本发明为一种微生物固定化载体及其制备方法。微生物固定化包括主体聚乙烯醇、辅料聚乙二醇4000和助型剂聚丙烯腈。所述的方法包括如下步骤：(1)配制交联液戊二醛溶液；(2)配置所述的微生物固定化载体；(3)用所述的微生物固定化载体接入微生物悬液；(4)将步骤(3)得到的接入凝胶液加入到步骤(1)得到的交联液体形成微生物活性颗粒；(5)将步骤(4)得到的微生物活性颗粒用无菌水浸泡处理、增殖培养得到微生物固定化载体。本发明微生物固定化载体具有较高的机械强度和弹性，良好的渗透性，还可多次重复使用。同时微生物增殖速度快，数量多。
1.一种微生物固定化载体,其特征在于，按重量比计所述的微生物固定化载体包括以下主要组分： 主体聚乙烯醇 10-15
所述的微生物固定化载体还有由维生素B1、维生素B6、维生素K和尼克酸组成的微生物生长因子溶液； 所述微生物固定化载体由包括如下步骤的制备方法制备： （1）配制交联液戊二醛溶液；
（2）配置聚丙烯腈-聚乙烯醇-聚乙二醇组合凝胶剂； （3）用所述的聚丙烯腈-聚乙烯醇-聚乙二醇组合凝胶剂接入微生物悬液，得到微生物凝胶液； （4）将步骤（3）得到的微生物凝胶液加入到步骤（1）得到的交联液体中，形成微生物活性颗粒； （5）将步骤（4）得到的微生物活性颗粒用无菌水浸泡处理、增殖培养得到微生物固定化载体产品； 在所述的步骤（2）中聚丙烯腈-聚乙烯醇-聚乙二醇组合凝胶剂的配制： a.将8g聚乙烯醇粉末溶解到100g水中，并分次加入1.6g重量比为2%的聚乙二醇
4000，充分搅拌，得到聚乙烯醇-聚乙二醇混合液； b.另将2.4g，重量比为3%的聚丙烯腈浸入重量10%的氢氧化钠溶液100mL，在50℃下浸泡60分钟，再用去离子水清洗5次以上，得到处理后的聚丙烯腈； c.将a和b步骤得到聚乙烯醇-聚乙二醇混合液和聚丙烯腈混合，在常温下保持30分钟，得到聚丙烯腈-聚乙烯醇-聚乙二醇组合凝胶剂； 在所述的步骤（3）微生物凝胶液混配：
在步骤（2）得到的100克左右的聚丙烯腈-聚乙烯醇-聚乙二醇组合凝胶剂中接入干重400mg的已分离正处于对数生长期的微生物悬液20mL，同时加入体积比为（0.5～2）mL/L的微生物生长因子溶液充分搅拌均匀。
2.根据权利要求1的微生物固定化载体，其特征在于所述的微生物生长因子溶液是按照如下步骤制得： （1）分别称取维生素B1、维生素B6、维生素K、尼克酸各50.0mg，分别以25%乙醇溶液溶解并定容至500mL，混匀，分别配成100mg/L的维生素B1、维生素B6、维生素K、尼克酸四种溶液，在冰箱中保存； （2）临用时分别吸取1.00mL上述配置的四种溶液，置于10mL容量瓶中，用水定容，混匀，即为每毫升相当于分别含10μg维生素B1、维生素B6、维生素K和尼克酸的微生物生长因子溶液。
3.根据权利要求1或2的微生物固定化载体的制备方法，其特征在于所述的方法包括如下步骤： （1）配制交联液戊二醛溶液；
（2）配置所述的聚丙烯腈-聚乙烯醇-聚乙二醇组合凝胶剂； （3）用所述的聚丙烯腈-聚乙烯醇-聚乙二醇组合凝胶剂接入微生物悬液，得到微生物凝胶液； （4）将步骤（3）得到的微生物凝胶液加入到步骤（1）得到的交联液体中， 形成微生物活性颗粒； （5）将步骤（4）得到的微生物活性颗粒用无菌水浸泡处理、增殖培养得到微生物固定化载体产品。
4.如权利要求3的微生物固定化载体的制备方法，其特征在于 在所述的步骤（1）中交联液配制：
配制重量比5%的戊二醛溶液500mL，并加入20g氯化钙、20g硫酸钠和1mL硫酸。
5.如权利要求3的微生物固定化载体的制备方法，其特征在于 在所述的步骤（2）中聚丙烯腈-聚乙烯醇-聚乙二醇组合凝胶剂的配制： a.将8g聚乙烯醇粉末溶解到100g水中，并分次加入1.6g重量比为2%的聚乙二醇
4000，充分搅拌，得到聚乙烯醇-聚乙二醇混合液； b.另将2.4g，重量比为3%的聚丙烯腈浸入重量10%的氢氧化钠溶液100mL，在50℃下浸泡60分钟，再用去离子水清洗5次以上，得到处理后的聚丙烯腈； c.将a和b步骤得到聚乙烯醇-聚乙二醇混合液和聚丙烯腈混合，在常温下保持30分钟，得到聚丙烯腈-聚乙烯醇-聚乙二醇组合凝胶剂。
6.如权利要求3的微生物固定化载体的制备方法，其特征在于 在所述的步骤（3）微生物凝胶液混配：
在步骤（2）得到的100克左右的聚丙烯腈-聚乙烯醇-聚乙二醇组合凝胶剂中接入干重400mg的已分离正处于对数生长期的微生物悬液20mL，同时加入体 积比为（0.5～2）mL/L的微生物生长因子溶液充分搅拌均匀。
7.如权利要求3的微生物固定化载体的制备方法，其特征在于 在所述的步骤（4）中以（15-25）滴/分钟速度将步骤（3）得到的微生物凝胶液加入到步骤（1）得到的500C交联液体中，用220rpm转速的磁力搅拌器搅拌24h形成活性颗粒。
8.如权利要求3的微生物固定化载体的制备方法，其特征在于 经所述的步骤（5）中得到的活性颗粒在室温下静置后，再以无菌水浸泡48h，冲洗净残留药液后，增殖培养，即得到微生物固定化载体产品。
9.如权利要求5的微生物固定化载体的制备方法，其特征在于 在所述的步骤（3）微生物凝胶液混配：
在步骤（2）得到的100克左右的聚丙烯腈-聚乙烯醇-聚乙二醇组合凝胶剂中接入干重400mg的已分离正处于对数生长期的微生物悬液20mL，同时加入微生物生长因子溶液，充分搅拌均匀； 在所述的步骤（4）中以（15-25）滴/分钟速度将步骤（3）得到的微生物凝胶液加入到步骤（1）得到的500C交联液体中，用220rpm转速的磁力搅拌器搅拌24h形成活性颗粒； 经所述的步骤（5）中得到的活性颗粒在室温下静置后，再以无菌水浸泡48h，冲洗净残留药液后，增殖培养，即得到微生物固定化载体产品。
一种微生物固定化载体及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及生态工程和环境工程领域，特别是涉及一种污水生化处理中的微生物固定化载体及其制备方法。
背景技术
[0002] 传统的微生物法与其他物理化学处理方法相比虽然具有其独特的优越性，但是由于在传统的微生物处理工艺中，微生物通常是在水中以悬浮状态生长的，因而存在系统内降解菌有效浓度低、反应启动慢、菌体易流失、与环境竞争力弱、抗有毒污染能力差和对废水水质水量适应性差等缺点。
[0003] 包埋固定化微生物技术表现为微生物密度高、具有抗冲击负荷及适应性广的特点。其生长与分布不会因治理底物的存在而发生改变，而且采用的包埋固定化材料和方法又有较强的针对性。因此，微生物包埋固定化技术是使微生物得到更广泛、更有效应用的一种重要手段，其在处理废水领域将有着广阔的应用前景。
[0004] 包埋法的载体品种很多，主要有天然高分子凝胶(如：琼脂、海藻酸钠、角叉莱胶等)和合成有机高分子载体(如：ACAM、PVA、聚乙酞几丁醋、光敏聚乙烯醇等)。其现有技术可见：
[0005] [1]C.Y.Chena，S.C.Chenb，M.Fingasc，C.M.Kaoa，Biodegradation of propionitrile by Klebsiella oxytoca immobilized in alginate and cellulose triacetate gel.Journal of Hazardous Materials 177(2010)856-863.[0006] [2]Amihay Freeman and Malcolm D.Lilly，Effect of processing parameters on the feasibility and operational stability of immobilized viable microbial cells.Enzyme and Microbial Technology 23：335-345，1998.
[0007] [3]T.Godjevargova a，D.Ivanova a，Z.Aleksieva b，G.Burdelova，Biodegradation of phenol by immobilized Trichosporon cutaneum R57 on modified polymer membranes.Process Biochemistry 41(2006)2342-2346.
[0008] 其中PVA因无毒、价廉、抗微生物分解和机械强度高等特点受到重视，是目前应用最多的固定化载体之一，实际常以PVA为主要包埋骨架，同时添加海藻酸钠(Na·Alg)。一些研究表明：Na·Alg与PVA联合使用，有助于固定化成型，并可提高固定化细胞的相对活性。但其存在包埋颗粒易破碎，传质阻力大，产气上浮及活性丧失大等缺陷，这些极大限制了包埋固定化技术的应用和推广。
[0009] 此外，特别是用于石油类废水处理的固定化颗粒不仅需要有良好的机械强度以抵抗物理损伤，还需要具有优良的传质性能，以保证固定化细胞体外的油类大分子和固定化细胞体内的产物可以自由扩散。为此，以往的包埋固定化配方必须加以改进，才能使其更适合处理石油类废水。
[0010] 正是基于发明一种适用于石油类污水治理的新型微生物包埋颗粒，本发明通过载体筛选、配方优化、工艺参数确定等，最终确定了适用于石油类废水的化学包埋固定化配方及优化的工艺。
发明内容
[0011] 本发明是为了解决传统微生物处理技术的不足和缺点，以及进一步改进包埋固定化微生物产品强度、通透性和微生物活性等，提出了一种微生物固定化载体及其制备方法。
[0012] 本发明之一的一种微生物固定化载体是这样实现的，
[0013] 本发明的微生物固定化载体，按重量比计所述的微生物固定化载体包括以下组分[0014]主体聚乙烯醇 10-15％
辅料聚乙二醇4000 1-5％
助型剂聚丙烯腈 1-3％
[0015] 另外，所述的微生物固定化载体还可以包括由维生素B1、维生素B6、维生素K和尼克酸组成的微生物生长因子溶液。
[0016] 在具体实施中，所述的微生物生长因子溶液是按照如下步骤制得：
[0017] (1)分别称取维生素B1、维生素B6、维生素K、尼克酸各50.0mg，分别以25％乙醇溶液溶解并定容至500mL，混匀，分别配成100mg/L的维生素B1、维生素B6、维生素K、尼克酸四种溶液，在冰箱中保存；
[0018] (2)临用时分别吸取1.00mL上述配置的四种溶液，置于10mL容量瓶中，用水定容，混匀，即为每毫升相当于分别含10μg维生素B1、维生素B6、维生素K和尼克酸的微生物生长因子溶液。
[0019] 本发明之二的的微生物固定化载体的制备方法是这样实现的：
[0020] 本发明的微生物固定化载体的制备方法依次包括如下步骤，
[0021] (1)配制交联液戊二醛溶液；
[0022] (2)配置所述的微生物固定化载体；
[0023] (3)用所述的微生物固定化载体接入微生物悬液；
[0024] (4)将步骤(3)得到的接入凝胶液加入到步骤(1)得到的交联液体形成微生物活性颗粒；
[0025] (5)将步骤(4)得到的微生物活性颗粒用无菌水浸泡处理、增殖培养得到微生物固定化载体产品。
[0026] 在具体实施中，可以这样操作，
[0027] 步骤(1)交联液配制：
[0028] 配制重量比5％的戊二醛溶液500ml，并加入20g氯化钙、20g硫酸钠和1ml硫酸。
[0029] 步骤(2)中微生物固定化载体的配制：
[0030] a.将8g聚乙烯醇粉末溶解到100g水中，并分次加入1.6g重量比为2％的聚乙二醇4000，充分搅拌，得到聚乙烯醇和聚乙二醇混合液；
[0031] b.另将2.4g重量比为3％的聚丙烯腈浸入重量10％的氢氧化钠溶液100ml，在500C下浸泡60分钟，再用去离子水清洗5次以上，得到处理后的聚丙烯腈；
[0032] c.将a和b步骤得到聚乙烯醇和聚乙二醇混合液和聚丙烯腈混合，在常温下保持30分钟，得到聚丙烯腈-聚乙烯醇-聚乙二醇组合凝胶剂，即本发明的微生物固定化载体。
[0033] 步骤(3)微生物凝胶液混配：
[0034] 在步骤(2)得到的100克左右的聚丙烯腈-聚乙烯醇组合凝胶剂中接入干重400mg的已分离正处于对数生长期的微生物悬液20ml，同时加入体积比为(0.5～2)ml/L的微生物生长因子，即相当于100克左右的微生物固定化载体中加入0.01～0.04ml，充分搅拌均匀。
[0035] 步骤(4)中以(15-25)滴/分钟速度将步骤(3)得到的微生物凝胶液加入到步骤(1)得到的50℃交联液体中，用220rpm转速的磁力搅拌器搅拌24h形成活性颗粒。
[0036] 步骤(5)中得到的活性颗粒在室温下静置后，再以无菌水浸泡48h，冲洗净残留药液后，增殖培养，即得到固定化微生物产品。
[0037] 在现有技术中，通常聚乙烯醇加热溶于水后加入交联液即发生凝胶化，从而将微生物包埋在凝胶网络中。但其存在包埋颗粒易破碎，传质阻力大，产气上浮及活性丧失大等缺陷，极大限制了固定化技术的应用和推广。
[0038] 为了获得最佳的固定化载体配方，本发明对主体和辅助材料进行了多种组合对比实验，以固定化颗粒的物理性质和固定化细胞的生理活性作为考察指标，得到了优化的固定化工艺，最终获得了优良的固定化微生物产品。
[0039] 本发明通过多次实验对其加以改进，向聚乙烯醇中加入聚乙二醇(PEG 4000)，提高了固定化产品的强度，同时增加固定化小球的微孔孔道，提高了其传质性能。为了克服聚乙烯醇附聚性，还添加一定量的聚丙烯腈作为助型剂，从而进一步增强了聚乙烯醇凝胶的成型能力。
[0040] 同时，向固定化载体中添加微生物生长因子，有效的改善了固定化微生物的微环境。生长因子的添加，对于固定化过程中微生物营养的流失，也起到了一定的补充作用，有利于维持整个固定化过程中细菌数量和活性。
[0041] 总之，为了获得最佳的固定化载体配方，本发明对主体和辅助材料进行了多种组合对比实验，以固定化颗粒的物理性质和固定化细胞的生理活性作为考察指标，得到了优化的固定化工艺，最终获得了优良的固定化微生物产品
[0042] 对比现有技术，本发明的突出优点是：
[0043] (1)本发明方法简便，条件温和，稳定性好，具有较高的细胞容量，聚合体中的细胞含量可达70％以上，同时还可有效保持细胞的酶催化活性；
[0044] (2)本发明通过多次实验对原有包埋载体进行改进，向聚乙烯醇中加入聚乙二醇(PEG 4000)，提高了包埋固定化产品的强度，同时增加包埋固定化小球的微孔孔道，提高了其传质性能；
[0045] (3)为了克服聚乙烯醇附聚性，本发明还添加一定量的聚丙烯腈作为助型剂，从而进一步增强了聚乙烯醇凝胶的成型能力；
[0046] (4)通过向固定化载体中添加针对性微生物生长因子，有效的改善了固定化微生物的微环境。生长因子的添加，对于固定化过程中微生物营养的流失，也起到了一定的补充作用，有利于维持整个固定化过程中细菌数量和活性；
[0047] (5)本发明得到的固定化微生物产品具有较高的机械强度和弹性，良好的渗透性，
