青蟹双顺反子病毒检测用引物组、检测方法和快速诊断试剂盒

摘要

本发明公开了一种青蟹双顺反子病毒检测用引物组、检测方法和快速诊断试剂盒，该引物组由如下四条引物组成：外引物F3、外引物B3、内引物FIP和内引物BIP。本发明的引物组、检测方法和试剂盒均可高效高特异性地检测青蟹双顺反子病毒，本发明引物组特异性强，本发明检测方法检测成本低、耗时短、产率高，特异性高，且阴阳性结果显色差异显著，验证率高，更加明显可靠；本发明中的试剂盒建立了一套经过优化的反转录—环介导等温扩增反应体系，可用于青蟹类养殖过程中各时期的青蟹双顺反子病毒跟踪检测，避免病毒传播流行，提高科学管理效率，具有很高的实用价值。

权利要求

1.一种青蟹双顺反子病毒检测用引物组，其特征在于该引物组由如下四条引物组成：内引物FIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

内引物BIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

外引物F3，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；

外引物B3，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

2. 一种青蟹双顺反子病毒快速诊断试剂盒，其特征在于：该试剂盒包含如下组分：(1) 权利要求1中所述的引物组；

(2) 阳性对照品：含有青蟹双顺反子病毒外壳蛋白基因的质粒；

(3) 显色液；

(4) LAMP反应液；

(5) Bst DNA聚合酶。

3．根据权利要求2所述的青蟹双顺反子病毒快速诊断试剂盒，其特征在于：所述的显色液为SYBR Green I。

4．根据权利要求2所述的青蟹双顺反子病毒快速诊断试剂盒，其特征在于：LAMP反应液含有1×反应缓冲液、0.2~1.8 mM dNTPs、0~1.6 M 甜菜碱和4~14µM MgSO4。

说明书

青蟹双顺反子病毒检测用引物组、检测方法和快速诊断试

剂盒

技术领域

[0001] 本发明涉及一种青蟹双顺反子病毒检测用引物组、检测方法和快速诊断试剂盒。

背景技术

[0002] 拟穴青蟹(Scylla paramamosain)（原被鉴定为锯缘青蟹（Scylla serrata））因肉质鲜美、生长迅速、分布广泛，是我国海洋渔业重要的养殖品种。但随着养殖规模的逐步扩大，病害问题也不断严重。青蟹双顺反子病毒（Mud Crab Dicistrovirus，MCDV）是在近几年的染病青蟹中新发现的一种病原体。感染MCDV的拟穴青蟹体色没有明显变化，食欲不振，活动乏力，即使白天也不会潜入沙中，可导致很高的死亡率。该病毒属于单正链RNA，双顺反子病毒科。由于发现较晚，相关研究很少。MCDV能通过浸泡、禁食浸泡、投喂、共居的方式感染拟穴青蟹。到目前为止，对于MCDV感染还没有有效的治疗方法，杜绝传染源、防止病毒的传染和流行是能够采取的主要措施，早期快速诊断双顺反子病毒是减少损失的有效途径，因此，简便快速、特异性好、灵敏度高的诊断试剂盒及其检测方法对于疾病的预防具有重要意义。

[0003] 环介导等温扩增技术（1oop-mediated isothermal amplification，简称LAMP技术），是一种体外扩增特异DNA片段的技术，具有快速、敏感、特异性强等特点，主要是利用4种不同的特异性引物（引物F3、引物B3、引物FIP和引物BIP）识别靶基因的6个特定区段，在聚合酶和等温条件下高效、快速、高特异地扩增靶序列，扩增反应结束后，可通过目测、染色剂及电泳多种方法对反应产物进行分析。LAMP中所用到的聚合酶通常都选用具有链置换特性的DNA聚合酶，如Bst DNA聚合酶。对LAMP来说，4种特异性引物的设计是其关键所在。

[0004] LAMP因其自身的优点，现已被广泛用于病原微生物，包括病毒、细菌、真菌、寄生虫等病传染性疾病的检测和诊断中，但尚未见有将LAMP用于拟穴青蟹双顺反子病毒检测的相关报道。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种对青蟹双顺反子病毒具有高特异性，可用于环介导等温扩增技术检测青蟹双顺反子病毒的引物组。

[0006] 本发明的目的还在于提供一种用上述引物组对青蟹双顺反子病毒进行快速、高效、高特异性检测的方法。

[0007] 本发明的最后一个目的在于提供含有上述引物组的快速诊断试剂盒。

[0008] 本发明的第一个目的是通过如下技术方案来实现的：一种青蟹双顺反子病毒检测用引物组，该引物组由如下四条引物组成：

[0009] 内引物FIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

[0010] 内引物BIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

[0011] 外引物F3，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；

[0012] 外引物B3，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

[0013] 本发明的青蟹双顺反子病毒检测用引物组，是基于环介导等温扩增技术，根据已公开的青蟹双顺反子病毒基因组序列，选取青蟹双顺反子病毒基因的特异性序列，然后分析设计出的，能专一性鉴别青蟹双顺反子病毒的特异性引物组，其能通过PCR来鉴定青蟹双顺反子病毒基因。

[0014] 引物设计是LAMP技术的关键所在，对于引物设计有许多的要求，如各个引物之间的距离、Tm值以及引物末端稳定性等，因此从200~300个碱基的靶序列中设计四条符合要求的引物存在很大的难度，而本发明根据靶基因序列设计了一种青蟹双顺反子病毒检测用引物组，能特异性识别靶序列上的六个独立区域，在Bst DNA聚合酶的作用下启动循环链置换反应，在靶标DNA区启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物，由于LAMP技术只有在四条引物完全识别靶序列六个结合区的情况下才能顺利进行，所以本发明的引物组在很大程度上减少了扩增反应的背景影响，大大改善了青蟹双顺反子病毒检测的特异性。

[0015] 本发明的第二个目的是通过如下技术方案来实现的：一种青蟹双顺反子病毒的检测方法，该方法是利用上述的引物组通过LAMP反应和反应后的显色反应，对待测样品中是否含有青蟹双顺反子病毒进行检测。

[0016] 本发明中的青蟹双顺反子病毒的检测方法，具体含以下步骤：

[0017] (1)提取待测样品核酸后反转录的cDNA；

[0018] (2)向反应容器中加入上述青蟹双顺反子病毒检测用引物组、LAMP反应液和Bst DNA聚合酶，恒温反应；

[0019] (3)反应结束后，向反应管中加入显色液，混匀，通过观察颜色判断待测样品中是否含有青蟹双顺反子病毒。

[0020] 本发明LAMP反应时的反应体系含有上述引物组、LAMP反应液、Bst DNA聚合酶和cDNA。

[0021] 本发明所述引物组中内、外引物的摩尔浓度比优选为2~9:1。

[0022] 本发明所述引物组中内、外引物的摩尔浓度比最佳为4:1。

[0023] 本发明LAMP反应时的反应温度优选为56.2~64.5℃，最佳为62℃，反应时间优选为40~70min，最佳为60min。

[0024] 本发明显色反应时采用的显色液优选为SYBR Green I。

[0025] 本发明中的LAMP反应体系和反应条件可参考本领域的常规操作或LAMP试剂盒的说明。

[0026] 本发明的LAMP 反应的25μL反应 体系中优 选含有：0.4~1.8μM FIP、0.4~1.8μMBIP、0.2μM F3、0.2μM B3、13~21μL LAMP反应液、8units Bst DNA聚合酶和
1~2μLcDNA。

[0027] 本发明中LAMP反应时，在13~21μLLAMP反应液的配方含以下组分：1×反应缓冲液、0.2~1.8mM dNTPs、0~1.6M甜菜碱和4~14mM MgSO4。

[0028] 本发明中LAMP反应时，在13~21μLLAMP反应液的配方优选含以下组分：1×反应缓冲液、0.8mM dNTPs、0.8M甜菜碱和6mM MgSO4。

[0029] 其中所述1×反应缓冲液是本领域技术人员进行Bst DNA聚合酶扩增反应时常用的反应试剂，1×反应缓冲液其配方通常可包括如下组分：20mM pH 8.8的Tris-HCl、10mM KCl、10mM(NH4)2SO4、2mM MgSO4和体积百分含量为0.1%的TritonX-100。

[0030] 本发明的第三个目的是通过如下技术方案来实现的：一种青蟹双顺反子病毒快速诊断试剂盒，该试剂盒包含如下组分：

[0031] (1)上述引物组；

[0032] (2)阳性对照品：含有青蟹双顺反子病毒外壳蛋白基因的质粒；

[0033] (3)显色液；

[0034] (4)LAMP反应液；

[0035] (5)Bst DNA聚合酶。

[0036] 在上述试剂盒中，所述的显色液优选为SYBR Green I。

[0037] 在上述试剂盒中，LAMP反应液含有1×反应缓冲液、0.2~1.8mM dNTPs、0~1.6M甜菜碱和4~14μM MgSO4；其中，LAMP反应液中含有甜菜碱时，检测效果更好，以甜菜碱浓度为0.8M效果最佳。

[0038] 该试剂盒在使用时，先提取待测样品RNA反转录得到cDNA，然后用上述青蟹双顺反子病毒检测用引物组进行常规LAMP反应，反应后加入显色液，观察显色结果，并同时对比阳性对照品的显色结果，若显色结果一致，则说明待测样品中含有青蟹双顺反子病毒，若不一致，则说明待测样品中不含有青蟹双顺反子病毒。

[0039] 因为本发明的青蟹双顺反子病毒为RNA病毒，所以在试剂盒的制备时，可以配置有核酸提取和逆转录（RT）的试剂，会更加方便试验进展，如Trizol(总RNA提取试剂)、氯仿（可自备）、异丙醇（可自备）、体积百分含量为75%的乙醇（可自备）、无RNase水、RT反应液和反转录酶等，其中，RT反应液含有1×反应缓冲液、0.5mMdNTPs、20mg/L随机引物和200units反转录酶，反转录酶可选择本领域做RT实验时常用的反转录酶，如反转录酶M-MLV等；1×反应缓冲液含有50mM pH 8.3的Tris-HCl、75mM KCl、10mM DTT、3mM MgCl2。

[0040] 在实际操作中，该试剂盒还可以包括盒子、泡沫板等，其中泡沫板的大小与盒子的底板的大小相同，可以装在盒子中，泡沫板上有不少于用于封装反应试剂小管数量的小孔，用于封装反应试剂的小管对应置于相应的小孔中，从而使得试剂都能处于小管的下部，方便取用和吸取，也可以使取用时残留在管壁上的液体自动回到管底，节约试剂。

[0041] 上述快速诊断试剂盒的生产工艺，可以包括如下步骤：

[0042] (1)将内引物FIP/BIP和外引物F3/B3合成纯化后，定量配制，浓度检测，分装后抽样质检；

[0043] (2)将Trizol分装后抽样质检；

[0044] (3)将氯仿无菌分装，抽样质检；

[0045] (4)将异丙醇无菌分装，抽样质检；

[0046] (5)将体积百分含量为75%的乙醇无菌分装，抽样质检；

[0047] (6)将无RNase水无菌分装，抽样质检；

[0048] (7)将RT反应液无菌分装，抽样质检；

[0049] (8)将LAMP反应液无菌分装，抽样质检；

[0050] (9)将逆转录酶无菌分装，抽样质检；

[0051] (10)将Bst DNA聚合酶无菌分装，抽样质检；

[0052] (11)将显色液无菌分装，抽样质检；

[0053] (12)将阳性对照标本制备，分装，抽样质检；

[0054] (13)准备带有小孔的泡沫板；

[0055] (14)组装试剂盒。

[0056] 与现有技术相比，本发明具有如下优点：

[0057] (1)本发明的引物组在很大程度上减少了扩增反应的背景影响，大大改善了青蟹双顺反子病毒检测的特异性；

[0058] (2)采用本发明的引物组对青蟹双顺反子病毒进行检测，因为高特异性，所以可以根据是否扩增就能判断目标基因的存在与否，从而能够确定样品是否感染MCDV；

[0059] (3)本发明的快速诊断试剂盒是利用环介导等温扩增技术快速检测青蟹双顺反子病毒，检测灵敏度高，扩增模板仅需10拷贝或更少；

[0060] (4)本发明的快速诊断试剂盒不但反应条件温和，而且所需仪器简单，也不需要特殊试剂，克服了传统PCR固有的检测时间长、容易污染及检测成本高等缺点；

[0061] (5)本发明的快速诊断试剂盒扩增快速且高效，在不到1小时即可完成扩增，且产率高；

[0062] (6)本发明的快速诊断试剂盒鉴定简便，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液2+
中的Mg 结合，产生副产物—焦磷酸镁沉淀，可通过肉眼观察鉴定，并且加入显色液后，阴阳性结果显色差异显著，验证率高，更加明显可靠；

[0063] (7)本发明的快速诊断试剂盒操作简单，对检测人员的技术素质要求较低，可建立成本低廉的快速筛选体系，实现现场高通量快速检测；

[0064] (8)本发明的快速诊断试剂盒建立了一套经过优化的反转录—环介导等温扩增反应（RT-LAMP）体系，不但使得青蟹双顺反子病毒定性检测更加简便快速、特异性高、灵敏度高，而且可用于青蟹养殖过程中各时期的青蟹双顺反子病毒跟踪检测，避免病毒传播流行，提高科学管理效率，具有很高的实用价值。

附图说明

[0065] 图1为实施例1待测样品的RT-LAMP检测结果电泳图和加入显色液SYBR Green I的各反应管显色图；

[0066] 其中，M为Marker DL2000，1为阴性对照，2为阳性对照，3~10为未知的待测样品，经检测发现该8份待测样品中检测出4份含有青蟹双顺反子病毒，阳性率为50%；

[0067] 图2为实施例4的LAMP反应产物电泳图和加入显色液SYBR Green I的各反应管显色图；

[0068] 其中，M为Marker，1为阳性对照，2为待测样品的LAMP反应产物，3为阴性对照。

具体实施方式

[0069] 实施例1青蟹双顺反子病毒检测用引物组及青蟹双顺反子病毒的检测方法[0070] 1.1青蟹双顺反子病毒检测用引物组

[0071] 本实施例根据已公开的青蟹双顺反子病毒基因组序列，选取青蟹双顺反子病毒基因的特异性序列，然后分析设计出可用于LAMP检测技术的，能专一性鉴别青蟹双顺反子病毒的特异性引物组，该引物组由如下四条引物组成：

[0072] 外引物F3，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

[0073] 外引物B3，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

[0074] 内引物FIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；

[0075] 内引物BIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

[0076] 1.2青蟹双顺反子病毒的检测方法

[0077] 本实施例选择已经由RT-PCR检测的4只阳性青蟹和4只健康青蟹（如图1所示），然后分别提取这8只青蟹的鳃组织的RNA进行上述青蟹双顺反子病毒检测用引物组的有效性。

[0078] 首先将上述引物组中的四条引物送去生物公司合成，然后用反转录试剂盒将8只青蟹的RNA反转录为cDNA，接着用青蟹双顺反子病毒检测用引物组的四条引物分别对8只青蟹的cDNA进行LAMP检测，25μL LAMP反应体系含有：0.6μM FIP、0.6μM BIP、0.2μM F3、0.2μM B3、19μL LAMP反应液（含有1×反应缓冲液、0.8mM dNTPs、1M甜菜碱和8mM MgSO4）和8units Bst DNA聚合酶，1μL cDNA，56℃恒温反应60min，80℃反应10min，LAMP反应结束后，将反应产物和阳性对照一起进行琼脂糖凝胶电泳，20分钟后于凝胶成像仪上观察，电泳结果如图1所示，可以看出阳性对照和3、6、7、8号样本出现阶梯状反应条带，阴性对照无条带出现。反应结束后向各反应管中加入SYBR Green I，其中有4个管的颜色变为翠绿色，4个管没有颜色变化依然是橘红色（如图1所示）。对比RT-PCR的检测结果，发现颜色变为翠绿色且跑出LAMP梯形条带的4个管正是青蟹双顺反子病毒阳性青蟹，而没有颜色变化也没有条带的正好是正常青蟹，由此说明本发明的青蟹双顺反子病毒检测用引物组可以准确、特异性地检测出青蟹双顺反子病毒。

[0079] 实施例2青蟹双顺反子病毒快速诊断试剂盒

[0080] 本实施例的快速诊断试剂盒可用于环介导等温扩增技术快速诊断样品中是否含有青蟹双顺反子病毒，该试剂盒由青蟹双顺反子病毒检测用引物组、LAMP反应液、Bst DNA聚合酶、阳性对照品和显色液等组成，其中：

[0081] (1)青蟹双顺反子病毒检测用引物组：采用DNA合成仪，4管，内分别装外引物F3、外引物B3、内引物FIP和内引物BIP，外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，以上4种引物储存浓度分别为10μM；反应终浓度为：0.8μM FIP、0.8μM BIP、0.2μM F3、0.2μM B3；-20℃储存；

[0082] (2)配置LAMP反应液：含有1×反应缓冲液、0.8mM dNTPs、0.8M Betaine、6mM MgSO4，-20℃储存，1mL/管，1管；1×反应缓冲液含有20mM pH 8.8的Tris-HCl、10mM KCl、10mM(NH4)2SO4、2mM MgSO4和0.1%Triton X-100；-20℃储存；1mL/管,1管；

[0083] (3)购置Bst DNA聚合酶，大片段(购自New England Biolabs公司，型号M0275V，800units)，置于容器-20℃储存，50μL（400units）/管，1管；

[0084] (4)制备阳性对照品：提取含青蟹双顺反子病毒外壳蛋白基因的质粒6
DNA(10copies/μL）取含有青蟹双顺反子病毒的阳性模板，利用外引物F3/B3进行常规PCR扩增。反应体系为20μL，含有1xPCR Mix(50mM KCl，10mM Tris-HCl，1.5mMMgCl2，0.2mM dNTP混合物，0.1units/μl Taq DNA聚合酶，溴酚蓝，其他稳定剂和增强剂)8μL，0.4μM引物F3，0.4μM引物B3，灭菌超纯水6.8μL及1μL模板。PCR扩增程序：95℃预变性3min；
94℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸60s，共30个循环；72℃延伸10min，产物4℃保存。
反应完毕以1%琼脂糖凝胶电泳验证目的片段无误后，采用凝胶核酸回收试剂盒回收目的片段，按照使用说明书连接pMD18-T载体（购自TaKaRa公司），并转化入Top10感受态细胞（购自天根生物公司），通过蓝白斑筛选克隆阳性菌落，进一步分离后进行PCR扩增测序确认
6
无误后，提取质粒测OD值，稀释至10copies/μL，置于容器-20℃储存，50μL/管，1管；

[0085] (5)购置显色液：SYBR Green I，置于容器，50μL/管，1管；

[0086] 还可以含有一块泡沫板，其大小与长方体盒子的底面相同，高2.4cm，有三排孔，第一排五个孔，孔径1.4cm，第二排六个孔，孔径1.1cm，第三排六个孔，孔径0.7cm。

[0087] 将上述6个小管分别对应放置于泡沫板的孔内，装于盒中即制备得到本实施例的快速诊断试剂盒。

[0088] 本实施例快速诊断试剂盒的生产工艺，包括如下步骤：

[0089] (1)、将内引物FIP/BIP和外引物F3/B3合成纯化后，定量配制，浓度检测，分装后抽样质检；

[0090] (2)、将LAMP反应液无菌分装，抽样质检；

[0091] (3)、将Bst DNA聚合酶无菌分装，抽样质检；

[0092] (4)、将SYBR Green I无菌分装，抽样质检；

[0093] (5)、将阳性对照标本制备，分装，抽样质检；

[0094] (6)、准备带有小孔的泡沫板；

[0095] (7)、组装试剂盒。

[0096] 实施例3青蟹双顺反子病毒快速诊断试剂盒

[0097] 本实施例的快速诊断试剂盒可用于环介导等温扩增技术快速诊断样品中是否含有青蟹双顺反子病毒，该试剂盒由青蟹双顺反子病毒检测用引物组、LAMP反应液、Bst DNA聚合酶、阳性对照品、显色液、Trizol、氯仿、异丙醇、体积百分含量为75%的乙醇、无RNase水、RT反应液、反转录酶和泡沫板组成，该试剂盒提供了逆转录步骤的试剂。其中：

[0098] (1)青蟹双顺反子病毒检测用引物组：采用DNA合成仪，4管，内分别装外引物F3、外引物B3、内引物FIP和内引物BIP，外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，以上4种引物储备浓度分别为10μM；反应终浓度为：1.8μM FIP、1.8μM BIP、0.2μM F3、0.2μM B3；-20℃储存；

[0099] (2)配置LAMP反应液：含有1×反应缓冲液、0.4mM dNTPs、1.0M甜菜碱Betaine、8mM MgSO4，1mL/管，-20℃储存，1管；

[0100] (3)购置Bst DNA聚合酶(400units)，置于容器，-20℃储存，50μL/管，1管；

[0101] (4)制备阳性对照品：提取含青蟹双顺反子病毒外壳蛋白基因的质粒DNA(106copies/μL），取含有青蟹双顺反子病毒的阳性模板，利用外引物F3/B3进行常规PCR扩增。反应体系为20μL，含有1xPCR Mix(50mM KCl，10mM Tris-HCl，1.5mM MgCl2，0.2mM dNTP混合物，0.1units/μl Taq DNA聚合酶，溴酚蓝，其他稳定剂和增强剂)8μL，
0.4μM引物F3，0.4μM引物B3，灭菌超纯水6.8μL及1μL模板。PCR扩增程序：95℃预变性3min；94℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸60s，共30个循环；72℃延伸10min，产物
4℃保存。反应完毕以1%琼脂糖凝胶电泳验证目的片段无误后，采用凝胶核酸回收试剂盒回收目的片段，按照使用说明书连接pMD18-T载体（购自TaKaRa公司），并转化入Top10感受态细胞（购自天根生物公司），通过蓝白斑筛选克隆阳性菌落，进一步分离后进行PCR扩增测序确认无误后，提取质粒测OD值，稀释至106copies/μL，置于容器-20℃储存，50μL/管，
1管；

[0102] (5)购置显色液：SYBR Green I，置于容器，50μL/管，-20℃储存，1管；

[0103] (6)购置Trizol，置于容器，5mL/管，2管；

[0104] (7)购置氯仿，置于容器，2mL，1管；

[0105] (8)购置异丙醇，置于容器，5mL，1管；

[0106] (9)制备体积百分含量为75%的乙醇，置于容器，5mL/管，2管；

[0107] (10)制备无RNase水，置于容器，0.5mL/管，1管；

[0108] (11)合成随机引物，储存浓度100mg/L，反应终浓度20mg/L；0.2mL/管，-20℃储存，1管；

[0109] (12)配置RT反应液：含有1×反应缓冲液、0.5mM dNTPs、、25units RNA酶抑制剂，置于容器，0.4mL/管，-20℃储存，1管；

[0110] (13)购置反转录酶M-MLV（购自Promega公司，型号：M1701），10,000units，置于容器，-20℃储存，50μL/管，1管；

[0111] (14)一块泡沫板，其大小与长方体盒子的底面相同，高2.4cm，有三排孔，第一排五个孔，孔径1.4cm，第二排六个孔，孔径1.1cm，第三排六个孔，孔径0.7cm。

[0112] 将上述14个小管分别对应放置于泡沫板的孔内，装于盒中即制备得到本实施例的快速诊断试剂盒。

[0113] 本实施例快速诊断试剂盒的生产工艺，包括如下步骤：

[0114] (1)、将内引物FIP/BIP和外引物F3/B3合成纯化后，定量配制，浓度检测，分装后抽样质检；

[0115] (2)、将Trizol（总RNA抽提试剂）分装后抽样质检；

[0116] (3)、将氯仿无菌分装，抽样质检；

[0117] (4)、将异丙醇无菌分装，抽样质检；

[0118] (5)、将体积百分含量为75%的乙醇无菌分装，抽样质检；

[0119] (6)、将无RNase（核糖核酸酶）水无菌分装，抽样质检；

[0120] (7)、将RT（逆转录）反应液无菌分装，抽样质检；

[0121] (8)、将LAMP反应液无菌分装，抽样质检；

[0122] (9)、将反转录酶M-MLV无菌分装，抽样质检；

[0123] (10)、将Bst DNA聚合酶无菌分装，抽样质检；

[0124] (11)、将SYBR Green I无菌分装，抽样质检；

[0125] (12)、将阳性对照标本制备，分装，抽样质检；

[0126] (13)、准备带有小孔的泡沫板；

[0127] (14)、组装试剂盒。

[0128] 实施例4青蟹双顺反子病毒的检测方法

[0129] 本实施例采用实施例3中的快速诊断试剂盒，通过LAMP反应和反应后的显色反应，对待测样品中是否含有青蟹双顺反子病毒进行检测，具体步骤如下：

[0130] (1)向匀浆器中加入锯缘青蟹鳃组织约0.1克，并加入约待测样品10倍体积的Trizol液稀释，冰浴匀浆，室温静置5min；

[0131] (2)向上述匀浆液中加入200μL氯仿，上下颠倒混匀，室温静置5min；

[0132] (3)4℃，12000r/min离心10min；

[0133] (4)取300μL上清，加入等体积异丙醇，轻轻晃动后，室温静置10min；

[0134] (5)4℃，12000r/min离心10min；

[0135] (6)弃上清，用1mL预冷的75%乙醇洗涤2次，4℃，10000r/min离心5min；

[0136] (7)空气干燥，加20-50μL无RNase水溶解，得到RNA提取液；

[0137] (8)将2μL上述RNA提取液与0.5μg随机引物混合后，补无RNase水至15μL在70℃温育5min，立即置于冰上冷却；

[0138] (9)取冷却后的混合液，1μL反转录酶M-MLV，一起加入到9μLRT反应液中，37℃孵育1h；然后95℃处理5min，得到的cDNA即为LAMP反应模板；

[0139] (10)按照LAMP反应体系为1.0μM FIP、1.0μM BIP、0.2μM F3、0.2μM B3、17μL LAMP反应液、8units Bst DNA聚合酶、1μL cDNA，将模板cDNA、引物、Bst DNA聚合酶和LAMP反应液等混合到反应管中，混匀后离心数秒，置于PCR仪中，63℃反应1小时，然后80℃，10min，4℃保存；

[0140] (11)反应结束后在反应管和阳性对照管中分别加入1μL SYBR Green I，混匀后，阳性对照管中颜色为翠绿色，而反应管中的颜色也为翠绿色(如图2所示)，说明本实施例的待测样品含有青蟹双顺反子病毒。

[0141] (12)LAMP反应结束后，将反应产物和阳性对照一起进行琼脂糖凝胶电泳，20分钟后于凝胶成像仪上观察，同时也做一个阴性对照（不含有青蟹双顺反子病毒），电泳结果如图2所示，可以看出阳性对照出现阶梯状反应条带，LAMP反应产物的电泳带和阳性对照一样，阴性对照无条带出现，说明待测样品中含有青蟹双顺反子病毒。

[0142] 上述电泳结果和显色反应结果是一致的，说明本发明的快速诊断试剂盒可准确、特异性地检测青蟹双顺反子病毒。

[0143] 以上实施例仅用于阐述本发明，而本发明的保护范围并非仅仅局限于以上实施例。所述技术领域的普通技术人员依据以上本发明公开的内容和各参数所取范围，均可实现本发明的目的。