一种检测甘蓝型油菜抗咪唑啉酮类除草剂基因的分子标记方法

摘要

本发明提供了一种检测甘蓝型油菜抗咪唑啉酮类除草剂基因的三引物分子标记方法，属于植物分子育种领域。将引物对AP15F/AP18R、AP15F/AP19R分别加入2个PCR反应体系对甘蓝型油菜DNA扩增，区分不含抗性基因BnALS1R的纯合体、含抗性基因BnALS1R的纯合体和含有抗性基因BnALS1R杂合体。本发明能快速、准确地检测油菜种质资源或其育种群体中是否含有抗咪唑啉酮类除草剂基因BnALS1R，更精确区分出所含除草剂基因是纯合体还是杂合体，提高对抗性基因BnALS1R的选择效率，加速抗咪唑啉酮类除草剂油菜品种的选育进程。

权利要求

1.一种检测甘蓝型油菜抗咪唑啉酮类除草剂基因BnALS1R 的分子标记引物，其特征在于：正向引物序列AP15F：5’-CTTTCGCTAGCAGGGCTAAA-3’反向引物序列AP18R：5’-CATCTTTGAAAGTGCCACAAC-3’ 反向引物序列AP19R：5’- CATCTTTGAAAGTGCCACAAT-3’。

2.权利要求1所述引物用于检测甘蓝型油菜抗咪唑啉酮类除草剂基因BnALS1R的方法，其特征在于：(1)甘蓝型油菜植株基因组DNA的提取，

(2)将权利要求1所述的3条分子标记引物AP15F/AP18R、AP15F/AP19R分别加入2个PCR反应体系，并对甘蓝型油菜种质资源或育种群体植株的DNA 进行扩增；

PCR反应体系包括: 10 ng/μL DNA模板2.0μL，10 μmol /L引物各2. 0 μL，10×酶反应缓冲液2 μL，25mmol/ L MgC121.2 μL，2.5 mmol/ L dNTP1.6 μL，5 U/L Taq酶

0.1 μL，加水至20 μL；

o o o o

PCR反应程序为94C预变性5 min，94C变性30 s，60C退火30 s，72C延伸1 min，共o o

35个循环；然后72 C 延伸5 min，12 C 冷却10 min后，将扩增产物加上样缓冲液终止反应；

(3)扩增产物在质量比浓度为1.2%的琼脂糖凝胶上电泳，经溴化乙锭染色并于凝胶成像系统下观察、记载：如果引物对AP15F/AP18R扩增产物有828bp特征条带而AP15F/AP19无特征条带，则为不含抗除草剂基因BnALS1R的纯合体；如果引物对AP15F/AP18R扩增产物无特征条带而AP15F/AP19有828bp特征条带，则为含抗除草剂基因BnALS1R的纯合体；如果2个引物对AP15F/AP18R、AP15F/AP19扩增产物都有828bp特征条带，则为含有抗除草剂基因BnALS1R的杂合体。

说明书

一种检测甘蓝型油菜抗咪唑啉酮类除草剂基因的分子标记

方法

技术领域

[0001] 本发明涉及植物分子育种领域，确切地说，涉及一种检测甘蓝型油菜抗咪唑啉酮类除草剂基因BnALS1R 的分子标记方法。

背景技术

[0002] 农田杂草严重影响油菜产量和品质，已成为油菜生产主要生物灾害之一，推广应用抗除草剂油菜是克服田间草害的重要途径。与传统油菜相比，抗除草剂油菜具有三大优越性：第一，农事操作简便、高效，种植者只需在苗期喷施1～2次除草剂就能有效杀灭田间杂草；第二，可大幅度降低油菜生产成本，增加收益；第三，可促进少耕与免耕，有利于水土保持，节省能源。然而，我国抗除草剂油菜至今尚未获准商业化种植，主要有两个原因：（1）抗除草剂油菜一般为转基因作物，进入商业化生产必须要经过严格的安全性评价（蔡丽等. 科学通报，2008，53 (13): 1544-1551）。（2）迄今为止，国内油菜抗除草剂基因均来自国外，抗性基因受国际知识产权保护，一旦商业化种植，要交纳昂贵的专利费，这将大幅度提高油菜生产成本，违背了种植抗除草剂作物的初衷（浦惠明等. 生态学报，2005，25(3)：
196-203）。

[0003] 咪唑啉酮类除草剂是目前世界油菜生产应用最广泛的一类除草剂之一，其杀草谱广(包括禾本科和阔叶杂草)、用量低、对哺乳动物低毒和对环境友好（Tan S, et al., Pest Manag Sci, 2005, 61: 246-257）。这类除草剂既可作土壤处理剂也可茎叶喷施，除草效率高、使用方便深得广大用户欢迎。研究表明，乙酰羟基酸合成酶(acetohydroxyacid synthase，AHAS)，也叫乙酰乳酸合成酶（acetolactate synthase, ALS）是咪唑啉酮类除草剂的靶酶。咪唑啉酮类除草剂通过与ALS形成复合物阻断底物进入酶活性位点通路，抑制ALS活性，导致支链氨基酸合成受阻，使植物组织失绿、黄化，最后逐渐死亡（Jennifer A M, et al., PNAS, 2006, 103: 569-573）。ALS负责催化两个平行反应，催化两分子丙酮酸缩合形成2-乙酰乳酸放出CO2，最终生成缬氨酸和亮氨酸，催化一分子丙酮酸和一分子2-氧丁酸缩合形成乙酰羟基丁酸，最终生成异亮氨酸（Ronald G D, et al., Plant Physiol Bioch, 2008, 46: 309-324）。国外通过对抗咪唑啉酮类除草剂植物的ALS基因克隆表明，抗性作物的产生是由于突变株ALS基因DNA序列产生了若干碱基位点的突变，造成编码蛋白氨基酸残基位点变异，从而引起除草剂与ALS结合方式的变化所致（Lee H, et al., PNAS, 2011, 108(21): 8909-8913）。

[0004] 采用化学诱变国外研究人员获得两个抗咪唑啉酮类除草剂咪唑乙烟酸的油菜突变体P1和P2，目前已商品化的抗咪唑啉酮油菜品种都是由这两个突变体转育而成的（Swanson E B, et al., Theor Appl Genet, 1989, 78: 525-530）。国内本单位高建芹等报道了抗咪唑啉酮类除草剂的油菜新材料（高建芹等. 植物遗传资源学报，2010，11（3）：369-373），进一步通过分子生物学技术克隆获得了抗性材料M9抗性基因BnALS1R。该基因可以通过杂交、回交等植物常规育种方法导入其它对咪唑啉酮类除草剂无抗性的油菜品种或品系，提高导入目标品种或品系对咪唑啉酮类除草剂的耐受性（胡茂龙等，抗咪唑啉酮类除草剂的甘蓝型油菜突变基因及其应用；中国专利ZL201010232607.4）。若将抗性基因导入恢复系后，F1真杂种便具有抗咪唑啉酮类除草剂特性，通过喷施除草剂可将各种类型的假杂种一次性全部杀死，提高了制种效率和种子纯度。但是抗性性状为显性性状，F1代表现为咪唑啉酮抗性，从F2代开始分离，在田间选育中需要开始每代喷施除草剂进行鉴定，如果除草剂剂量使用不当或喷施不均匀极易可能导致误选或所需要的材料死亡，而且田间常规育种选育周期长、工作量大。同时，多年连续喷施剂量过多的咪唑啉酮类除草剂可能导致土壤残留，对下茬轮作作物有一定影响。另外，在抗除草剂基因研究过程中有时需要保存不抗的材料，用作比较研究。为此，若能找到与抗性基因紧密连锁的分子标记，进行标记辅助选择，则能保留全套材料，指导田间选育，加快育种进程，研究人员也进行了大胆尝试。
Kadaru等利用水稻ALS基因的单碱基变异设计了PCR分子标记来检测水稻咪唑啉酮类除草剂抗性基因（Kadaru S, et al., Euphytica, 2008, 160: 431-438）。Lee等利用大麦ALS基因的单碱基变异设计了PCR分子标记来检测大麦咪唑啉酮类除草剂抗性基因（Lee H, et al., PNAS, 2011, 108(21): 8909-8913）。

[0005] 与水稻染色体组（2n=24）和大麦（2n=14）不同，甘蓝型油菜为不结球白菜（2n=18）和花椰菜（2n=20）融合而成的异源四倍体物种(2n＝38)。进化过程中基因组内高度重排导致了甘蓝型油菜相关基因多以基因家族的形式存在（Chen X, et al., Plant Physiol,2011, 155(2): 851-65）。ALS基因也不例外，在甘蓝型油菜基因组内共存在5个ALS基因，BnALS1 和BnALS3 在核酸和蛋白水平的同源性达98%，BnALS2 与BnALS1、BnALS3 在DNA序列上差异较大，核酸水平的同源性为85%，蛋白水平的同源性为75%，BnALS4 和BnALS5 的编码区被打断是功能缺失的ALS基因（Rutledge R G, et al., Mol Gen Genet, 1991, 229:
31-40）。ALS基因家族DNA序列的高度同源性使得设计特异分子标记来检测甘蓝型油菜对咪唑啉酮类除草剂产生抗性的突变基因相当困难。迄今为止，国内外还没有公开或发表过检测甘蓝型油菜对咪唑啉酮类除草剂抗性基因的报道。虽然可以通过DNA测序技术来检测抗性基因存在有否，但该技术操作烦琐、费用相对昂贵。因此，建立一种基于PCR的分子标记来快速、准确地检测抗性基因BnALS1R 是利用该基因进行油菜抗除草剂分子育种亟需解决的技术难题。

发明内容

[0006] 技术问题

[0007] 本发明的目的在于针对利用DNA测序技术检测抗性基因BnALS1R 产生的操作烦琐、费用昂贵等不足，根据甘蓝型油菜抗咪唑啉酮类除草剂基因BnALS1R与ALS基因DNA序列单核苷酸差异，获得与其连锁的分子标记，通过简单的方法来快捷、精确的检测抗性基因BnALS1R，并进一步进行标记辅助选择。

[0008] 技术方案

[0009] 一种检测甘蓝型油菜抗咪唑啉酮类除草剂基因BnALS1R 的分子标记引物，其特征在于：

[0010] 正向引物序列AP15F：5'-CTTTCGCTAGCAGGGCTAAA-3'

[0011] 反向引物序列AP18R：5'-CATCTTTGAAAGTGCCACAAC-3'

[0012] 反向引物序列AP19R：5'- CATCTTTGAAAGTGCCACAAT-3'

[0013] 利用上述引物快速检测甘蓝型油菜抗咪唑啉酮类除草剂基因BnALS1R的PCR分子标记方法为：

[0014] (1) 甘蓝型油菜植株基因组DNA的提取(CTAB法)，参照（Murray M G, et al., Nucleic Acids Research, 1980, 8(19): 4321-4326）。

[0015] (2) 将所述的3条分子标记引物的AP15F/AP18R、AP15F/AP19R分别加入2个PCR 反应体系，并对甘蓝型油菜种质资源或育种群体植株的DNA 进行扩增；

[0016] PCR反应体系包括: DNA模板2.0 μL（10 ng/μL），引物的各2. 0 μL（10 μmol /L），10×酶反应缓冲液2 μL，MgC12(25mmol/ L)1.2 μL，dNTP(2.5 mmol/ L )1.6 μL，Taq酶(5 U/L)0.1μL，加水至20 μL；

[0017] PCR反应程序为94oC预变性5 min，94oC变性30 s，60oC退火30 s，72oC延伸1 o omin，共35个循环；然后72 C 延伸5min，12 C冷却10min 后，将扩增产物加上样缓冲液终止反应。

[0018] (3) 扩增产物在质量比浓度为1.2%的琼脂糖凝胶上电泳，经溴化乙锭染色并于凝胶成像系统下观察、记载。

[0019] 如果引物对AP15F/AP18R扩增产物有828bp特征条带而AP15F/AP19无特征条带，则为不含抗除草剂性基因BnALS1R的纯合体；如果引物对AP15F/AP18R扩增产物无特征条带而AP15F/AP19有828bp特征条带，则为含抗除草剂性基因BnALS1R 的纯合体；如果2个引物对AP15F/AP18R、AP15F/AP19扩增产物都有828bp特征条带，则为含有抗除草剂性基因BnALS1R 杂合体。

[0020] 有益效果

[0021] 本发明提供一种检测甘蓝型油菜抗咪唑啉酮类除草剂基因BnALS1R的PCR分子标记方法，与现有技术相比，本发明具有下列优点和效果：

[0022] (1)本发明首次为我国抗咪唑啉酮类除草剂油菜选育提供了PCR分子标记，该分子标记不是与抗咪唑啉酮基因BnALS1R 连锁的分子标记，而是根据基因的突变位点设计的功能性标记，能直接反映植株的抗性，不存在由于遗传交换而造成的错误鉴定。

[0023] (2)本发明提供的分子标记方法能有效用于抗咪唑啉酮基因BnALS1R 引起的油菜对咪唑啉酮类除草剂抗性的辅助育种。常规育种方法是利用含BnALS1R基因的M9与生产上推广的主栽品种进行一系列杂交，然后在每个分离后代中喷施除草剂进行鉴定，最终选择含抗咪唑啉酮基因BnALS1R的抗性单株。在每个分离后代除草剂鉴定过程中，如果除草剂剂量使用不当或喷施不均匀极易可能导致误选或所需要的材料死亡。另外，多年连续喷施剂量过多的咪唑啉酮类除草剂可能导致土壤残留，对下茬轮作作物有一定影响。有时在抗除草剂基因研究过程中需要保存不抗的材料，用作比较研究。因此，利用与BnALS1R基因直接相关的PCR分子标记对植株DNA进行检测，可以在油菜任何时期鉴定出抗性突变基因纯合基因型单株以及优良性状的不抗单株，淘汰其它单株，这样不仅节约育种成本、减少土壤残留，而且大大提高抗咪唑啉酮油菜品种的选择进程。

[0024] (3)与通过DNA测序技术来检测抗性基因存在有否相比，本发明提供的分子标记方法仅需要2个PCR反应就能对不同抗性基因型进行鉴定，不仅能有效区别BnALS1R的纯合体和杂合体，而且由于不涉及DNA测序，因此不存在步骤操作烦琐，费用昂贵等弊端，PCR分子标记检测方法更加高效、快捷。

附图说明

[0025] 图1— 甘蓝型油菜乙酰乳酸合成酶家族基因BnALS3 的克隆电泳图

[0026] M，DNA分子量标准，片段从小到大依次为500bp、800bp、1200bp、2000bp、3000bp、4500bp；1，宁油16号（NY16）基因组为模板；2，宁油18号（NY18）基因组为模板；3，抗咪唑啉酮类除草剂甘蓝型油菜突变体M9基因组为模板。

[0027] 图2－不同来源的油菜乙酰乳酸合成酶基因BnALS1、BnALS3编码区核酸序列比较图及3条引物位置，三角形表示野生型基因BnALS1与抗性突变基因BnALS1R的单核苷酸差异（G/A），箭头表示引物位置与扩增方向。

[0028] BnALS1R.seq，甘蓝型油菜突变体M9乙酰乳酸合成酶基因BnALS1 核酸部分序列；

[0029] BnALS1-NY16.seq，宁油16号的乙酰乳酸合成酶基因BnALS1 核酸部分序列；

[0030] BnALS1-NY18.seq，宁油18号的乙酰乳酸合成酶基因BnALS1 核酸部分序列；

[0031] 以上序列BnALS1R.seq、BnALS1-NY16.seq（即NY16.seq）、BnALS1-NY18.seq（即NY18.seq）来自于此前申请的专利获得（（胡茂龙等，抗咪唑啉酮类除草剂的甘蓝型油菜突变基因及其应用；中国专利ZL201010232607.4）；

[0032] Z11524.seq，Genbank下载序列（登录号：Z11524）；

[0033] BnALS3-M9.seq，甘蓝型油菜突变体M9乙酰乳酸合成酶基因BnALS3 核酸部分序列；

[0034] BnALS3-NY16.seq，宁油16号的乙酰乳酸合成酶基因BnALS3 核酸部分序列；

[0035] BnALS3-NY18.seq，宁油18号的乙酰乳酸合成酶基因BnALS3 核酸部分序列；

[0036] Z11526.seq，Genbank下载序列（登录号：Z11526）；

[0037] 图3— PCR分子标记对不同甘蓝型油菜品种或品系中抗性基因BnALS1R 的检测[0038] M，DNA分子量标准，片段从小到大依次为500bp、800bp、1200bp、2000bp、3000bp、4500bp； 1～5和对应的1’～5’，以不含有抗性基因BnALS1R的常规油菜品种宁油12号、宁油14号、宁油16号、宁油18号、宁油20号为模板，分别用引物AP15F/18R、AP15F/19R扩增的PCR产物；6和6’，以对照H2O为模板，用引物AP15F/18R、AP15F/19R扩增的PCR产物；
7～11和对应的7’～11’， 以含有抗性基因BnALS1R 的抗咪唑啉酮甘蓝型油菜品系M9、M9-2、M9-3、M9-11、M9-14为模板，分别用引物AP15F/18R、AP15F/19R扩增的PCR产物。

[0039] 图4— PCR分子标记对F2（3075R/M9-2）群体中抗性基因BnALS1R 的基因型检测[0040] M，DNA分子量标准，片段从小到大依次为500bp、800bp、1200bp、2000bp、3000bp、4500bp； 1，3075R；2，F1（3075R/M9-2）；3，M9-2；4～24，部分的F2单株，其中6、11、14、
17、20为不含有抗性基因BnALS1R 的纯合型单株，4、5、7～9、13、15、18、19、21～23为含有抗性基因BnALS1R 的杂合型单株，10、12、16、24为含有抗性基因BnALS1R 的纯合型单株。

[0041] 图5— PCR分子标记对BC1[(3075R/M9-2)/3075R]群体中抗性基因BnALS1R的基因型检测

[0042] M，DNA分子量标准，片段从小到大依次为200bp、500bp、800bp、1200bp、2000bp、3000bp、4500bp； 1，3075R；2，M9-2；3，F1（3075R/M9-2）；4～24，部分的BC1单株，其中4、
6～8、11、13、16～18、21～22、24为含有抗性基因BnALS1R 的杂合型单株，5、9～10、12、
14～15、19～20、23为不含有抗性基因BnALS1R 的纯合型单株。

[0043] 图6— PCR分子标记对BC2[(3075R/M9-2)/ M9-2]群体中抗性基因BnALS1R的基因型检测

[0044] M，DNA分子量标准，片段从小到大依次为200bp、500bp、800bp、1200bp、2000bp；1，3075R；2，M9-2；3，F1（3075R/M9-2）； 4～24，部分的BC2单株，其中5、8、10～11、14～
15、18～20、23为含有抗性基因BnALS1R的杂合型单株，4、6～7、9、12～13、16～17、21～
22、24为含有抗性基因BnALS1R 的纯合型单株。

[0045] 图7— PCR分子标记对抗咪唑啉酮的DH株系抗性基因BnALS1R的PCR检测电泳图

[0046] M，DNA分子量标准，片段从小到大依次为500bp、800bp、1200bp、2000bp、3000bp、4500bp； 1，M9；2，宁油18号；5，阴性对照水为模板；3～4、6～24，含有抗性基因BnALS1R纯合型的抗咪唑啉酮DH株系。

具体实施方式

[0047] 下列实施中所有方法如无特别说明均为常规方法，具体实施步骤如下：

[0048] （一） 试验材料

[0049] 常规油菜品种宁油12号、宁油14号、宁油16号、宁油18号、宁油20号为江苏省审定品种；MICMS双低恢复系3075R（浦惠明等，2002，江苏农业科学，4：33-34）；抗咪唑啉酮类除草剂突变体M9（胡茂龙等，抗咪唑啉酮类除草剂的甘蓝型油菜突变基因及其应用；中国专利ZL201010232607.4）及后代选系M9-2、M9-3、M9-11、M9-14（浦惠明等，油菜抗咪唑啉酮性状的遗传及其应用. 中国油料作物学报，33（1）：15-19）

[0050] BnALS1R 基因型分离群体：F2群体（3075R/M9-2），3075R为母本，M9-2为父本杂交、自交获得；BC1群体[(3075R/M9-2)/3075R]和BC2群体[(3075R/M9-2)/M9-2]是由F1（3075R/M9-2）为母本，分别与3075R、M9-2回交获得。抗咪唑啉酮DH株系是由F1（3075R/M9）植株花粉经小孢子培养获得（胡茂龙等，抗咪唑啉酮类除草剂的甘蓝型油菜突变基因及其应用；中国专利ZL201010232607.4）。

[0051] （二） 分子标记开发

[0052] 甘蓝型油菜为不结球白菜和花椰菜融合而成的异源四倍体物种，进化过程中基因组内高度重排导致甘蓝型油菜基因多以基因家族的形式存在（Chen X, et al., Plant Physiol, 2011, 155(2): 851-65）。ALS基因也不例外，在甘蓝型油菜基因组内共存在5个ALS基因，其中BnALS1 和BnALS3 在核酸和蛋白水平的同源性达98%，BnALS2 与BnALS1、BnALS3 在DNA序列上差异较大，核酸水平的同源性为85%，BnALS4 和BnALS5 是功能缺失的ALS基因（Rutledge R G, et al., Mol Gen Genet, 1991, 229: 31-40）。在此前我们申请的专利中发现抗咪唑啉酮类除草剂突变体M9与常规油菜宁油16号、宁油18号编码ALS家族中BnALS1 的核苷酸序列存在一处单碱基变异，即M9的抗性基因BnALS1R基因序列在1933处G突变成了A，使得编码蛋白序列的638位丝氨酸（AGT）残基被天冬酰胺酸（AAT）替代（胡茂龙等，抗咪唑啉酮类除草剂的甘蓝型油菜突变基因及其应用；中国专利ZL201010232607.4）。因此，可以根据该处单碱基变异开发分子标记检测抗性基因BnALS1R。但由于ALS基因家族核酸序列的高度同源性，特别是BnALS1 和BnALS3 在核酸水平的同源性达98%，使得在基因编码区内很难开发出引物分别特异扩增BnALS1 和BnALS3 的基因片段。为此首先必须要找到这2个基因在M9、宁油16号、宁油18号之间的序列差异，通过BnALS1 和BnALS3 的序列差异设计引物特异扩增BnALS1基因序列片段，排除BnALS3基因序列对检测抗性基因的干扰。而在专利（胡茂龙等，抗咪唑啉酮类除草剂的甘蓝型油菜突变基因及其应用；中国专利ZL201010232607.4）中我们已经获得了M9、宁油16号、宁油18号的BnALS1基因全长编码序列（BnALS1R.seq、NY16.seq、NY18.seq）。为获得M9、宁油16号、宁油18号的BnALS3 基因全长编码序列，根据NCBI数据库中已知的BnALS3 基因序列（登录号Z11526），在基因编码区段两侧且与BnALS1的非同源区设计特异引物，扩增出全长的BnALS3基因。其正向引物F：5’ CGCGGTACCCTCTCTCTCTCTCATCTAACCAT 3'’和反向引物R：
5'CGCACTAGTCTCTCAGTACTTAGTGCGACC 3'。

[0053] 采用CTAB法提取M9、宁油16号、宁油18号油菜苗期叶片基因组DNA（Murray M G, et al., Nucleic Acids Research, 1980, 8(19): 4321-4326），步骤如下：

[0054] （1）取0.2g左右叶片放在研钵中，加入液氮磨碎，转入1.5ml离心管中；

[0055] （2）加700μl提取缓冲液（2％CTAB，100mM Tris pH8.0，20mM EDTA pH8.0，1.4M NaCl，临用时加1%β-Me），混匀，65℃水浴1.5h；

[0056] （3）冰上冷却，离心12000rpm，5min；

[0057] （4）吸上清，加RNase（终浓度20μg/ml）,37℃保温0.5h；

[0058] （5）加苯酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）600μl，上下混匀；

[0059] （6）离心，12000rpm，15min；

[0060] （7）取上清液，加氯仿:异戊醇（24:1）600μl，上下混匀；

[0061] （8）离心，12000rpm，15min；

[0062] （9）取上清液，加入300μl-20℃预冷的异丙醇，上下混匀，-20℃ 0.5h；

[0063] （10）离心，10000rpm，10min；

[0064] （11）沉淀用600μl 70%乙醇悬浮清洗两次；

[0065] （12）弃乙醇，真空抽干，DNA用200μl 1×TE缓冲液溶解，

[0066] （13）用1％琼脂糖凝胶电泳检测所提DNA质量，样品-20℃冷冻保存备用。

[0067] 以提取的油菜基因组DNA为模板，利用设计的正向引物F和反向引物R，在MJ Research PTC-200型PCR仪上PCR扩增获得M9、宁油16号、宁油18号BnALS3 基因全长编码序列。PCR体系含DNA模板2μL，10×酶反应缓冲液5μL，MgSO4(25mmol L)3μL，dNTP(2 mmol L )5μL，引物(10mmol L )各5μL，KOD-Plus Taq酶(1 U/L)2μL，加水至50uL。反o o o o应程序为94C预变性5 min，94C变性30 s，55C退火30 s，72C延伸2.5 min，共35个循环。利用TaKaRa宝生物工程有限公司的PCR产物平末端加A试剂盒(中国大连)进行PCR产物平末端加A后，经1.2%(V/W)琼脂糖凝胶电泳分离，电泳结果如图1。按北京Tiangen公司生产的普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（目录号：DP209）步骤进行PCR产物纯化回收，连接于克隆载体pEASY-T1上，热激转化DH5α。通过蓝白斑筛选和菌落PCR鉴定，将阳性克隆送南京金斯瑞生物有限公司测序。通过DNAMAN6.0、Sequencher、DNASTAR等生物信息学软件分析M9、宁油16号、宁油18号BnALS1 和BnALS3 基因的差异，序列比对结果如图2。

[0068] 从图2可以看出，3种油菜的BnALS1 和BnALS3 基因编码区的DNA序列高度同源，仅存在1处9个碱基插入/缺失和一些单核甘酸变异。而9个碱基插入/缺失主要是重复序列，不适合作为引物序列。因此，我们根据此前申请的专利中发现抗咪唑啉酮类除草剂突变体M9与宁油16号、宁油18号编码ALS家族中BnALS1 的核苷酸序列存在的单碱基变异（G/A），将引物序列设在BnALS1 与BnALS3 单核甘酸变异序列上（消除BnALS3 基因序列对PCR扩增的干扰），共设计30条分子标记引物（表1）。其中12条正向引物AP3F～AP14F分别与3条反向引物AP1R、AP2R、A5R配对，3条正向引物AP15F～AP17F分别与12条反向引物AP18R～AP29R配对，以提取的油菜基因组DNA为模板，在MJ Research PTC-200型PCR仪上进行PCR扩增，筛选72对分子标记引物扩增产物多态性。通过筛选获得3条分子标记引物能够检测出抗性基因BnALS1R 和敏感基因BnALS1，这3条PCR分子标记引物在基因序列上位置如图2所示，其引物序列为：

[0069] 正向引物序列AP15F：5'-CTTTCGCTAGCAGGGCTAAA-3'

[0070] 反向引物序列AP18R：5'-CATCTTTGAAAGTGCCACAAC-3'

[0071] 反向引物序列AP19R：5'- CATCTTTGAAAGTGCCACAAT-3'

[0072] 表1 设计用于检测抗性基因的分子标记引物序列（下划线加粗表示错配碱基，斜体加粗表示突变碱基）

[0073]编号 序列（5'到3'） 编号 序列（5'到3'）
AP1R CGTCTGGGAACAACCAAAAGT AP15FCTTTCGCTAGCAGGGCTAAA
AP2R GCATTGAGTCCCAAACATATGA AP16FATCCTCGACGAGCTAACCG
A5R CGAGTACGTCTGGGAACAA AP17FCTGTCGTCATCAGGCCTCG
AP3F TGTGTTACCGATGATCCCCAG AP18RCATCTTTGAAAGTGCCACAAC
AP4F TGTGTTACCGATGATCCCCAA AP19RCATCTTTGAAAGTGCCACAAT
AP5F TGTGTTACCGATGATCCCTAG AP20RCATCTTTGAAAGTGCCACTAC'
AP6F TGTGTTACCGATGATCCCTAA AP21RCATCTTTGAAAGTGCCACTAT
AP7F TGTGTTACCGATGATCCCGAG AP22RCATCTTTGAAAGTGCCACGAC
AP8F TGTGTTACCGATGATCCCGAA AP23RCATCTTTGAAAGTGCCACGAT
AP9F TGTGTTACCGATGATCCAAAG AP24RCATCTTTGAAAGTGCCAACAC'
AP10F TGTGTTACCGATGATCCAAAA ' AP25RCATCTTTGAAAGTGCCAACAT
AP11F TGTGTTACCGATGATCCTAAG AP26RCATCTTTGAAAGTGCCATCAC
AP12F TGTGTTACCGATGATCCTAAA AP27RCATCTTTGAAAGTGCCATCAT
AP13F TGTGTTACCGATGATCCGAAG AP28RCATCTTTGAAAGTGCCAGCAC
AP14F TGTGTTACCGATGATCCGAAA AP29RCATCTTTGAAAGTGCCAGCAT

[0074] （三） 分子标记验证

[0075] 苗期取鲜嫩叶片，-70℃保存备用。提取油菜基因组总DNA，方法同上。以提取的油菜基因组DNA为模板，将筛选获得的3条分子标记引物的AP15F/AP18R、AP15F/AP19R分别加入2个PCR反应体系，在MJ Research PTC-200型PCR仪上进行扩增。PCR反应体系包括: DNA模板2.0μL（10 ng/μL），引物的各2. 0 μL（10 μmol /L），10×酶反应缓冲液2μL，MgC12(25mmol/ L)1.2μL，dNTP(2.5 mmol/ L )1.6μL，Taq酶(5 U/L)0.1μL，加水至20uL；PCR反应程序为94oC预变性5 min，94oC变性30 s，60oC退火30 s，72oC延伸1 min，共35个循环；然后72 oC 延伸5min，12oC 冷却10min 后，将扩增产物加上样缓冲液终止反应。

[0076] 扩增产物在质量比浓度为1.2%的琼脂糖凝胶上电泳，经溴化乙锭染色并于凝胶成像系统下观察、记载，电泳结果见图3。引物对AP15F/AP18R特异扩增的是ALS1位点上第1933处核苷酸为G的等位位点，即未突变的油菜野生型BnALS1 基因，对除草剂敏感；引物对AP15F/AP19R特异扩增的是ALS1位点上第1933处核苷酸为A的等位位点，即突变的抗性基因BnALS1R 基因，对除草剂具有抗性。因此，以含敏感基因BnALS1 的常规油菜宁油12号、宁油14号、宁油16号、宁油18号、宁油20号为模板的引物对AP15F/AP18R扩增产物有
828bp特征条带而引物对AP15F/AP19无特征条带，而含有抗性基因BnALS1R 的抗咪唑啉酮甘蓝型油菜品系M9、M9-2、M9-3、M9-11、M9-14为模板的AP15F/AP18R扩增产物无特征条带而AP15F/AP19有828bp特征条带。为验证PCR分子标记检测单碱基变异的可靠性，待菜苗
3-5叶期用山东先达化工有限公司生产的咪唑啉酮类除草剂5.0%“豆施乐”水剂处理，处理浓度为90ga.i./hm2，15d后调查抗性表型。结果表明不含抗性基因的5个常规油菜15d全部死亡，含有抗性基因的5个品系生长正常。PCR结果与田间抗性鉴定表型一致，表明2对引物的PCR分子标记可以准确检测出油菜种质资源中抗咪唑啉酮基因BnALS1R。

[0077] （四） 分子标记在分离群体中检测

[0078] 为进一步验证2对引物PCR分子标记对甘蓝型油菜抗咪唑啉酮基因BnALS1R 杂合基因型的检测效果，在油菜苗期提取了3个BnALS1R 基因型分离群体：F2群体（3075R/M9-2）、BC1群体[(3075R/M9-2)/3075R]、BC2群体[(3075R/M9-2)/ M9-2]植株叶片DNA，进行PCR扩增。DNA提取、PCR反应、产物检测方法同上。电泳结果呈现3种特征条带，即不含抗性基因MICMS双低恢复系3075R特征条带（引物对AP15F/AP18R扩增产物有特征条带828bp而AP15F/AP19无特征条带），含有抗性基因的M9-2特征条带（引物对AP15F/AP18R扩增产物无特征条带而AP15F/AP19有特征条带828bp），同时具有双亲带型的杂合带型(引物对AP15F/AP18R扩增产物有特征条带828bp而AP15F/AP19也有特征条带828bp) (图4)。
F2群体共检测154个单株，具有3075R条带的单株35个，具有M9-2带型的单株39个，而
2
具有杂合带型的单株80个，3种基因型符合1:2:1(χ ＝0.32，0.52
条带的单株110个，具有M9-2带型的单株117个(图5)，2种基因型符合1:1(χ ＝0.45，
0.252
6)，2种基因型符合1:1(χ ＝0.37，0.50

[0079] （五） 应用分子标记鉴定获得的抗咪唑啉酮DH株系

[0080] 为再次验证PCR分子标记检测的准确性，我们在苗期提取了抗咪唑啉酮DH株系（胡茂龙等，抗咪唑啉酮类除草剂的甘蓝型油菜突变基因及其应用；中国专利ZL201010232607.4）的DNA，进行了PCR扩增。结果表明所有抗咪唑啉酮DH株系都含有抗性基因BnALS1R 特征条带（引物对AP15F/AP18R扩增产物无特征条带而AP15F/AP19有828bp特征条带）（图7），更进一步证明2对引物PCR分子标记检测抗性基因的准确性。