OsSPX1蛋白及其编码基因在调节植物花粉育性中的应用转让专利
申请号 : CN201210253451.7
文献号 : CN102766631B
文献日 : 2013-11-06
发明人 : 苏震 , 徐文英 , 魏强 , 王玲 , 刘凤霞 , 于静娟 , 赵琳娜 , 张力圩
申请人 : 中国农业大学
摘要 :
本发明公开了OsSPX1蛋白及其编码基因在调节植物花粉育性中的应用。本发明提供了一种培育转基因植物的方法，是抑制目的植物中OsSPX1基因的表达，得到花粉育性低于所述目的植物的转基因植物；所述OsSPX1基因编码如下（a）或（b）所述的OsSPX1蛋白：（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物花粉育性相关的由序列1衍生的蛋白质。本发明可以应用于作物（包括水稻、玉米等）杂交育种,在农业生产上具有较强的应用价值。
权利要求 :
1.一种培育转基因植物的方法，是抑制目的植物中OsSPX1基因的表达，得到花粉育性低于所述目的植物的转基因植物； 所述OsSPX1基因编码由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的OsSPX1蛋白； 所述目的植物为水稻日本晴。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述OsSPX1基因为序列表的序列2所示的DNA分子。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述“抑制目的植物中OsSPX1基因的表达”的实现方法如下：在所述目的植物中导入反义基因；所述反义基因为与所述OsSPX1基因反向互补的基因。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述反义基因通过重组表达载体导入所述目的植物。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述重组表达载体为在植物表达载体pCAMBIA-1301的多克隆位点插入所述反义基因得到的重组质粒。
6.权利要求1至5中任一所述方法在植物杂交育种中的应用；所述植物为水稻日本晴。
7.序列表的序列1所示OsSPX1蛋白或所述OsSPX1蛋白的编码基因在调控目的植物的花粉育性中的应用；所述目的植物为水稻日本晴。
说明书 :
OsSPX1蛋白及其编码基因在调节植物花粉育性中的应用
技术领域
[0001] 本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及植物花粉育性领域，更具体来说涉及OsSPX1蛋白及其编码基因在调节植物花粉育性中的应用。
背景技术
[0002] 水稻是世界上重要的粮食作物，其产量的形成涉及到很多因素，包括遗传与环境因素。传粉受精过程是其中关键因素之一。
[0003] 在水稻中挖掘与花粉育性相关的基因，了解其作用机制对水稻的高产育种有重要的借鉴作用。
[0004] 另外，自然的花粉败育在作物育种实践以及杂交制种生产中也有积极的作用。
[0005] 因此，探索并发现与花粉育性相关的基因并把它们应用于水稻育种生产中，具有十分重要的理论意义和实践价值。
发明内容
[0006] 本发明的目的是提供OsSPX1蛋白及其编码基因在调节植物花粉育性中的应用。
[0007] 本发明提供了一种培育转基因植物的方法，是抑制目的植物中OsSPX1基因的表达，得到花粉育性低于所述目的植物的转基因植物；
[0008] 所述目的植物为具有所述OsSPX1基因的植物；
[0009] 所述OsSPX1基因编码如下（a）或（b）所述的OsSPX1蛋白：
[0010] （a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0011] （b）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物花粉育性相关的由序列1衍生的蛋白质。
[0012] 所述OsSPX1基因为如下1）至4）中任一所述的DNA分子：
[0013] 1）序列表的序列2所示的DNA分子；
[0014] 2）序列表的序列3所示的DNA分子；
[0015] 3）在严格条件下与1）或2）限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；
[0016] 4）与1）或2）限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%以上同源性且编码所述蛋白的DNA分子。
[0017] 所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠（SDS）、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1%SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1%SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1%SDS中漂洗；
还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，
0.1%SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在
65℃，0.1×SSC，0.1%SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1%SDS和1×SSC，0.1%SDS各洗膜一次。
还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，
0.1%SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在
65℃，0.1×SSC，0.1%SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1%SDS和1×SSC，0.1%SDS各洗膜一次。
[0018] 所述“抑制目的植物中OsSPX1基因的表达”的实现方法具体如下：在所述目的植物中导入反义基因；所述反义基因为与所述OsSPX1基因反向互补的基因。
[0019] 所述反义基因具体可通过重组表达载体导入所述目的植物。
[0020] 所述重组表达载体具体可为在植物表达载体pCAMBIA-1301的多克隆位点插入所述反义基因得到的重组质粒。
[0021] 所述目的植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物具体为水稻，如日本晴水稻。
[0022] 以上任一所述方法均可用于植物杂交育种。所述植物为具有所述OsSPX1基因的植物。所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物具体为水稻，如日本晴水稻。
[0023] 本发明还保护抑制所述OsSPX1基因表达的物质在培育雄性不育转基因植物中的应用。所述植物为具有所述OsSPX1基因的植物。所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物具体为水稻，如日本晴水稻。
[0024] 本发明还保护所述OsSPX1蛋白或所述OsSPX1基因在调控目的植物的花粉育性的中的应用。所述植物为具有所述OsSPX1基因的植物。所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物具体为水稻，如日本晴水稻。
[0025] 本发明还保护调节所述OsSPX1基因表达的物质或方法在调控目的植物的花粉育性的中的应用。所述调节所述OsSPX1基因表达的物质具体可为含有反义基因的重组质粒；所述反义基因为与所述OsSPX1基因反向互补的基因。所述反义基因具体可通过重组表达载体导入所述目的植物。所述重组表达载体具体可为在植物表达载体pCAMBIA-1301的多克隆位点插入所述反义基因得到的重组质粒。所述目的植物为具有所述OsSPX1基因的植物。所述目的植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物具体为水稻，如日本晴水稻。
[0026] 本发明还保护所述反义基因。本发明还保护所述反义基因在培育雄性不育转基因植物中的应用。所述植物为具有所述OsSPX1基因的植物。所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物具体为水稻，如日本晴水稻。
[0027] 本发明的发明人发现如果抑制OsSPX1基因的表达可以导致成熟花粉败育，进而对水稻产量产生影响，该发现可以应用于作物（包括水稻、玉米等）杂交育种,在农业生产上具有较强的应用价值。
附图说明
[0028] 图1为重组质粒pCOU OsSPX1和重组质粒pCOU OsSPX1_antisense的T-DNA区的结构示意图。其中，图A为重组质粒pCOU OsSPX1，图B为重组质粒pCOU OsSPX1_antisense。图A和B中的LB和RB分别代表T-DNA的左臂和右臂，Nos代表胭脂碱合酶终止子，HptⅡ代表潮霉素磷酸转移酶基因，CaMV35s代表花椰菜花叶病毒35s启动子，Ubi代表玉米泛素启动子，OsSPX1代表序列表序列2所示的OsSPX1基因。
[0029] 图2为转基因水稻株系的PCR鉴定电泳图。图A为制备抑制表达株系的过程T0代转基因水稻的鉴定结果，泳道M为分子量标准，从上到下的片段依次为5k、3k、2k、1k、750bp、500bp、250bp、100bp，泳道8为日本晴，泳道1-7为待鉴定的T0代转基因水稻。图B为制备过表达株系的过程中T0代转基因水稻的鉴定结果，泳道M为分子量标准，从上到下的片段依次为5k、3k、2k、1k、750bp、500bp、250bp、100bp、泳道9为日本晴，泳道1-8为待鉴定的T0代转基因水稻。
[0030] 图3为实时定量PCR检测转基因水稻株系中OsSPX1基因的相对表达水平。其中，A为过表达株系，B为抑制表达株系。
[0031] 图4为T5代过表达株系、抑制表达株系与日本晴开花期小花、雄蕊和花粉育性的表型。
[0032] 图5为T5代过表达株系、抑制表达株系与日本晴花粉育性的统计。
[0033] 图6为T5代过表达株系、抑制表达株系与日本晴的花药囊腔的显微镜照片；花药外壁、花药内壁和游离花粉粒的扫描电镜照片；花粉粒截面和内外壁的透射电镜照片。
具体实施方式
[0034] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0035] 实施例中的引物合成及测序工作均由北京奥科生物科技有限责任公司完成。
[0036] 水稻品种日本晴（Oryza sativa L.cv.Nipponbare）：中国农业大学保证向公众提供；参考文献：Gene expression profiles deciphering rice phenotypic variation between Nipponbare(Japonica)and 93-11(Indica)during oxidative stress.PLoS One.2010 Jan 8，5(1)。
[0037] 根癌农杆菌EHA105（Agrobacterium tumefaciens EHA105）：中国农业大学保证向公众提供；参考文献：Toki S,Hara N,Ono K,Onodera H,Tagiri A,Oka S,Tanaka H.2006.Early infection of scutellum tissue with Agrobacterium allows high-speed transformation of rice.Plant.J.47(6):969-76。
[0038] 实施例1、水稻OsSPX1基因的获得
[0039] 以4℃低温处理12h的水稻日本晴芽期（发芽7-10天的幼苗）植株为材料，利用TRIZOL试剂提取总RNA，并以总RNA为模板，使用M-MLV反转录酶进行反转录得到cDNA，再以此cDNA为模板，在引物CDS-PF和引物CDS-PR的引导下，进行常规PCR扩增，反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化约900bp的DNA片段，对该片段进行测序。
[0040] 引物CDS-PF：5’-ATAGATCTATGAAGTTTGGGAAGAGCCTG-3’（带下划线部分序列为限制性内切酶BglⅡ识别位点及保护碱基）；
[0041] 引物CDS-PR：5’-GCGGTACCTCATTTGGCGGCCTGCTCAAT-3’（带下划线部分序列为限制性内切酶KpnI识别位点及保护碱基）。
[0042] 测序结果表明，上述约900bp的DNA片段两端分别为BglⅡ识别位点和KpnI识别位点，BglⅡ识别位点和KpnI识别位点之间为序列表序列2所示的888bp核苷酸序列，该888bp核苷酸序列为一个开放阅读框，编码具有序列表序列1所示的由295个氨基酸组成的蛋白。
[0043] 将序列表的序列1所示的蛋白质命名为OsSPX1蛋白，该蛋白自氨基末端（N末端）第1-169位氨基酸残基为SPX蛋白结构域。
[0044] 将编码OsSPX1蛋白的基因命名为OsSPX1基因。OsSPX1基因的基因组DNA定位于水稻第六号染色体的23,875,408bp至23,879,965bp（其序列如序列表序列3所示），其NCBI定位号为NP_001058013，NCBI基因号（GENE ID）为:Os06g0603600，TIGR号为LOC_Os06g40120。
[0045] 实施例2、水稻OsSPX1基因正、反义重组表达载体的构建
[0046] 一、水稻OsSPX1基因正义重组表达载体的构建
[0047] 1、用限制性内切酶BglⅡ和KpnI双酶切实施例1中得到的约900bp的DNA片段，回收酶切产物（也可通过如下方法制备酶切产物，合成序列表的序列2所示的双链DNA分子并作为模板，用引物CDS-PF和引物CDS-PR组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，用限制性内切酶BglⅡ和KpnI双酶切PCR扩增产物并回收酶切产物）。
[0048] 2、用限制性内切酶BglⅡ和KpnI双酶切植物表达载体pCAMBIA-1301（GenBank号：AF234297），回收载体骨架（约10kb）。
[0049] 3、将步骤1的酶切产物和步骤2的载体骨架连接，得到OsSPX1基因的正义重组表达载体，又称重组质粒pCOU OsSPX1。根据测序结果，对重组质粒pCOU OsSPX1进行结构描述如下：在植物表达载体pCAMBIA-1301的BglⅡ和KpnI酶切位点之间插入了序列表的序列2所示的双链DNA分子。重组质粒pCOU OsSPX1的T-DNA区的结构示意图见图1A。重组质粒pCOU OsSPX1中，按照载体骨架中启动子至终止子的方向，依次具有Ubi启动子、序列表的序列2所示的双链DNA分子（正义基因）和Nos终止子，从而表达与OsSPX1基因。
[0050] 二、水稻OsSPX1基因反义重组表达载体的构建
[0051] 1、以实施例1中得到的约900bp的DNA片段为模板（也可直接合成序列表的序列2所示的双链DNA分子并作为模板），用引物F1和引物R1组成的引物对进行PCR扩增，回收PCR扩增产物。
[0052] 引物F1：5’-GCGGTACCATGAAGTTTGGGAAGAGCCTG-3’（带下划线部分序列为限制性内切酶KpnI识别位点及保护碱基）；
[0053] 引物R1：5’-ATAGATCTTCATTTGGCGGCCTGCTCAAT-3’（带下划线部分序列为限制性内切酶BglⅡ识别位点及保护碱基）。
[0054] 2、用限制性内切酶KpnI和BglⅡ双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。
[0055] 4、用限制性内切酶BglⅡ和KpnI双酶切植物表达载体pCAMBIA-1301（GenBank号：AF234297），回收载体骨架（约10kb）。
[0056] 5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到OsSPX1基因的反义重组表达载体，又称重组质粒pCOU OsSPX1_antisense。根据测序结果，对重组质粒pCOU OsSPX1_antisense进行结构描述如下：在植物表达载体pCAMBIA-1301的BglⅡ和KpnI酶切位点之间插入了序列表的序列2所示的双链DNA分子的反向互补序列（反义基因）。重组质粒pCOU OsSPX1_antisense的T-DNA区的结构示意图见图1B。重组质粒pCOU OsSPX1_antisense中，按照载体骨架中启动子至终止子的方向，依次具有Ubi启动子、与序列表的序列2反向互补的双链DNA分子和Nos终止子，从而表达与OsSPX1基因编码的RNA反向互补的RNA分子，可以抑制植物中原有OsSPX1基因的表达。
[0057] 实施例3、转基因水稻的获得
[0058] 分别将实施例2构建的重组质粒pCOU OsSPX1和重组质粒pCOU OsSPX1_antisense用农杆菌转化法转化日本晴的成熟胚诱导的愈伤组织，具体方法如下：
[0059] 1、将重组质粒用电击法转化根癌农杆菌EHA105，得到含有重组质粒的重组农杆菌。
[0060] 2、将重组农杆菌接种于YEB液体培养液（含100μg/ml卡那霉素和75μg/ml利福平），28℃振荡培养至OD600为0.6-0.8，然后10,000rpm室温离心1min，用MS盐溶液（pH5.8）重悬菌体并稀释至原培养液菌浓度的20-50倍，得到重组农杆菌菌悬液。
[0061] MS盐溶液的配方：NH4NO3 1.65g、KNO3 1.9g、KH2PO4 0.17g、MgSO4·7H2O 0.7g、CaCl2·2H2O 0.44g、MnSO4·4H2O 22.3mg、ZnSO4·7H2O8.6mg、H3BO3 6.2mg、KI 0.83mg、Na2MoO4·2H2O 0.25mg、CoCl2·6H2O 0.025mg、CuSO4·5H2O 0.025mg、FeSO4·7H2O 27.8mg、Na2-EDTA·2H2O 37.3mg、肌醇100mg、烟酸(B5)0.5mg、盐酸吡哆醇(维生素B6)0.1mg、盐酸硫胺素(维生素B1)0.5mg、甘氨酸2.0mg，用水定容至1L。
[0062] 3、将灭菌后的日本晴种子接种于N6D培养基平板（pH5.8），32℃培养1-5天，去除芽和残留胚乳后再继代培养10-20天，得到成熟胚愈伤组织。
[0063] N6D培养基的配方：溶剂为水；溶质及其浓度如下：KNO3 2.83g/L、(NH4)2SO40.463g/L、MgSO4·7H2O 0.185g/L、CaCl2 0.166g/L、KH2PO4 0.4g/L；MnSO4·4H2O 4.4mg/L、ZnSO4·7H2O 1.5mg/L、KI 0.8mg/L、H3BO3 1.6mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2EDTA·2H2O
37.3mg/L；2,4-D 2mg/L，CH:0.3g/L，L-脯氨酸2.878g/L，蔗糖30g/L，固化剂4g/L。
37.3mg/L；2,4-D 2mg/L，CH:0.3g/L，L-脯氨酸2.878g/L，蔗糖30g/L，固化剂4g/L。
[0064] 4、将步骤3得到的成熟胚愈伤组织浸于步骤2得到的重组农杆菌菌悬液中，轻轻晃动约1.5min，然后接种于含有10-20mg/L乙酰丁香酮的N6D培养基（pH5.2）上，该培养基上预先垫有一层浸有0.5毫升AAM培养基（Hiei,Y.,S.Ohta,T Komari and T.Kumashiro.1994.Efficient transformation of rice(Oryza sativa L.)mediated by agrobacterium and sequence analysis of theboundaries of the T-DNA.Plant J.6:271-282.）的无菌滤纸，25℃黑暗条件下共培养3天。
[0065] 5、将经过步骤4共培养的愈伤组织接种于含有50mg/L潮霉素（hygromycin B）和250mg/L羧苄青霉素（carbenicillin）的RE分化培养基(pH5.8)中培养1-2周，然后选取生长旺盛的抗性愈伤组织进行分化、壮苗，获得T0代植株。
[0066] RE分化培养基的配方：溶剂为水；溶质及其浓度如下：NH4NO3 1.65g/L、KNO31.9g/L、KH2PO4 0.17g/L、MgSO4·7H2O 0.7g/L、CaCl2·2H2O 0.44g/L、MnSO4·4H2O 22.3mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、H3BO3 6.2mg/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、CoCl2·6H2O
0.025mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2-EDTA·2H2O 37.3mg/L、肌醇100mg/L、烟酸(B5)0.5mg/L、盐酸吡哆醇(维生素B6)0.5mg/L、盐酸硫胺素(维生素B1)0.1mg/L，蔗糖30g/L，山梨醇30g/L，酸水解酪蛋白2g/L，a-萘乙酸0.02mg/L,激动素
2mg/L，呋喃甲基腺嘌呤2mg/L，植物凝胶4g/L。
0.025mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2-EDTA·2H2O 37.3mg/L、肌醇100mg/L、烟酸(B5)0.5mg/L、盐酸吡哆醇(维生素B6)0.5mg/L、盐酸硫胺素(维生素B1)0.1mg/L，蔗糖30g/L，山梨醇30g/L，酸水解酪蛋白2g/L，a-萘乙酸0.02mg/L,激动素
2mg/L，呋喃甲基腺嘌呤2mg/L，植物凝胶4g/L。
[0067] T1代表示T0代自交产生的种子及由它所长成的植株，T2代表示T1代自交产生的种子及由它所长成的植株，T3代表示T2代自交产生的种子及由它所长成的植株，T4代表示T3代自交产生的种子及由它所长成的植株，T5代表示T4代自交产生的种子及由它所长成的植株。
[0068] 6、转基因水稻株系的PCR鉴定
[0069] 分别取T0代植株和T1代植株进行分子鉴定。分子鉴定的方法：提取基因组DNA，将基因组DNA作为模板用HPT-F和HPT-R组成的引物对组成的引物对进行PCR鉴定（HPT-F：5'-TACTTCTACACAGCCATC-3'；HPT-R：5'-CGTCTGTCGAGAAGTTTC-3'；靶序列为载体骨架上潮霉素磷酸转移酶基因的部分序列，如果得到约947bp的扩增产物，鉴定结果为阳性），PCR鉴定为阳性的植株即转基因植株。对于某一T0代植株，如果其T1代植株均PCR鉴定为阳性，则该植株为纯合的转基因植株，该植株及其后代即为1个纯合的转基因株系。
[0070] 采用重组质粒pCOU OsSPX1_antisense进行步骤1至6得到的纯合的转基因株系为抑制表达株系，共获得9个抑制表达株系。部分T0代植株的鉴定结果见图2A。从9个抑制表达株系中随机取两个株系(Anti-line1和Anti-line2)进行实施例4和实施例5。
[0071] 采用重组质粒pCOU OsSPX1进行步骤1至6得到的纯合的转基因株系为过表达株系，共获得8个过表达株系。部分T0代植株的鉴定结果见图2B。从8个过表达株系中随机取两个株系（Ox-line1和Ox-line2）进行实施例4和实施例5。
[0072] 实施例4、转基因水稻的实时定量RT-PCR检测
[0073] 分别取日本晴、Ox-line1的T1代植株、Ox-line2的T1代植株、Anti-line1的T1代植株和Anti-line2的T1代植株的旗叶（均为在大田种植约120天的植株），利用TRIZOL试剂提取总RNA，以此RNA为模板，使用M-MLV反转录酶进行反转录得到cDNA，以此cDNA为模板，进行实时定量PCR检测。
[0074] 用于鉴定Anti-line1植株和Anti-line2植株中OsSPX1基因表达情况的引物对如下（靶序列对应OsSPX1基因编码区，对应序列表序列3的第362-473位，约112bp）：
[0075] 5'-GTACACTGCATGACCTTGATCTTGA-3'；
[0076] 5'-CCGAGAGTTCATGAAAGAGGATGTAG-3'。
[0077] 用于鉴定Ox-line1植株和Ox-line2植株中OsSPX1基因表达情况的引物对如下（靶序列对应OsSPX1基因的3'UTR区，对应序列表序列3的第4233-4485位，约253bp）：
[0078] 5'-GCAAGGAGATCGTCGACTTC-3'；
[0079] 5'-GCCCCAGTCCTCTTGTCATA-3'。
[0080] 用于鉴定内标基因的引物对如下（靶序列对应18s rRNA，约180bp）：
[0081] 5'-GCTTTGGTGACTCTAGATAAC-3'；
[0082] 5'-GTCGGGAGTGGGTAATTTGC-3'。
[0083] 实时定量PCR反应体系：4μl cDNA模板（2ng/μl），4.5μl SYBR Green Master Mix，1μl特异引物，0.5μl ddH2O。
[0084] 实时定量PCR扩增程序(利用MJ Research公司生产的检测系统)：95℃5min，1个循环；95℃30s，60℃30s（读板，read plate），85℃1s（读板，read plate），共40个循环；72℃2min，65℃-95℃（每隔0.2℃作溶解曲线）。
[0085] 进行三次重复实验，结果取平均值。
[0086] Ox-line1植株和Ox-line2植株中OsSPX1基因的相对表达水平见图3A。Ox-line1植株和Ox-line2植株中OsSPX1基因的表达量明显高于日本晴。
[0087] Anti-line1植株和Anti-line2植株中OsSPX1基因的相对表达水平见图3B。Anti-line1植株和Anti-line2植株中OsSPX1基因的表达量明显低于日本晴。
[0088] 实施例5、转基因水稻的小花表型及花粉育性的观察统计
[0089] 分别取日本晴、Ox-line1的T5代植株、Ox-line2的T5代植株、Anti-line1的T5代植株和Anti-line2的T5代植株，种植于大田中，正常管理。
[0090] 观察植株在抽穗扬花时期的表型，尤其是花器官的生长状况。小花照片见图4A，雄蕊照片见图4B。各个株系的小花在外观表型上无明显差异。Ox-line1植株、Ox-line2植株和日本晴的小花表型和雄蕊表型都一致。与日本晴和过表达株系相比，Anti-line1植株和Anti-line2植株的雄蕊松散、花药较小并呈白色。
[0091] 对每个植株分别取花粉粒进行Alexander染色（参考文献：Alexander,M.P.Differential staining of aborted and nonaborted pollen.StainTechnol.1969,44,117–122.）。呈现红色的为活性花粉，不呈现红色的花粉为败育花粉。进行多次重复实验，结果取平均值。染色后的照片见图4C。各个株系的活性花粉比率（又称花粉育性，单位为%）比较结果见图5。Anti-line1植株和Anti-line2植株有花粉败育现象，败育率在50%以上，甚至可达95%以上。
[0092] 利用显微镜、扫描电镜和透射电镜进一步观察Anti-line2、日本晴和Ox-line1花药及游离花粉粒的细节（部分照片见图6）。可以明显看到：与日本晴相比，Anti-line2植株的花药囊腔不饱满，而Ox-line1植株的花药囊腔中花粉粒更多更充实；Anti-line2植株的花药内外壁的表面结构模糊，花粉干瘪无内容物，而花粉外壁明显增厚内壁缺乏，花粉败育的现象更为清晰，而Ox-line1植株的花粉粒内部的淀粉体更大，更饱满，这也与其花粉Alexander染色的情况相吻合。