4，5二氨基1-吡唑硫酸盐降解菌及其生产的菌剂

摘要

本发明公布一种4，5二氨基1-吡唑硫酸盐降解菌及其生产的菌剂。所用的菌株为皱膜假丝酵母菌Candidarugopelliculosa的菌株L-1，保藏编号CGMCCNO.5834，主要生物学特性为兼性好氧，白色，卵形至腊肠形，大小为3.0～5.0×5.6～10.2um；菌落松脆状，浅褐色，无光泽，有纹状皱折，边缘蚀刻状；玉米粉琼脂Dalmau平板培养时有假菌丝产生；能以4，5二氨基1-吡唑硫酸盐或葡萄糖为碳源进行生长，最适生长温度为30℃。在实验室摇瓶培养条件下4，5二氨基1-吡唑硫酸盐的降解率达70％以上。该降解菌剂具有成本低，使用方便，去除效果好的优点，适合水及土壤的污染治理。

权利要求

1.4，5二氨基1-吡唑硫酸盐降解菌，其特征在于该菌株是皱膜假丝酵母菌Candida rugopelliculosa的菌株L-1，于2012年3月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号CGMCC NO.5834，主要生物学特性为兼性好氧，白色，卵形至腊肠形，大小为3.0～5.0×5.6～10.2um；菌落松脆状，浅褐色，无光泽，有纹状皱折，边缘蚀刻状；玉米粉琼脂Dalmau平板培养时有假菌丝产生；能以4，5二氨基1-吡唑硫酸盐或葡萄糖为碳源进行生长，最适生长温度为30℃。

2.一种用权利要求1所述的4，5二氨基1-吡唑硫酸盐降解菌生产的降解菌剂，通过以下方法生产而成：步骤(1).将4，5二氨基-1-吡唑硫酸盐降解菌的试管种接种于发酵培养基中，振荡培养至对数期；

步骤(2).将上述培养好的菌种按10%的接种量接种入500L种子罐，培养至对数生长期，种子罐所用的培养基配方及质量含量为：葡萄糖0.1%、蛋白胨0.5%、酵母膏0.25%，用蒸馏水配制，pH为7.2～7.5；

步骤(3).将种子液按10%接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养基与种子罐培养基相同；

在种子罐和生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1:0.6～1.2，搅拌速度为180～

240r/min，培养温度为30℃，整个工艺流程培养时间为48～60h，发酵结束后菌体数量达到

10亿个/ml以上，发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂，该液体剂即为菌剂。

说明书

4，5二氨基1-吡唑硫酸盐降解菌及其生产的菌剂

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种4，5二氨基1-吡唑硫酸盐降解菌及其生产的菌剂，是利用微生物的方法降解染料，适用于环境污染的治理。

背景技术

[0002] 随着现代合成工业的发展，大量异生化合物(Xenobiotics)进入工业废水和城市污水中，由于其本身具有的结构复杂性和生物陌生性，污染环境中能降解转化污染物的土著微生物种类和数量较少，甚至没有能降解某些特殊污染物的土著微生物。即使土著微生物群落能降解污染物但也不能足够快速地降解以阻止污染物的蔓延，当快速反应显得非常重要时，少量的土著微生物群落就不适用了，这些有毒难降解有机物很难在短时间内被常规生物处理系统中的微生物分解氧化。由于(1)原有工艺不能有效维持连续的驯化培养物；(2)废水中含有不稳定的组分，冲击负荷大；(3)有毒有机物在系统中降解速率缓慢，应用常规生物处理工艺已不能有效地予以处理，传统的废水生物处理技术面临极大挑战。为此，国外研究者提出生物强化(Bioaugmentation)技术提高现有处理工艺对有毒难降解有机物的生物降解效率。生物强化技术是指在生物处理系统中，通过投加具有特定功能的微生物、营养物或基质类似物，增强处理系统对特定污染物的降解能力，提高降解速率，达到有效处理含难降解有机物废水的目的。目前，生物强化技术的应用方式、方法有很多，生物强化技术中投加的微生物可以来源于原有处理体系，也可以是原来不存在的外源微生物或遗传工程菌。这些降解菌在纯培养体系中大多数都能表现出高活性，但在多菌株共存的生物处理系统中，投加纯培养高效降解菌株(菌剂)后，能否起到强化生物处理作用，在实际生产中，效果难以预料。要使高效菌持续发挥作用必须满足下列条件：(1)投加后菌体具有的高活性不被破坏；(2)菌体可快速降解目标污染物；(3)在系统中(如曝气池)不仅要具有竞争性生存的能力，而且生物量还应具有一定的水平。

[0003] 自然界中能降解吡唑类的微生物资源正在不断被发现，这些微生物资源为难降解有机工业废水的强化处理奠定了基础。4，5二氨基-1-吡唑硫酸盐（俗称P5）是近年来国际上新开发的应用于生产染发剂的中间体，国际上该产品耗量为1000吨/年，该产品可溶于水。4，5二氨基-1-吡唑硫酸盐对环境的污染，已严重危害着人类的健康其环境的综合治理，4，5二氨基-1-吡唑硫酸盐在环境中的降解行为一直未见有比较成熟的技术。

发明内容

[0004] 本发明的一个目的是提供了一种4，5二氨基1-吡唑硫酸盐降解菌。

[0005] 本发明提供的4，5二氨基-1-吡唑硫酸盐降解菌，其菌株是皱膜假丝酵母菌（Candida rugopelliculosa）的菌株L-1，于2012年3月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号CGMCC NO.5834，主要生物学特性为兼性好氧，白色，卵形至腊肠形，大小为3.0～5.0×5.6～10.2um；菌落松脆状，浅褐色，无光泽，有纹状皱折，边缘蚀刻状；玉米粉琼脂Dalmau平板培养时有假菌丝产生；能以4，5二氨基1-吡唑硫酸盐或葡萄糖为碳源进行生长，最适生长温度为30℃。

[0006] 本发明的另一个目的提供利用上述的4，5二氨基-1-吡唑硫酸盐降解菌生产菌剂的方法，其工艺为：斜面种—摇瓶种子液—种子罐—产品（包装剂型为液体菌剂）。

[0007] 该方法的具体步骤是：

[0008] 步骤(1).将4，5二氨基-1-吡唑硫酸盐降解菌的试管种接种于发酵培养基中，振荡培养至对数期；

[0009] 步骤(2).将上述培养好的菌种按10%的接种量接种入500L种子罐，培养至对数生长期，种子罐所用的培养基配方及质量含量为：葡萄糖0.1%、蛋白胨0.5%、酵母膏0.25%，用蒸馏水配制，pH为7.2～7.5；

[0010] 步骤(3).将种子液按10%接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养基与种子罐培养基相同；

[0011] 在种子罐和生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1:0.6～1.2，搅拌速度为180～240r/min，培养温度为30℃，整个工艺流程培养时间为48～60h，发酵结束后菌体数量达到10亿个/ml以上，发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂，该液体剂即为菌剂。

[0012] 本发明的具体有益效果：

[0013] 使用该发明的4，5二氨基-1-吡唑硫酸盐的降解菌剂具有生产使用成本低，使用方便，去除效果好的优点，适合水及土壤的污染治理。本发明对于保护生态环境，保护人类身体健康，提高农产品的附加值具有重要的意义。降解菌L-1能使4，5二氨基-1-吡唑硫酸盐的残留量降低80%以上。L-1菌株能以4，5二氨基-1-吡唑硫酸盐为碳源和能源进行生长，并可在短时间内4，5二氨基-1-吡唑硫酸盐降解。

附图说明

[0014] 图1菌株L-1菌落照片；

[0015] 图2菌株L-1电镜照片；

[0016] 图3接种量对L-1降解效率的影响；

[0017] 图4初始pH对L-1降解效率的影响；

[0018] 图5温度对L-1降解效率的影响。

具体实施方式

[0019] 4，5二氨基-1-吡唑硫酸盐降解菌，于2012年3月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号CGMCC NO.5834，分类命名是皱膜假丝酵母菌（Candida rugopelliculosa）。

[0020] 1.菌株的分离和鉴定

[0021] 取污染土壤10g，置于100ml的无菌水中，振荡5min，得土壤菌悬液；取5ml的土壤菌悬液，加入到100ml的无机盐培养基[NH4NO3：407mg/L；KH2PO4：98mg/L；K2HPO4：33mg/L；NaCl：30mg/L；MgSO4：200mg/L；pH7.0]中，添加4，5二氨基1-吡唑硫酸盐作为碳源，置于30℃，150r/min摇床培养获得富集液，连续在添加4，5二氨基1-吡唑硫酸盐的培养基平板上涂布，直到获得4，5二氨基1-吡唑硫酸盐的降解菌株。如图1、图2所示，该降解菌命名为L-1，进一步纯化并鉴定为皱膜假丝酵母菌（Candida rugopelliculosa）。L-1菌株主要生物学特性为兼性好氧，白色，卵形至腊肠形，大小为3.0～5.0×5.6～10.2um；菌落松脆状，浅褐色，无光泽，有纹状皱折，边缘蚀刻状；玉米粉琼脂Dalmau平板培养时有假菌丝产生；能以4，5二氨基1-吡唑硫酸盐或葡萄糖为碳源进行生长，最适生长温度为30℃。在实验室摇瓶培养条件下4，5二氨基1-吡唑硫酸盐的降解率达70％以上(如图1所示)。该菌可以用发酵工业通用发酵设备进行生产。

[0022] 2.实验室生物降解实验

[0023] 2.1接种量对L-1降解效率的影响

[0024] 菌株L-1在YEPD培养基（YEPD培养基配方g/l：酵母粉10g/l，蛋白胨20g/l，,葡萄糖20g/l，pH7.0）中培养至对数期，按0.5%、1%、2%、3%、4%、5%的接种量分别接种到培养液[无机盐培养基（NH4NO3：407mg/L；KH2PO4：98mg/L；K2HPO4：33mg/L；NaCl：30mg/L；MgSO4：200mg/L）；4，5二氨基1-吡唑硫酸盐：100mg/L，葡萄糖1000mg/L，pH7.0]，置于30°C、
150r/min摇床培养，在培养24h后分别测定培养液在600nm处的OD值。结果如图3所示，接种量越大，4，5二氨基1-吡唑硫酸盐的降解效率就越高；当接种量大于2%时在增大接种量对4，5二氨基1-吡唑硫酸盐降解影响不大。虽然菌体的生长量随着接种量增加而提高，考虑到菌体生长情况以及经济的原因，采用1%的接种量即可达到要求。

[0025] 2.2pH对L-1降解效率的影响

[0026] pH值是影响微生物生长和生存的另一个重要环境因素，微生物生长有一个适宜的pH值范围，超过适宜生长的pH值范围，大多数微生物都不能很好人的生长。

[0027] 菌株L-1在YEPD培养基（YEPD培养基配方：酵母粉10g/l，蛋白胨20g/l，,葡萄糖20g/l，pH7.0）中培养至对数期;按1%的接种量分别接种到七种不同pH的培养液，其中培养液[无机盐培养基（NH4NO3：407mg/L；KH2PO4：98mg/L；K2HPO4：33mg/L；NaCl：30mg/L；MgSO4：200mg/L）；4，5二氨基1-吡唑硫酸盐：100mg/L，葡萄糖1000mg/L]pH值分别调至2.0、
4.0、6.0、7.0、8.0、10.0；置于30°C、150r/min摇床培养，在培养后8h、16h、24h和32h分别测定培养液在600nm处的OD值。pH对菌株L-1生长的影响如图4所示。结果表明：L-1菌株生长的适宜pH值范围在2～7，最佳pH值为6～7。

[0028] 2.3温度对L-1降解效率的影响

[0029] 温度是影响微生物生长和生存的最重要的环境因素之一。菌株L-1在YEPD培养基（YEPD培养基配方g/l：酵母粉10g，蛋白胨20g，,葡萄糖20g，pH7.0）中培养至对数期，按1%的接种量接种到培养液[无机盐培养基（NH4NO3：407mg/L；KH2PO4：98mg/L；K2HPO4：33mg/L；NaCl：30mg/L；MgSO4：200mg/L）；4，5二氨基1-吡唑硫酸盐：100mg/L，葡萄糖1000mg/L，pH7.0]，分别置于18℃、28℃、30℃、33℃、37℃下培养，在培养后8h、16h和24h分别测定培养液在600nm处的OD值。温度对菌株L-1生长的影响如图5所示。结果表明：在实验的温度范围内，菌体均有不同程度的生长，温度为28～30℃时，生长最好，超过或低于该温度时，菌体生长速度减慢，而在37℃下培养时菌种易老化。因此，假丝酵母菌L-1的最佳生长温度为28～30℃。

[0030] 3.生产实施例

[0031] 将4，5二氨基-1-吡唑硫酸盐降解菌的试管种接种到发酵培养基中，振荡培养至对数期，准备接种种子罐；然后将上述培养好的菌种按10%的接种量接种到500L种子罐，恒温培养至对数生长期，无菌空气的通气量为1:0.6～1.2，培养温度为30℃，搅拌速度为180～240r/min，种子罐所用的培养基配方的质量含量为：葡萄糖0.1%，蛋白胨0.5%，酵母膏0.25%，用无菌水配制，pH7.2～7.5；将种子罐中的种子液按10%接种量接入生产罐中培养，生产罐所用培养基与种子罐培养基相同，无菌空气的通气量为1:0.6～1.2，培养温度为30℃，搅拌速度为180～240r/min，整个工艺流程培养时间为48～60h。发酵结束后菌体数量达到10亿个/ml以上。

[0032] 发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂。该液体剂即为菌剂。