选出与30例大肠癌血清及30例健康对照血清的反应数据具有显著差异的噬菌体克隆；

[0030] c3）大肠癌特异性抗原肽重组载体的诊断模块的获得：

[0031] 应用dige R软件采用随机森林法对所有独立血清样本进行2000次随机抽样，根据各噬菌体肽区分大肠癌血清的能力，对步骤c2所得到的具有显著差异的噬菌体的筛选能力从高到低进行排序；采用贝叶斯双变量模型，依次检验噬菌体联合检测的效果，按联合数量最少、且联合检测的灵敏度与特异性与步骤c2所得到的具有显著差异的噬菌体联合检测的灵敏度与特异性最接近的标准，得到5个大肠癌特异性抗原肽的表达载体，其上插入的cDNA片段的序列如SEQ ID No.1、SEQID No.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9所示。

[0032] 本发明提供的大肠癌特异性自身抗体酶联免疫检测试剂盒，包括T7TAILER单克隆抗体、酶标板、阴性对照、酶联物、显色剂A&B、终止液，其中，所述试剂盒还包括5个大肠癌特异性抗原肽的表达载体，所述5个大肠癌特异性抗原肽的表达载体均由T7噬菌体和编码大肠癌特异性抗原肽的cDNA片段构成，所述cDNA片段的序列分别如SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ IDNo.7、SEQ ID No.9所示，且所述阴性对照为空噬菌体，所述酶联物为HRP耦联的山羊抗人IgG。

[0033] 本发明提供的大肠癌特异性自身抗体酶联免疫检测试剂盒的操作方法，包括：

[0034] A）将T7TAILER 抗体，按1：1000稀释度，用pH为7.4的1×PBS稀释，每孔100ul，包被于96孔酶标板，4℃摇床轻摇过夜；采用1×洗液，每孔300ul，洗四次，每次约1分钟，拍干后用2%BSA/PBS 200ul于26℃封闭每孔2小时；1×洗液，每孔300ul，洗四次，每次约1分钟，拍干，加入1%BSA1：5稀释的5个表达大肠癌特异性抗原肽的重组载体100ul，每个标本加2孔；每次试验均加入没有插入片段的空噬菌体作为阴性对照和空白对照各2孔，室温孵育2小时，弃去孔内液体，拍干；

[0035] B）每孔加入100ul 1%BSA 1：500稀释的大肠癌病人血浆，室温孵育1小时，洗液洗板，每孔300ul，洗四次，每次约1分钟，拍干；每孔加入100ul 1：10000稀释的HRP耦联的山羊抗人IgG，室温孵育1小时，洗液洗板，每孔300ul，洗四次，每次约1分钟，拍干；每孔加入温度平衡至室温的显色剂A、B各2滴，混匀后，37℃孵育5分钟，加入终止液25ul，立刻用酶标仪检测，取波长450nm，先用空白孔调零，然后读取各孔的OD值，并记录结果；

[0036] C)按下列公式计算并判断结果：用空白孔调零后，样品平均OD值／阴性对照平均OD值，将结果代入联合筛选模型，设定cut-off 值为0.5，当结果≥0.5，判断为阳性；结果<0.5，则将其结果判断为阴性，其中，所述联合筛选模型是通过汇总5个表达大肠癌特异性抗原肽的重组载体与30例大肠癌症患者的血清和30例健康对照血清的反应数据，应用Binary Regression Models Version 2.0软件在Matlab 7.0环境下建立筛选大肠癌的贝叶斯双变量回归模型。

[0037] 本发明利用T7噬菌体将大肠癌cDNA文库展示到噬菌体表面，并经亲和筛选和血清学分析从中筛选出大肠癌特异性抗原肽的表达载体，包含表达载体的大肠癌特异性自身抗体酶联免疫检测试剂盒具有检测大肠癌病人血清中由于肿瘤刺激所产生的自身抗体的能力。将筛选出的多个抗原肽经过联合，可达到早期检测和筛选大肠癌病人的目的。

附图说明

[0038] 图1为大肠癌噬菌体展示肽库原始库的光学图片。

[0039] 图2为随机挑选噬菌斑PCR扩增图。

[0040] 图3为根据16个噬菌体联合筛选30对训练组血清的结果构建的数学模型示意图。

[0041] 图4（a）和（b）分别为16个噬菌体克隆联合筛选与5个噬菌体联合筛选ROC曲线图。

[0042] 图5为根据5个噬菌体联合筛选30对训练组血清的结果构建的数学模型示意图。

具体实施方式

[0043] 以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。

[0044] 实施例1构建大肠癌噬菌体展示肽库

[0045] 抽提30例新鲜大肠癌组织总RNA，等量混合成1mg后抽提mRNA，应用oligodT引物反转录为cDNA，将cDNA末端进行平齐，加EcolⅠ和Hind III接头，双酶切后去除小片断，然后接入T7噬菌体（NOVAGEN）双臂，进行体外包装，构建成大肠癌噬菌体展示肽库，其光学6
图片如图1所示。测定构建的噬菌体展示肽库库容量为3.0×10pfu，重组率为60%，符合筛选后期试验要求。

[0046] 实施例2亲和筛选大肠癌特异抗原肽

[0047] 取10μl A/G的琼脂糖珠置于一1.5ml 离心管中，500μl PBS(pH7.4)洗2次，1%BSA4℃封闭1h。琼脂糖珠分别与15μl大肠癌患者及对照患者血清4℃孵育过夜，其中对照患者是指排除任何恶性肿瘤及癌前病变，排除腺瘤性息肉病和遗传性非息肉病性结直肠癌患者。PBS 500μl洗涤3次后，用10μl PBS溶解富集到的抗体。10管大肠癌的抗体及10管非大肠癌的抗体各自合并成一管。取噬菌体库扩增液20μl，先与20μl的非大肠癌抗体孵育1h，未结合的上清再与20μl大肠癌抗体结合，保留结合到琼脂糖珠上的噬菌体，并用100μｌ1%SDS洗脱，将其转染细菌至扩增，完成一轮亲和筛选。为了富集可以和大肠癌自身抗体结合的特异展示肽，重复上述步骤，反复进行五轮亲和筛选。

[0048] 实施例3血清学筛选大肠癌早期检测分子标志

[0049] 3.1混合血样初筛

[0050] 筛选后的肽库用LB液体培养基1:108稀释后，取100μl噬菌体液、250μl新摇好的BLT5403细菌，3ml保温55℃的顶层琼脂，混匀后立刻倒入铺有LB的平皿中，冷却后，37℃温箱孵育4小时，可见有单个的噬菌斑形成。每1个1.5ml离心管中，加入1ml新摇好的细菌BLT5403,用消毒的牙签随机挑取单个的、边界清晰的噬菌体于1个1.5ml 离心管中，共随机挑选噬菌体克隆2000个，并按顺序编号。挑好的噬菌体置37℃恒温振荡器摇4小时以上，直至每一管液体均变澄清为止。挑选好的噬菌体置4℃保存。用T7引物（上海生工生物有限公司合成）进行PCR反应，扩增所挑选噬菌体的插入片段，产物进行琼脂糖凝胶电泳，如图2所示，挑取扩增片段200BP以上的噬菌体进行ELISA实验进一步筛选，其中T7引物的序列为：

[0051] Up：5’-GGAGCTGTCGTATTCCAGTC-3’

[0052] Down：5’-AACCCCTCAAGACCCGTTTA-3’

[0053] 将T7TAILER抗体(NOVAGEN)用PBS（pH7.4）按1：1000来稀释，每孔100μl包被于96孔酶标板，4℃摇床轻摇过夜。用洗液（上海科华生物技术公司）洗板，每孔300μl，洗四次，每次约1分钟，拍干。200μl 2%BSA/PBS 室温（26℃）封闭2小时。洗板同前，加入用1%BSA以1：5比例稀释的噬菌体100μl，每个标本加4孔。每次试验均加入没有插入片段的50号空噬菌体作为阴性对照4孔和空白对照2孔。室温孵育2小时。弃去孔内液体，拍干。每个噬菌体标本加入100μl 1%BSA以1：500比例稀释的大肠癌组混合血浆、对照组混合血浆各2孔。所用大肠癌组、对照组的混合血浆的患者信息同实施例2的亲和筛选所用的患者。也就是说，某待测的噬菌体包被六孔，其中两孔加大肠癌患者混合血清，两孔加对照混合血清，两孔不加任何血清作空白对照，同时包被空噬菌体四孔，每两孔分别加肺癌患者混合血清和对照混合血清，作前面四孔相应的阴性对照。室温孵育1小时。洗板后每孔加入100μl 1：10000稀释的HRP耦联的山羊抗人IgG，26℃室温孵育1小时。洗板后每孔加入温度平衡至室温的显色剂A、B各2滴（上海科华生物技术公司），混匀后，37℃孵育5分钟，加入终止液25μl。

[0054] 立刻用酶标仪检测，取波长450nm，先用空白孔调零，然后读取各孔的光密度值（OD值），并记录结果。每次进行ELISA按下列公式计算并判断结果：用空白孔调零后，样品平均OD值／阴性对照平均OD值，比值≥2.0，判断为阳性结果；样品平均OD值／阴性对照平均OD值，比值<2.0，判断为阴性结果。找出与大肠癌混合血清反应为阳性，而与对照混合血清反应为阴性的噬菌体，作为有筛选意义的克隆进行后续研究，共筛选出21个有意义克隆，经过PCR鉴定均为有插入片段的噬菌体。这些噬菌体克隆表面所展示的抗原可能具有诊断大肠癌的潜能，将应用其对大肠癌病人和对照血清进行ELISA试验筛选，以确定其在临床中检测早期大肠癌的可行性。

[0055] 3.2独立血清复筛

[0056] 将初筛后的有意义的21个噬菌体应用30例大肠癌患者血清及30例健康对照血清进行ELISA复筛，方法同实施例3.1，不同之处在于筛选所用的血清为独立的，而不是混合血清。对比21个噬菌体克隆在大肠癌患者血清及对照血清的反应性，应用独立样本t 检验，发现其中16个噬菌体克隆与30例大肠癌血清及30例健康对照血清的反应数据具有显著差异(p<0.05)。

[0057] 实施例4应用训练组血清建立检测模型

[0058] 4.1建立联合检测数学模型

[0059] 为了提高检测试剂盒的敏感度，采用不同噬菌体克隆联合检测的方法。汇总16个不同噬菌体克隆与30对训练组（30例癌症患者和30例对照）的反应数据，应用Binary Regression Models Version 2.0软件在Matlab 7.0环境下，建立筛选大肠癌的贝叶斯双变量数学模型（Bayesian binary regression），检测检测者患大肠癌的概率。30例癌症患者为类别1，30例对照为类别0，cut-off 值为0.5，大于等于0.5为阳性，小于0.5为阴性，如图3所示，可以应用此模型成功区分出30对训练组的癌症患者及健康对照。

[0060] 4.2优化联合检测数学模型

[0061] 在保证检测效果的前提下，为了使试剂盒的制备及使用更加简便，对以上16个噬菌体克隆进行精简筛选。方法如下：

[0062] 通过dige R软件采用随机森林法（Random Forest）对所有独立血清样本进行2000次随机抽样，进行编号，对这16个噬菌体克隆的筛选能力由高到低排序；根据排序结果依次选择前16、15个，14个，直到前3个噬菌体克隆，将其反应性数值分别输入贝叶斯双变量模型（Bayesian binary regression），发现噬菌体克隆联合数量最少，即仅使用前五个噬菌体克隆（1009号噬菌体克隆、174号噬菌体克隆、149号噬菌体克隆、396号噬菌体克隆、95号噬菌体克隆）联合筛选，其灵敏度及特异度与16个噬菌体克隆联合筛选时灵敏度及特异度接近，敏感度及特异度分别为90.0%和96.7%，如图4所示，16个噬菌体克隆联合监测的ROC曲线下面积为0.937，5个噬菌体克隆联合检测的ROC曲线下面积为0.940。经测序，前五个噬菌体克隆的cDNA插入片段的序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7，SEQ ID No.9所示，相对应所编码的大肠癌特异性抗原肽的氨基酸序列如SEQ ID No.2、SEQ ID No.4、SEQ ID No.6、SEQ ID No.8，SEQ ID No.10所示。

[0063] 因此，最终的联合检测模型是通过汇总5个不同噬菌体克隆与30对训练组（30例癌症患者血清和30例健康对照血清）的反应数据所建立的贝叶斯双变量数学模型（Bayesian binary regression），如图5所示。

[0064] 实施例5应用验证组血清检验5个噬菌体联合筛选效果

[0065] 将这五个噬菌体克隆分别与经金标准（病理结果）确诊的60例大肠癌患者血清和60例对照血清反应，方法同独立血清复筛选(实施例3.1）。将检测值输入根据训练组的30对独立血样所建立的数学模型中，产生该检测者患大肠癌的概率，cut-off 值为0.5，大于等于0.5为阳性，小于0.5为阴性，检测结果，结果如表1所示。ELISA检测方法检测验证组大肠癌的敏感度为90.0%、特异度为91.7%。

[0066] 表1ELISA检测结果

[0067]

[0068] 实施例6噬菌体克隆联合检测法与肿瘤标志物CEA检测方法比较

[0069] 为了对比噬菌体克隆联合检测方法与目前的肿瘤标志物CEA 检测方法。汇总血清学验证时所用的60对大肠癌血清与对照组血清的资料，分别根据CEA筛查方法,单一噬菌体克隆筛查法,及噬菌体克隆联合检测方法，绘制ROC 曲线验证筛选意义，计算ROC曲线下的面积，结果如表2所示。ROC曲线下面积越靠近1，说明筛查方法的敏感度，特异度越高，检测效果越优。表2结果表明，仅应用单一噬菌体克隆判别大肠癌的能力即可优于传统的CEA检测法，而由5个噬菌体克隆联合检测方法更加准确。因此得出，噬菌体展示肽检测法可为早期大肠癌患者提供了更有效的判别手段。

[0070] 表2不同筛查方法所绘制ROC的曲线下面积对比

[0071]ROC曲线下面积 95%置信区间 P值
CEA 0.776 0.689-0.862 P<0.001
1009号噬菌体 0.895 0.839-0.951 P<0.001
149号噬菌体 0.824 0.749-0.898 P<0.001
174号噬菌体 0.893 0.835-0.952 P<0.001
396号噬菌体 0.856 0.790-0.922 P<0.001
95号噬菌体 0.833 0.762-0.905 P<0.001
5个噬菌体联合筛选 0.973 0.949-0.997 P<0.001

[0072] 实施例7大肠癌特异性自身抗体酶联免疫检测试剂盒的操作

[0073] 7.1制备大肠癌特异抗原ELISA板

[0074] 将T7TAILER 单克隆抗体，按1：1000稀释度，用1×PBS（PH7.4）稀释，每孔100μl包被于96孔酶标板，4℃摇床轻摇过夜。1×洗液，每孔300μl，洗四次，每次约1分钟，拍干。2%BSA/PBS 200μl室温（26℃）封闭2小时。

[0075] 1×洗液，每孔300μl，洗四次，每次约1分钟，拍干。加入1%BSA1：5稀释的95号、149号、174号、396号及1009号100μl，每个标本加2孔。每次试验均加入没有插入片段的50号噬菌体作为阴性对照和空白对照各2孔。室温孵育2小时。弃去孔内液体，拍干。
此时由于抗原抗体反应，肿瘤特异抗原从而成功地固定在酶标板上。

[0076] 7.2ELISA 检测大肠癌病人

[0077] 每个噬菌体标本加入100μl 1%BSA 1：500稀释的大肠癌病人血浆，室温孵育1小时。洗液洗板，每孔300μl，洗四次，每次约1分钟，拍干。每孔加入100μl 1：10000稀释的HRP耦联的山羊抗人IgG，室温孵育1小时。洗液洗板，每孔300μl，洗四次，每次约1分钟，拍干。每孔加入温度平衡至室温的显色剂A、B各2滴，混匀后，37℃孵育5分钟，加入终止液25μl。立刻用酶标仪检测，取波长450nm，先用空白孔调零，然后读取各孔的OD值，并记录结果。

[0078] 7.3结果判断

[0079] 每次进行ELISA按下列公式计算并判断结果：用空白孔调零后，样品平均OD值／阴性对照平均OD值，将血清与5个噬菌体克隆的反应结果代入联合筛选模型，设定cut-off 值为0.5，当结果≥0.5，判断为阳性；结果<0.5，则将其结果判断为阴性。该试剂盒则将待测血清判断可能为大肠癌早期患者血清。

[0080] 本发明的5个大肠癌特异性抗原肽的表达载体，有效表达大肠癌特异性抗原肽，包被在酶标板上，具有检测大肠癌病人血清中由于肿瘤刺激所产生的自身抗体的能力，从而达到早期检测和筛选大肠癌病人的目的。与现行的其他方法相比，具有微创、简单、经济、敏感度及特异度高等特点，方便用于社区人群的筛查，从而达到早期检测大肠癌的目的。