靶向RAF1抗乙脑病毒寡核苷酸的结构和用途转让专利
申请号 : CN201210187109.1
文献号 : CN102776188B
文献日 : 2014-08-13
发明人 : 王升启 , 杨静 , 张莉 , 伯晓晨 , 何丽娜 , 韩明明 , 李康
申请人 : 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所
摘要 :
本发明涉及一种反义寡核苷酸药物的结构和用途。具体说是发现靶向RAF1蛋白激酶(RAF1，c-Raf，v-raf-leukemia viral oncogene 1)的反义寡核苷酸的结构以及这些反义寡核苷酸在制备治疗乙脑病毒感染及其相关性疾病的药物中的用途。
权利要求 :
1.与人RAF1mRNA互补的寡核苷酸在制备预防和治疗乙型脑炎病毒感染性疾病中的用途，其中所述寡核苷酸的特征是序列结构选自下列之一：
1)GTC TTC CAA GCT CCC TGT AT；
2)GCT GATAGC CAAACT GCT GA；
3)AAG TCT GAC ATC GAAATC CA；
4)GTC TGA CAT CGAAAT CCA TT；
5)GCA TCC TCAATC ATC CTG CT；
6)AGG GCT GAA GGT GAG GCT GA；
7)CCA CGA GGC CTA ATT TTG TT；
8)GAC ATG CAG GTG TTT GTA GA；
9)CGG GCA ATG TCA ATT AGC TG；
10)TGG AAG ACA GGA TCT GGG GA；
11)CGC TGA TAG CCA AAC TGC TG；
12)GGA GAA GTC TGA ACA CTG CA；
13)CAC AAG TCT GAC ATC GAA AT；
14)CAG GGT GGT GCT GAC CAT GT；
15)GCT GAA GGT GAG GCT GAT TC；
16)GGG CTG AAG GTG AGG CTG AT；
17)ACC TTT AGG ATC TTT ACT GC；
18)GCC AGG TTG TCC TTT GTC AT；
19)GGG CAA TGT CAA TTA GCT GG；
20)AAA TAG TCC ATT CCC TGA GC。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述寡核苷酸的特征是序列结构选自下列之一：
1)TGG AAG ACA GGA TCT GGG GA；
2)GGA GAA GTC TGA ACA CTG CA；
3)CAG GGT GGT GCT GAC CAT GT；
4)GGG CTG AAG GTG AGG CTG AT；
5)GGG CAA TGT CAA TTA GCT GG。
3.根据权利要求2所述的用途，其中所述寡核苷酸的特征是序列结构选自下列之一：
1)TGG AAG ACA GGA TCT GGG GA；
2)GGG CAA TGT CAA TTA GCT GG。
4.根据权利要求3所述的用途，其中所述寡核苷酸的特征是序列结构如下：
1)GGG CAA TGT CAA TTA GCT GG。
5.根据权利要求1-4所述的用途，其中所述寡核苷酸的特征是经过硫代修饰。
说明书 :
靶向RAF1抗乙脑病毒寡核苷酸的结构和用途
技术领域
[0001] 本发明涉及生物工程药物领域，具体地说是一种靶向RAF1蛋白激酶(RAF1，c-Raf，v-raf-leukemia viral oncogene 1)治疗流行性乙型脑炎病毒(简秤乙脑病毒，JEV)感染的反义寡核苷酸(ASODN，antisense oligodexynucleotide)的序列、结构及其治疗药物。
背景技术
[0002] 乙脑病毒在分类上属于黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属(Flavivirus)成员。流行性乙型脑炎(简称乙脑)国际上称为日本脑炎(Japanese encephalitis)。本病是由日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus)经蚊虫媒介叮咬传播而引起的一种中枢神经系统感染的急性传染病，也是一种人兽共患的自然疫源性疾病。临床上以高热、意识障碍、抽搐、呼吸衰竭及脑膜刺激征为特征。病死率较高，而且后遗症严重，本病对人类健康危害较大。乙脑主要在亚洲以及东南亚热带和亚热带地区的一些国家流行，我国除少数省，自治区外，大部分地区都有乙脑流行。据统计，乙型脑炎病毒每年至少造成至少50000例临床病例，其中多数为十岁以下儿童，导致约10000人死亡，有15000人左右留有严重的永久性神经系统损伤。由于乙脑是一种人畜共患的自然疫源性疾病，在一般情况下乙脑病毒在蚊-猪-蚊中循环，一旦自然条件适宜，人群免疫力下降，就有可能发生人间乙脑流行或爆发，因此必须加强乙脑的预防与控制。但是目前临床上还没有针对乙脑的特异性治疗方法和特效的治疗药物，接种疫苗仍是唯一最重要的控制措施。目前用于免疫预防的灭活疫苗主要有鼠脑纯化灭活疫苗和地鼠肾细胞灭活疫苗，它们已广泛使用多年，对乙脑发病率的下降起到了非常重要的，但是副反应大，价格较高。活疫苗和减毒活疫苗的作用比灭活更有优势，但是国际上对该疫苗安全性和生产过程质量控制方面还没有认可，因此其安全性等方面还需积累更多资料。
[0003] 因此，研究特异性高、毒副作用小的新型抗乙脑病毒感染的药物对治疗与预防病毒感染及其相关性疾病具有重要现实意义。
[0004] 病毒是一种严格的细胞内寄生物。病毒感染致病涉及病毒与机体两个复杂生物系统及其二者间的相互作用。一方面，宿主表现出对病毒感染的主动限制；另一方面，病毒会主动地通过对宿主细胞的生物大分子进行修饰，以使宿主细胞为它的复制、转录等提供必需的细胞机器。在短时间内不影响细胞存活且能为宿主细胞所能容忍的前提下，增强抗病毒信号或者阻断病毒复制所需的宿主细胞因子可以有效的抗病毒以及降低耐药毒株产生的频率。
[0005] 经研究已经证明，RAF1蛋白激酶作为重要的转录因子参与了细胞增殖与分化、凋亡、周期调控和细胞能量代谢等多个生物过程，而且该基因的抑制物有抗肿瘤作用已经得到广泛的研究。根据本发明，与人RAF1基因的mRNA互补结合的寡核苷酸能有效的抑制乙脑病毒并保护细胞使其免于乙脑病毒所致细胞病变，针对RAF1的反义寡核苷酸能特异性抑制乙脑病毒的感染复制。因此，设想其可能具有抗乙脑病毒感染的作用，从而对乙脑病毒感染相关疾病的治疗起到良好的效果。有可能成为治疗及预防乙脑病毒感染相关疾病的新型生物工程药物。
[0006] 核酸药物是一类全新的基因靶向创新药物，长期以来一直是国际研究的热点，特别是近几年小核酸的发现进一步将核酸药物的研究推向一个前所未有的发展高潮。
[0007] 反义寡核苷酸是一类经过人工合成的寡核苷酸片段，长度多为15～30个核苷酸。通过碱基互补的原理，干扰相关基因的转录和翻译，或者整个基因组的复制，其优点在于其理论上的高度靶特异性，是一种理想的具有精确选择性的基因靶向治疗药物。由于反义寡核苷酸作用的高度特异性，因此被认为是极具潜力的抗肿瘤和抗病毒新药。国外已有一些著名制药企业已将反义药物作为其新药研究开发的重点方向之一。
发明内容
[0008] 本发明的目的在于提供一种靶向RAF1阻断乙脑病毒复制、抑制这些病毒致病的寡核苷酸序列、结构及其药物。
[0009] 本研究的内容是针对RAF1mRNA(NM_002880)，利用网上服务器Soligo设计了20条针对RAF1的反义寡核苷酸，从设计的这20个碱基长度的反义寡核苷酸序列中进行初步筛选。结果显示RAF1-19和RAF1-10抑制病毒所致细胞病变作用最佳。在BHK21细胞系中以RAF1-19为代表进一步评价了抑制乙脑病毒致CPE及抑制乙脑病毒复制的特异性、剂量依赖性。
[0010] 表1反义寡核苷酸的分子设计
[0011]
[0012]
[0013] 本发明的主要内容是：选取了RAF1mRNA作为靶标进行抗JEV反义寡核苷酸的筛选和评价。
[0014] 在针对RAF1基因的20条反义寡核苷酸中，RAF1-19、RAF1-10的体外抑制细胞增殖作用最强。在2μM给药浓度时，对JEV感染后BHK21细胞的细胞增殖抑制率高于90％。结果表明硫代寡核苷酸RAF1-19、RAF1-10在体外具有抗乙脑病毒活性高的优点。
[0015] 根据本发明，发明中针对RAF1基因治疗乙脑病毒感染相关疾病的优选序列为RAF1-19、RAF1-10两条序列。
[0016] 根据本发明，为增强反义寡核苷酸的核酸酶抗性、生物利用度及组织靶向性等，本发明采取了RAF1-19、RAF1-10的硫代修饰。发明中所涉及的寡核苷酸或其修饰组成物可用于治疗乙脑病毒感染相关疾病。
[0017] 根据本发明，本发明的寡核苷酸可按本领域已知方法配成药物制剂。
[0018] 根据本发明，本发明的治疗组成，依不同情况包括特定药物的药物动力学、药代动力学、给药模式、给药途径、受者的年龄、体重、肝肾功能状态、疾病的性质、程度及治疗时限等，以适宜的剂量给药。
[0019] 本发明的实施对严重危害人类健康的乙脑病毒感染的治疗具有重要的社会效益和经济效益。附图说明：
[0020] 图1RAF1反义寡核苷酸序列RAF1-1～RAF1-10抑制乙脑病毒致细胞病变作用的筛选
[0021] 图2RAF1反义寡核苷酸序列RAF1-11～RAF1-20抑制乙脑病毒致细胞病变作用的筛选
[0022] 图3RAF1-19剂量依赖性的抑制乙脑病毒致细胞病变作用
[0023] 图4RAF1-10剂量依赖性的抑制乙脑病毒致细胞病变作用
[0024] 图5RAF1-19对BHK21细胞的毒性作用
[0025] 图6RAF1-10对BHK21细胞的毒性作用
[0026] 图7RAF1-19反义寡核苷酸序列特异性验证
[0027] 图8、RAF1-19特异且剂量依赖性地抑制乙脑病毒的RNA
[0028] 图9RAF1-19特异且剂量依赖性地抑制RAF1的蛋白表达
[0029] 图10RAF1-19显著提高JEV感染小鼠存活率
[0030] 图11RAF1-19缓解JEV病毒感染引起的小鼠体重降低
具体实施方式
[0031] 实施例一：
[0032] 本实施例主要说明靶向人RAF1基因抗乙脑病毒反义寡核苷酸的设计、合成和筛选。
[0033] 材料与方法
[0034] 1.靶向RAF1基因反义寡核苷酸的设计和合成针对RAF1mRNA(NM_002880)，利用网上服务器Soligo设计了20条针对RAF1的反义寡核苷酸，采用3900型自动DNA合成仪合成全硫代修饰的反义寡核苷酸。合成完毕浓氨水55℃切割并脱保护15小时后，经Micro PureII反相纯化柱(Oligo Prep OP120，SAVANT)纯化，紫外定量后真空干燥，-20℃保存备用。
[0035] 2.BHK21细胞、病毒和对照药物病毒通过感染BHK21细胞进行扩增繁殖，然后混匀、分装并储存在-70℃备用。使用的乙脑病毒株为京卫研株。BHK21细胞培养液为含7％胎牛血清的DMEM(GIBCO)培养液。病毒感染和细胞病变测定时使用含0.7％胎牛血清的维持液。阳性对照药物为干扰素a-2a。
[0036] 3.反义寡核苷酸的筛选BHK21细胞在含7％胎牛血清的DMEM培养基(GIBCO)中，于37℃、5％CO2培养箱中培养。观察细胞生长状态良好，培养至对数生长期后，以8000～10000个细胞/孔将细胞接种至96孔细胞培养板中，次日80～90％长满。将长满
3
80％-90％的BHK21细胞换成含0.7％胎牛血清的维持液，每孔感染病毒量1.1x10pfu，作用60min后，吸去病毒，分别把RAF1-1～2020条反义寡核苷酸序列以2μM的浓度加入96孔板内，每个序列浓度设三个复孔，并设立病毒阳性对照组和BHK细胞阴性对照组。37℃培养84h。利用Cell Counting Kit-8(DoJinDo产品)方法在酶标仪(BIO-RAD产品，型号：
Model 680)上测定细胞病变程度(以OD450表示)，计算药物的细胞病变抑制率。并按如下公式计算药物的病毒抑制率：[(OD试验-OD病毒)/(OD细胞-OD病毒)]×100。重复试验二次，计算平均值以筛选出最佳的反义寡核苷酸以进一步评价。
3
80％-90％的BHK21细胞换成含0.7％胎牛血清的维持液，每孔感染病毒量1.1x10pfu，作用60min后，吸去病毒，分别把RAF1-1～2020条反义寡核苷酸序列以2μM的浓度加入96孔板内，每个序列浓度设三个复孔，并设立病毒阳性对照组和BHK细胞阴性对照组。37℃培养84h。利用Cell Counting Kit-8(DoJinDo产品)方法在酶标仪(BIO-RAD产品，型号：
Model 680)上测定细胞病变程度(以OD450表示)，计算药物的细胞病变抑制率。并按如下公式计算药物的病毒抑制率：[(OD试验-OD病毒)/(OD细胞-OD病毒)]×100。重复试验二次，计算平均值以筛选出最佳的反义寡核苷酸以进一步评价。
[0037] 4.ASODNs抑制乙脑病毒致细胞病变剂量依赖作用参照实施例一将BHK21细胞铺板96孔细胞培养板，将长满80％-90％的BHK21细胞换成含0.7％胎牛血清的维持液，每3
孔感染病毒量1.1x10pfu，作用60min后，吸去病毒，加入不同浓度的ASODNs。RAF1-19和RAF1-10设立0.125、0.25、0.5、1.0、2.0μM五个浓度梯度，每个序列浓度设三个复孔，并设立病毒阳性对照组和BHK21细胞阴性对照组、RAF1-19随机序列(RAF1-19R)2.0μM对照。
37℃培养84h。利用Cell Counting Kit-8(DoJinDo产品)方法在酶标仪(BIO-RAD产品，型号：Model680)上测定细胞病变程度(以OD450表示)，计算药物的细胞病变抑制率。
孔感染病毒量1.1x10pfu，作用60min后，吸去病毒，加入不同浓度的ASODNs。RAF1-19和RAF1-10设立0.125、0.25、0.5、1.0、2.0μM五个浓度梯度，每个序列浓度设三个复孔，并设立病毒阳性对照组和BHK21细胞阴性对照组、RAF1-19随机序列(RAF1-19R)2.0μM对照。
37℃培养84h。利用Cell Counting Kit-8(DoJinDo产品)方法在酶标仪(BIO-RAD产品，型号：Model680)上测定细胞病变程度(以OD450表示)，计算药物的细胞病变抑制率。
[0038] 结果
[0039] 1.RAF1基因反义寡核苷酸序列的设计首先在GeneBank中检索编码RAF1的核酸序列数据库，然后使用Soligo工具设计反义寡核苷酸。反义寡核酸的设计准则如下：(1)40％≤GC％≤60％；(2)反义寡核苷酸结合自由能小于或等于-8kcal/mol。经Blast比对，与人的其他基因mRNA无同源性，最终获得了理论上靶向RAF1的反义寡核苷酸20条并对其合成(表1)。
[0040] 2.ASODNs的初步筛选用2μM的浓度对RAF1-1～RAF1-20进行初步抗JEV致细胞病变作用的筛选，结果如图1和图2所示，RAF1-19和RAF1-10序列的抗JEV的致细胞病变作用比较明显，需进一步进行验证。
[0041] 3.ASODNs抑制乙脑病毒致细胞病变剂量依赖性对上述两条反义序列进一步进行抗病毒效果的剂量依赖性验证，以确定反义药物的抗JEV病毒效果，结果如图3，图4。由图可见，对两条反义序列进一步进行剂量依赖性筛选，RAF1-19和RAF1-10抗病毒效果仍然较好，他们抑制乙脑病毒致CPE的IC50分别为0.33μM，0.58μM。
[0042] 结论
[0043] 针对RAF1的反义寡核苷酸具有体外抗JEV病毒引起的细胞病变的作用。RAF1-19和RAF1-10显示出显著的抗乙脑病毒致CPE作用，且RAF1-19的作用略优于RAF1-10。
[0044] 实施例二
[0045] 本实施例主要说明RAF1-19在细胞水平抗乙脑病毒致CPE及抑制乙脑病毒复制的特异性、剂量依赖性。
[0046] 材料和方法
[0047] 1.ODNs的毒性检测参照实施例一将BHK21细胞铺板96孔细胞培养板，将长满80％-90％的BHK21细胞换成含0.7％胎牛血清的维持液，并加入不同浓度的反义RAF1-19，RAF1-19分别设立0.5、1、2、4、8、16μM六个浓度梯度，每个浓度设立三个复孔，并设立BHK21细胞阴性对照组，37℃培养3d。利用Cell Counting Kit-8(DoJinDo产品)方法在酶标仪(BIO-RAD产品，型号：Model 680)上测定细胞病变程度(以OD450表示)，观察RAF1-19对细胞的影响。
[0048] 2.ODNs的特异性验证利用DNA随机蛋白等的设计软件SMS2(The Sequence Manipulation Suite 2)设计RAF1-19的随机序列，并通过与GeneBank联机blast序列比对，所选择的靶序列均具有很好的特异性，不会干扰人类其它正常基因的表达。参照实施例一将BHK21细胞铺板96孔细胞培养板，将长满80％-90％的BHK21细胞换成含0.7％胎3
牛血清的维持液，每孔感染病毒量1.1x10pfu，作用60min后，并加入不同浓度的RAF1-19。
RAF1-19设立0.125、0.25、0.5、1.0、2.0μM五个浓度梯度，每个序列浓度设三个复孔，并设立病毒阳性对照组和BHK21细胞阴性对照组、RAF1-19随机序列(RAF1-19R)2.0μM对照。
37℃培养84h。利用Cell Counting Kit-8(DoJinDo产品)方法在酶标仪(BIO-RAD产品，型号：Model 680)上测定细胞病变程度(以OD450表示)，计算药物的细胞病变抑制率。
牛血清的维持液，每孔感染病毒量1.1x10pfu，作用60min后，并加入不同浓度的RAF1-19。
RAF1-19设立0.125、0.25、0.5、1.0、2.0μM五个浓度梯度，每个序列浓度设三个复孔，并设立病毒阳性对照组和BHK21细胞阴性对照组、RAF1-19随机序列(RAF1-19R)2.0μM对照。
37℃培养84h。利用Cell Counting Kit-8(DoJinDo产品)方法在酶标仪(BIO-RAD产品，型号：Model 680)上测定细胞病变程度(以OD450表示)，计算药物的细胞病变抑制率。
[0049] 3.ODNs抑制乙脑病毒RNA的特异性和剂量依赖性检测参照实施例一将BHK21细胞铺板96孔细胞培养板，将长满80％-90％的BHK21细胞换成含0.7％胎牛血清的维持液，每3
孔感染病毒量1.1x10pfu，作用60min后，并加入不同浓度的反义RAF1-19。RAF1-19分别设立1.0、2.0μM两个浓度梯度，每个序列浓度设三个复孔，并设立病毒阳性对照组和BHK21细胞阴性对照组。37℃培养。24h、48h、72h后分别收集培养液上清，利用病毒RNA提取试剂盒(TIANGEN产品)提取病毒RNA，进行荧光定量PCR检测。
孔感染病毒量1.1x10pfu，作用60min后，并加入不同浓度的反义RAF1-19。RAF1-19分别设立1.0、2.0μM两个浓度梯度，每个序列浓度设三个复孔，并设立病毒阳性对照组和BHK21细胞阴性对照组。37℃培养。24h、48h、72h后分别收集培养液上清，利用病毒RNA提取试剂盒(TIANGEN产品)提取病毒RNA，进行荧光定量PCR检测。
[0050] 4.ASODNs抑制RAF1蛋白的特异性和剂量依赖性检测硫代反义寡核苷酸RAF1-19，检测其对靶蛋白RAF1表达的抑制作用。BHK21细胞培养条件同上。将BHK21细胞悬液接5
种在6孔培养板中，每孔接种培养液2mL，含1.5×10 细胞，将长满80％-90％的BHK21细胞换成含0.7％胎牛血清的维持液，并加入不同浓度的反义RAF1-19，反义寡核苷酸的浓度为1μM，2μM，设细胞对照和RAF1-19随机序列(RAF1-19R)2.0μM对照，继续培养72h，RIPA-PICT(Pharmacia)提细胞总蛋白，蛋白定量后将各提取物调至相同浓度。每孔30μg总蛋白，10％聚丙烯酰胺凝胶电泳后，并进行Western bloting观察靶基因蛋白表达情况。
种在6孔培养板中，每孔接种培养液2mL，含1.5×10 细胞，将长满80％-90％的BHK21细胞换成含0.7％胎牛血清的维持液，并加入不同浓度的反义RAF1-19，反义寡核苷酸的浓度为1μM，2μM，设细胞对照和RAF1-19随机序列(RAF1-19R)2.0μM对照，继续培养72h，RIPA-PICT(Pharmacia)提细胞总蛋白，蛋白定量后将各提取物调至相同浓度。每孔30μg总蛋白，10％聚丙烯酰胺凝胶电泳后，并进行Western bloting观察靶基因蛋白表达情况。
[0051] 结果
[0052] 1.在0-16μM范围内对BHK21细胞增殖无显著影响ASODNs分别以0.5、1、2、4、8、16μM六个浓度作用BHK21细胞，72h后参照Cell Counting Kit-8(DojinDo产品)使用说明书检测细胞毒性。结果见图5，图6。图中显示，在0-16μM范围内，ASODNs各个剂量组OD值与正常细胞对照相差不大。证明ASODNs在0-16μM范围内对BHK21细胞增殖的影响不明显，且反义RAF1-19优于RAF1-10。
[0053] 2.RAF1-19的特异性验证设计RAF1-19随机链(RAF1-19R)对其特异性进行检测。结果见如图7。由图中可见，RAF1-19随机链(RAF1-19R)对JEV感染致CPE作用无显著抑制作用，而RAF1-19抗病毒效果及剂量依赖性关系都比较好，其IC50为0.25μM。验证结果提示RAF1-19抗病毒感染致CPE作用具有很好的特异性，可作为继续验证的候选序列。
[0054] 3.RAF1-19特异且剂量依赖性地抑制了乙脑病毒的RNA水平在乙脑病毒感染后1h加入不同浓度的ODNs，24h，48h，72h后收集培养液上清，提取病毒RNA，采用荧光定量PCR方法检测ODNs对细胞培养液中乙脑病毒RNA的影响，结果(图8)显示RAF1-19可以显著抑制病毒的RNA水平，在48h时，加入2μM的给药浓度可以降低病毒RNA4倍左右。而RAF1-19R对病毒RNA无显著影响。提示RAF1-19可通过特异性抑制EV71病毒的RNA水平抑制病毒的复制。
[0055] 4RAF1-19特异且剂量依赖性地抑制了RAF1蛋白水平western blotting检测RAF1-19对RAF1蛋白表达的影响。结果见图9。由图中可见，浓度1μM、2μM的RAF1-19反义均可显著抑制靶基因蛋白的表达。随机序列对照与正常细胞相比无抑制效应。提示RAF1-19可特异性通过抑制RAF1蛋白表达而抑制乙脑病毒的复制。
[0056] 结论
[0057] RAF1-19在细胞水平可特异且剂量依赖性抑制JEV的致细胞病变作用及抑制JEV病毒的复制。
[0058] 实施例三：
[0059] 本实施例主要说明RAF1-19小鼠体内抗JEV活性评价。
[0060] 材料与方法
[0061] 订购SPF级三周龄BALB/C雌性小鼠若干，实验开始时提前对小鼠进行称重分组，每组八只小鼠，一般分为PBS对照组、JEV病毒感染组以及反义药物组(具体根据剂量浓度进行分组)，并准备好实验用的东西：1mL注射器、棉签、电子称、记录本。进行实验时，PBS对照组和JEV病毒感染组均是在一侧腹腔处根据体重注射一定量液体连续注射五天，反义药物组均在第一天先注射一定量病毒，随后注射适量的药物，后面四天接着只注射相同剂量的药物，随后再接着每天观察并称量体重进行记录，持续观察20天。
[0062] 结果
[0063] 如图10，病毒感染组从第7天开始出现小鼠死亡，到第14天，病毒感染组小鼠全部死亡，RAF1-1950mg/kg/d给药组小鼠的存活率为87.5％，。在体重方面，如图11所示，RAF1-19不同剂量给药均显著缓解了JEV病毒感染引起的小鼠体重增长缓慢。均提示RAF1-19在小鼠体内具有抑制JEV病毒感染致病作用。
[0064] 结论
[0065] RAF1-19显著提高乙脑病毒感染小鼠存活率和缓解感染引起的小鼠体重降低。