一种菁类荧光染料

摘要

本发明公开了一种可用于生物荧光标记的菁类荧光染料，该类荧光染料如通式I所示，具有合成步骤少，合成条件温和，纯化处理方式简单，产品收率高，光稳定性高，具有一定的细胞膜通透能力，同时具有低荧光背景和对核酸的特异性识别能力的特点。在流式细胞分析仪中作为核酸染色剂使用可以有效降低背景荧光的干扰,提高检测的精度。本发明提供的荧光染料可以作为血液中白细胞和网织红细胞的染色剂使用。

权利要求

1.一种菁类荧光染料，其结构通式如I所示：其中

X为C(CH3)2、O或者S；

R1选自H、OH、C1-4烷基；

R2选自OH、NHR5、N(R5)2；

R3选自C3-8烯基、C3-8炔基；

R4选自C3-8烯基、C3-8炔基；

R5选自C1-8烷基、C3-8烯基；

- - - - -

Y 为负离子，选自卤素离子、ClO4、PF6、CF3SO3、BF4、乙酸根或对甲苯磺酸负离子。

2. 权利要求1中任一项菁类荧光染料，其中所述菁类荧光染料为： 。

说明书

一种菁类荧光染料

技术领域

[0001] 本发明涉及一种可用于生物荧光标记的菁类荧光染料，具体地讲，本发明涉及一种可以在温和反应条件下制备的荧光染料，其制备方法以及在生物样品染色中的用途。

背景技术

[0002] 荧光染料已经被广泛应用于生命科学研究和临床医学诊断。在流式细胞分析中，荧光染料与细胞中的核酸物质进行结合后，通过激光照射区时，发出荧光和多角度的散射光。通过对这些荧光和散射光信号的检测，可以获得关于细胞的结构和理化参数的大量信息。

[0003] 临床医学诊断中，通常把人体外周血中的正常白细胞分为淋巴细胞、中性粒细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞等。白细胞在病理情况下，其形态、数量比例以及细胞内部的核酸成分都会发生很大变化。另外，人体外围血中的红细胞通常为成熟的不含RNA的红细胞，在病理情况下，会出现未成熟的含RNA的网织红细胞。通过荧光染料对细胞的DNA/RNA核酸进行特异性染色，利用荧光检测技术可以有效筛查出这些异常细胞。

[0004] 早期应用的染料包括新亚甲蓝（NMB）、亮甲苯蓝（BCB）、派诺宁Y、溴乙锭等。它们通过嵌入或静电吸引与核酸分子形成复合物，从而可以在显微镜下观察增强后的荧光。但是这些染料自身也可以形成染料复合物，不能明显区别于染料与核酸形成的复合物，造成高的荧光背景干扰。同时，这些染料的荧光量子效率较低，降低了荧光增强的程度，影响检测结果的准确性。

[0005] 美国专利3883247公开了一种白细胞五分类方法，它是通过吖啶橙对白细胞核酸进行染色，通过不同的白细胞亚类红色和绿色荧光量的差异来对白细胞进行分类。该方法采用的吖啶橙可以和核酸形成复合物，使荧光增强。这类染料分子相互之间在能量传递的过程中可能会导致光淬灭，使得染料核酸复合物没有荧光发出，影响检测结果真实性。同时在流式细胞分析仪中，吖啶橙和塑料管路有较强的作用，会增加背景荧光强度。为了清除测试后残留的染料和保证测试结果的准确性，需要仪器进行长时间的管路清洗，这就降低了仪器的分析效率。

[0006] 美国专利4882284公开了一种白细胞五分类方法，它是通过采用非溶血的方法利用噁嗪类荧光染料对血细胞中的各种细胞进行染色，然后通过不同细胞的前向散射光、侧向散射光和红色荧光强度来对白细胞进行分类。这些染料的荧光量子效率较低，降低了荧光增强的程度，影响检测结果的准确性，同时由于需要测定红细胞、白细胞和血小板，则一些异常红细胞如大红细胞等会影响白细胞准确计数。

[0007] 目前使用的菁类荧光染料，如由美国的Glazer 等开发的对dsDNA 具有高度亲和力的不对称菁染料TOTO（噻唑橙二聚体）、YOYO（噁唑黄二聚体）、TOTAB、TOTIN（噻唑橙异二聚体），以及在这个基础上衍生出的不对称单亚甲基菁染料TO-PRO-3、PO-PRO-2和BO-PRO-2等[K.M. Sovenyhazy, J.A. Bordelon, J.T. Petty. Nucleic Acids Res, 2003, 31,2561]，它们的吸收和发射都在近红外区 (670-1000 nm)，但这类染料的分子结构复杂，合成路线较长，纯化处理耗时长且收率较低，因而价格高昂，限制了其使用范围。

[0008] 因此需要开发新的菁类荧光染料，该类荧光染料具有以下特点：合成步骤少，合成条件温和，纯化处理方式简单，产品收率高，光稳定性高，具有一定的细胞膜通透能力，同时具有低荧光背景和对核酸的特异性识别能力。

发明内容

[0009] 本发明的目的：本发明一种菁类荧光染料是针对现有技术存在的不足，在其基础上进行多次改进和实验，而得到的一类具有合成步骤少，合成条件温和，纯化处理方式简单，产品收率高，光稳定性高，具有一定的细胞膜通透能力，同时具有低荧光背景和对核酸的特异性识别能力的菁类荧光染料。

[0010] 本发明的内容：本发明公布了一种具有下列结构通式I的菁类荧光染料：

[0011]

[0012] 其中

[0013] X为C(CH3)2、O或者S；

[0014] R1选自H、OH、C1-18烷基、苯基；

[0015] R2选自H、OH、NHR5、N(R5)2；

[0016] R3选自苄基、C3-18烯基、C3-18炔基，其中苄基由选自以下的取代基任选取代：卤素、羟基、巯基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、杂环基、卤代烷基、氨基、烷基氨基、酰氨基、羧基；

[0017] R4选自C3-18烯基、C3-18炔基；

[0018] R5选自C1-18烷基、C3-18烯基；

[0019] Y-为负离子。

[0020] 本发明的技术方案：本发明一方面提供了一种菁类荧光染料，所述荧光染料可以通过下述步骤得到：

[0021] 将具有通式II的化合物和通式III的化合物溶解在吡啶/醋酸酐的混合溶液中，常温下搅拌反应2~10小时，即得到菁类荧光染料。

[0022]

[0023]

[0024] 本发明人在研究过程中发现，通过调整通式化合物II和III中取代基团可以增加其反应活性，在吡啶/醋酸酐溶液中室温下即可顺利的进行反应，并且大大降低了杂质的形成，简化了纯化处理的难度，只要通过多次洗涤和重结晶的操作即可。

[0025] 本发明还一方面提供一种缀合物，所述缀合物包含上述式I化合物。

[0026] 本发明另一个方面还提供用于生物样品染色的组合物，所述组合物包含上述式I化合物或其缀合物。

[0027] 本发明再一方面还提供了本发明式I化合物或其缀合物或组合物在对生物样品进行染色中的用途。

[0028] 本发明的化合物、缀合物或组合物对生物样品如核酸、白细胞、网织红细胞等具有良好的染色作用，其形成的复合物发射波长在近红外区，避免了生物自身的荧光背景干扰，有助于提高检测结果的精确度，同时可在流式细胞分析仪上用作各种生物样品的染色剂。

[0029] 本发明的有益效果：本发明中所述菁类荧光染料合成步骤少，合成条件温和，纯化处理方式简单，产品收率高，光稳定性高，具有一定的细胞膜通透能力，同时具有低荧光背景和对核酸的特异性识别能力。

[0030] 本发明的这些特征和优点以及其他特征和优点在参考以下附图和本发明的具体实施方式之后将变得显而易见。

附图说明

[0031] 图1 是使用本发明一个实施方案I作为白细胞分类计数试剂,测定血液样本的侧向散射光强度和荧光强度信号所生成的散点图。

[0032] 图2 是使用本发明一个实施方案II作为白细胞分类计数试剂,测定血液样本的侧向散射光强度和荧光强度信号所生成的散点图。

[0033] 图3 是使用本发明一个实施方案III作为白细胞分类计数试剂,测定血液样本的侧向散射光强度和荧光强度信号所生成的散点图。

[0034] 图4 是使用本发明一个实施方案IV作为作为网织红细胞测定试剂，测定血液样本的侧向散射光强度和荧光强度信号所生成的散射图。

具体实施方式

[0035] 定义

[0036] 除另有说明外，本文中使用的术语具有以下含义。

[0037] 本文中使用的术语“烷基”，无论是单独使用还是与其他基团结合使用，指包含1-18、优选1-12、更优选1-8、最优选1-6个碳原子的直链烷基和支链烷基。如提及单个烷基如“正丙基”，则只特指直链烷基，如提及单个支链烷基如“异丙基”，则只特指支链烷基。
例如，“C1-6烷基”包括C1-4烷基、C1-3烷基、甲基、乙基、正丙基、异丙基和叔丁基。类似的规则也适用于本说明书中使用的其它基团，比如对于烯基和炔基的定义。

[0038] 本文中使用的术语“卤素”包括氟、氯、溴和碘。

[0039] 本文中使用的术语“生物样品”包括但不限于核酸、血液中的白细胞、网织红细胞等。

[0040] 本发明的组合物

[0041] 本发明还提供包含上述式I化合物或其缀合物的组合物，所述组合物用于生物样品的染色。

[0042] 本发明的组合物除包含式I化合物或其缀合物外，还可包含生物样品染色所需要的其它组分，例如溶剂、渗透压调节剂、pH调节剂、表面活性剂等。本发明的组合物可作为水溶液形式存在，或者可作为临用前用适用溶剂配制为溶液的其它合适形式存在。

[0043] 实施例1 菁类荧光染料I的制备与纯化

[0044]

[0045] 在干燥洁净的50mL 三口烧瓶中加入4.0mmol的3-苄基-5-羟基-2-（2-（N-苯乙酰氨基）-乙烯基）苯并噻唑溴盐和4.1mmol 7-丙胺基-4-甲基-1-（丙烯基）喹啉溴盐,向其中加入10ml吡啶和2ml醋酸酐，在室温下磁力搅拌反应4.5小时后停止，得到反应产物的粗品。将该粗产物倒入无水乙醚中搅拌，产物析出。将粗产物过滤后用3×25ml乙酸乙酯洗涤，然后用适量甲醇重结晶后即可得到标题所示化合物。产品收率72%。

[0046] 最大吸收峰：630nm (甲醇/乙二醇)

[0047] MS (EI) C32H32BrN3OS m/z: 506.6 [M-Br] +。

[0048] 实施例2 菁类荧光染料II的制备与纯化

[0049]

[0050] 在干燥洁净的50mL 三口烧瓶中加入4.0mmol的3-（己烯-2-基）-5-羟基-2-（2-（N-苯乙酰氨基）-乙烯基）苯并噻唑溴盐和4.1mmol 7-丁胺基-4-甲基-1-（己烯-2-基）喹啉溴盐,向其中加入10ml吡啶和3ml醋酸酐，在室温下磁力搅拌反应5小时后停止，得到反应产物的粗品。将该粗产物倒入无水乙醚中搅拌，产物析出。将粗产物过滤后用3×25ml乙酸乙酯洗涤，然后用适量甲醇重结晶后即可得到标题所示化合物。产品收率65%。

[0051] 最大吸收峰：632nm (甲醇/乙二醇)+

[0052] MS (EI) C33H44BrN3OS m/z: 539.3 [M-Br] 。

[0053] 实施例3 菁类荧光染料III的制备与纯化

[0054]

[0055] 在干燥洁净的50mL 三口烧瓶中加入4.0mmol的6-羟 基-3,3-二甲基-2-（2-（N-苯乙酰氨基）-乙烯基）-1-（丙炔-2-基）-苯并噻唑碘盐和4.1mmol
7-N,N-二乙胺基-4-甲基-1-苄基-喹啉碘盐,向其中加入10ml吡啶和0.8ml醋酸酐，在室温下磁力搅拌反应8小时后停止，得到反应产物的粗品。将该粗产物倒入无水乙醚中搅拌，产物析出。将粗产物过滤后用3×25ml乙酸乙酯洗涤，然后用适量甲醇重结晶后即可得到标题所示化合物。产品收率78%。

[0056] 最大吸收峰：635nm (甲醇/乙二醇)

[0057] MS (EI) C36H38IN3O m/z: 528.7 [M-I] +。

[0058] 实施例4 菁类荧光染料IV的制备与纯化

[0059]

[0060] 在干燥洁净的50mL 三口烧瓶中加入4.0mmol的3-苄基-5-乙基-2-（2-（N-苯乙酰氨基）-乙烯基）苯并噁唑溴盐和4.1mmol 7-羟基-4-甲基-1-（庚烯基）喹啉溴盐,向其中加入10ml吡啶和1ml醋酸酐，在室温下磁力搅拌反应4小时后停止，得到反应产物的粗品。将该粗产物倒入无水乙醚中搅拌，产物析出。将粗产物过滤后用3×25ml乙酸乙酯洗涤，然后用适量甲醇重结晶后即可得到标题所示化合物。产品收率73%。

[0061] 最大吸收峰：627nm (甲醇/乙二醇)

[0062] MS (EI) C35H37BrN2O2 m/z: 517.6 [M-Br] +。

[0063] 实施例5菁类荧光染料I作为白细胞分类测试试剂

[0064] 在1mL白细胞分类测定试剂中加入20uL经过EDTA.2K抗凝处理的血液，然后加入20uL 20ppm的荧光染料I，调制成测试样品，避光孵育10分钟，吸入经过适当改造的流式细胞分析仪，收集5000个白细胞的红色荧光和侧向散射光光强信息，结果如图1所示，白细胞被分成淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞四类。

[0065] 实施例6菁类荧光染料II作为白细胞分类测试试剂

[0066] 在1mL白细胞分类测定试剂中加入20uL经过EDTA.2K抗凝处理的血液，然后加入20uL 20ppm的荧光染料II，调制成测试样品，避光孵育10分钟，吸入经过适当改造的流式细胞分析仪，收集5000个白细胞的红色荧光和侧向散射光光强信息，结果如图2所示，白细胞被分成淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞四类。

[0067] 实施例7菁类荧光染料III作为白细胞分类测试测试试剂

[0068] 在1mL白细胞分类测定试剂中加入20uL经过EDTA.2K抗凝处理的血液，然后加入20uL 20ppm的荧光染料III，调制成测试样品，吸入经过适当改造的流式细胞分析仪，收集
5000个白细胞的红色荧光和侧向散射光光强信息，结果如图3所示，白细胞被分成淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞四类。

[0069] 实施例8菁类荧光染料IV作为网织红测试试剂

[0070] 在3mL网织红细胞测定试剂中加入5uL经过抗凝剂处理的血液，然后加入30uL50ppm的荧光染料IV，调制成测试样品，避光孵育10分钟，吸入经过适当改造的流式细胞分析仪，收集10万个细胞的红色荧光和侧向散射光光强信息，结果如图4所示。根据不同的荧光强度，可以区分出高荧光强度的网织红细胞和低荧光强度的成熟红细胞。

[0071] 已通过上述各实施方案和具体实施例对本发明作出说明，但本领域技术人员会理解，在不偏离本发明宗旨和范围的情况下，可对本发明作出各种修改、变更和替换。