来自来源于正在生长的鹿茸的干细胞的细胞匀浆物、获得其的方法及其用途

摘要

本发明的主题是从属于在登录号DSM？ACC2854下保藏于DSMZ的、来源于正在生长的鹿茸(鹿科)的MIC-1干细胞系的细胞产生的生物活性细胞匀浆物，产生和使用所述细胞匀浆物的方法。本发明还包括包含上述匀浆物的药物或化妆品组合物。

权利要求

1.一种细胞匀浆物，其通过破坏属于在登录号DSM ACC2854下保藏于DSMZ的、来源于正在生长的鹿茸的MIC-1干细胞系的细胞而产生。

2.权利要求1的匀浆物，其特征在于使用超声进行细胞的破坏。

3.权利要求2或3的匀浆物，其特征在于1个单位的匀浆物包含来自100万个细胞的提取物。

4.一种获得根据权利要求1的生物活性细胞匀浆物的方法，其特征在于，维持细胞培养物，将细胞与培养基分离，随后用超声破坏细胞，其中所使用的细胞为在登录号DSM ACC2854下保藏于DSMZ的、来源于正在生长的鹿茸的MIC-1干细胞系的细胞。

5.权利要求4的方法，其特征在于培养为平板或悬浮培养。

6.权利要求4或5的方法，其特征在于，产生在1个单位中包含获自100万个细胞的提取物的匀浆物滴度。

7.一种包含活性成分和药学上允许的载体的药物组合物或化妆品组合物，其特征在于，活性成分为从属于在登录号DSM ACC2854下保藏于DSMZ的、来源于正在生长的鹿茸的MIC-1干细胞系的细胞产生的匀浆物。

8.权利要求7的组合物，其特征在于，1个单位的匀浆物包含来自100万个细胞的提取物。

9.权利要求7或8的组合物，其特征在于，其经设计用于局部或真皮内施用。

10.匀浆物在制备用于皮肤的医学和/或美容处理的制剂中的用途，所述匀浆物产生自属于在登录号DSM ACC2854下保藏于DSMZ的、来源于正在生长的鹿茸的MIC-1干细胞系的细胞。

11.权利要求10的用途，其特征在于，所述制剂经设计用于局部或真皮内施用。

12.匀浆物在制备用于再生选自神经、上皮和肌肉组织的组织的制剂中的用途，所述匀浆物产生自属于在登录号DSM ACC2854下保藏于DSMZ的、来源于正在生长的鹿茸的MIC-1干细胞系的细胞。

13.权利要求12的用途，其特征在于，以滴眼剂、软膏、可注射制剂或用于饱和可吸收明胶海绵的制剂的形式使用制剂。

14.权利要求13的用途，其特征在于，滴眼剂的组合物在1ml中按10U/ml50mg或10U/ml25mg的比率包含匀浆物，且包含辅助材料。

15.权利要求14的用途，其特征在于，辅助材料选自聚乙烯醇、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、苯扎氯铵和水。

16.权利要求13的用途，其特征在于，软膏按10U/ml50mg的比率包含匀浆物，可注射制剂按10U/ml100mg的比率包含匀浆物，和用于饱和可吸收明胶海绵的制剂按10U/ml100mg的比率包含匀浆物。

说明书

来自来源于正在生长的鹿茸的干细胞的细胞匀浆物、获得

其的方法及其用途

[0001] 本发明的主题是从来自正在生长的鹿茸的干细胞获得的细胞匀浆物，获得其的方法及其用途。本发明的主题也是包含上述细胞匀浆物的药物组合物或化妆品组合物。

[0002] 在现有技术中，已进行了许多努力来分离和产生稳定的干细胞系，从所述干细胞系能够产生用于不同用途的稳定制剂。

[0003] 涉及获得分化为成骨细胞的干细胞的公开的技术方案仅衍生自不同类型的人组织。申请WO 2005/085422和US 2005/0048644公开了从脂肪组织分离的、用于治疗肌肉和骨骼疾病的干细胞。申请W02005/038012公开了从人出生后组织获得能够分化成成骨细胞或成软骨细胞的干细胞的方法。申请US 2007/0122902公开了分离和培养获自脐带血的多潜能干细胞(multipotent stem cell)的方法。还已进行了尝试，以遗传修饰能够再生软骨和骨组织的细胞，这公开于专利说明US6398816中。最大的伦理争议涉及与获自胚胎组织的干细胞相关的申请(W0003068937、WO02064755、WO000385831)。

[0004] 在现有技术中被广泛描述的人干细胞的使用势必带来许多问题，这表明强烈需要在该领域进行进一步的研究。由胚胎细胞的使用必然带来的一些主要障碍是伦理问题，发生遗传缺陷的危险以及转移病毒或致癌疾病的风险。因此，强烈需要这样的干细胞系，其使用可消除上述障碍的风险。

[0005] 现有技术公开了鹿茸(deer antler)组织的性质，该组织被公认为哺乳动物组织中最快速生长的骨形式。已进行了许多尝试来利用该组织的增殖特性，特别是通过分离生长因子。申请W093/19085公开了分离生长因子(其为能够再生受损骨组织的物质)的方法。公开了获得从日本鹿(梅花鹿(Cervus nippon))的茸角分离的提取物的方法，所述提取物刺激造血干细胞和巨核细胞的增殖。申请WO 2004/112806公开了用于治疗神经元障碍的、由获自鹿茸的生长激素标志物产生的组合物。

[0006] 在2005年，本发明的作者开始研究贵族鹿(马鹿(Cervus elaphus))的茸角的生长过程。在这些实验中，MIC-1干细胞系来源于正在生长的鹿茸。将稳定的细胞系于登录号DSM ACC2854下保藏于DSMZ。在2006年，提交了专利申请P.378963，其主题包括来自正在生长的鹿茸的新型干细胞系MIC-1，正在生长的鹿茸的末端侧面碎片在产生稳定的干细胞系中的用途以及此类细胞在重建人和动物的骨及软骨损伤中的用途。目前，研究的主要方向之一是，寻找用于刺激复杂器官例如皮肤的再生过程的制剂的来源。关于组织的老化和再生过程的生理学研究已导致干细胞在这些过程中的作用的发现。

[0007] 本发明的目的是，递送基于干细胞的制剂和产物，所述制剂和产物对皮肤的再生以及其元素的重建具有有益作用。

[0008] 出人意料地发现，来自MIC-1干细胞系细胞的该细胞匀浆物在刺激皮肤的患病或受损元素的生长和再生中展示特别有益的活性。

[0009] 本发明的主题是，通过破坏来自在登录号DSM ACC2854下保藏在DSMZ的、来源于正在生长的鹿茸(鹿科)的MIC-1干细胞系的细胞而获得的细胞匀浆物。

[0010] 优选地，使用超声进行细胞的破坏和匀浆。生茸(antlerogenic)干细胞的破坏释放其中包含的活性物质，其激活再生过程。

[0011] 在本发明的优选实施方案中，1个单位的匀浆物包含来自1百万个细胞的提取物。

[0012] 本发明的下一个主题是，获得生物活性细胞匀浆物的方法，其特征在于培养细胞，随后将其与培养基分离，使用超声破坏所述细胞，其中所用的细胞为在登录号DSM ACC2854下保藏在DSMZ的、来源于正在生长的鹿茸(鹿科)的MIC-1干细胞系的细胞。

[0013] 优选地，在根据本发明的方法中，将细胞培养在板上或进行悬浮培养。

[0014] 优选地，在根据本发明的方法中，产生标准化的匀浆物，其在1个单位中包含获自100万个细胞的提取物。

[0015] 本发明的下一个主题是，包含活性成分和药学上允许的载体的药物组合物或化妆品组合物，其特征在于活性物质为来自在登录号DSMACC2854下保藏在DSMZ的、来源于正在生长的鹿茸(鹿科)的MIC-1干细胞系的细胞的匀浆物。

[0016] 优选地，所述组合物意欲用于真皮内或局部施用。

[0017] 本发明的优点首先为，标准细胞培养条件和具有高增殖潜能的细胞，以及不存在通常被用来反对关于人胚胎细胞的研究的伦理问题。

[0018] 本发明的另一个主题是，获自来源于正在生长的鹿茸(鹿科)的、在登录号DSM ACC2854下保藏于DSMZ的MIC-1干细胞系细胞的匀浆物在制备用于皮肤的医学和美容处理的制剂中的用途。

[0019] 优选地，制剂经设计用于局部或真皮内施用。

[0020] 皮肤，作为包裹器官，因其保护功能而对疾病和创伤特别易感。修复过程终生存在。由于其生物刺激性质，提取物可用于广义的再生医学和美容学中。来自MIC-1细胞系的细胞的细胞匀浆物对上皮形成具有有益作用，刺激伤口和皮肤损伤的愈合，激活毛囊，刺激胶原纤维的产生，增加成纤维细胞的增殖，且激活组织血管生成。MIC-1品系干细胞匀浆物显示影响皮肤的再生及其生物更新的性质，这使得重建老龄相关的衰退成为可能。细胞匀浆物和基于其制备的制剂可广泛地用作抗皱剂、除皱剂和防老剂(其可再生被太阳辐射损伤的皮肤，通过增加其嫩度和弹性使皮肤恢复生气)以及用于维持粘膜的化妆品。

[0021] 此外，细胞匀浆物和基于其制备的制剂可广泛用作治疗难以愈合的伤口(例如因糖尿病而产生的)、因血管疾病(例如静脉障碍(vain disorder)、雷诺病)而引起的皮肤溃疡(shinu lceration)的试剂以及用于在化疗后减轻辐射损伤和皮肤损伤的试剂。

[0022] 构成本发明的主题的细胞匀浆物和基于其制备的制剂还可用于美容医学、皮肤病学和运动医学，特别地用作试剂用于在痤疮后刺激再生，用于治愈烧伤和用于创伤后治愈血管障碍。

[0023] 本发明的主题可用作粘膜(特别地与牙周病、粘膜溃疡相关的粘膜)，例如口腔、鼻和阴道中的粘膜的生物刺激制剂。作为本发明的主题的细胞匀浆物以及由其制备的制剂也可在兽医医学中用于加速愈合和毛发再生。

[0024] 本发明的下一个主题是，通过破坏来自来源于正在生长的鹿茸(鹿科)的MIC-1干细胞系(在登录号DSM ACC2854下保藏于DSMZ)的细胞产生的细胞匀浆物在制备用于再生选自肌肉、神经和上皮组织的组织的制剂中的新用途。

[0025] 优选地，以滴眼剂、眼软膏以及可注射制剂或用于饱和可吸收明胶海绵(spongostan)的制剂的形式使用制剂。

[0026] 优选地，滴眼剂的组合物每毫升按10U/ml,50mg或10U/ml 25mg的比率包含匀浆物，且包含辅助材料。

[0027] 优选地，辅助材料选自聚乙烯醇、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、苯扎氯铵和水。

[0028] 优选地，眼软膏按10U/ml 50mg的比率包含模块(module)，可注射制剂按10U/ml100mg的比率包含匀浆物，用于饱和可吸收明胶海绵的制剂按10U/ml 100mg的比率包含匀浆物。

[0029] 本发明的主题示于图中，其中图1显示MIC-1细胞匀浆物对下列的增殖的作用：成纤维细胞(F)、肌细胞(M)、软骨细胞(CH)和肝细胞(H)。成纤维细胞-MIC-1匀浆物(F+HMIC-1)，肌细胞-MIC-1匀浆物(M+HMIC-1)，软骨细胞-MIC-1匀浆物(CH+HMIC-1)，肝细胞-MIC-1匀浆物(H+HMIC 1)；图2显示在使用浓度为50万个细胞/ml制剂的滴剂后，以像素表示的损伤的表面；图3显示了在施用浓度为50万个细胞/ml制剂的滴剂后，以像素表示的损伤的表面；图4A显示在12周的观察后无包被的神经，图4B显示分离的神经元，连接植入物与残端(stub)的可见接缝；图5显示对照组12周，坐骨神经在大鼠中的植入；
图6显示12周后的对照组，坐骨神经在大鼠中的植入；图7显示12周后的实验组，植入物的周缘再生；图8显示手术后12周的实验组，植入物的周缘再生；图9显示12周后的实验组，植入物中央的神经纤维；图10显示在180秒的视频记录后，小鼠的以厘米表示的路径长度和以秒表示的休息时间；图11A显示刚受伤后肌肉的图像，图11B显示在使用匀浆物后
14天后肌肉的图像，图11C显示刚受伤后肌肉的图像，图11D显示在使用介质14天后肌肉的图像；图12A显示来自实验组的动物：几乎未改变的骨骼肌的图像-愈合的最后阶段，图
12B显示实验组，完全再生的骨骼肌，纵向截面。已招致的损伤通过位于肌纤维中部的单独的核来确认；图13A显示组织被压碎后的对照组，其中可见肌管和形成的疤痕，图13B显示来自对照组的动物，再生受损的肌肉，在中央处存在具有再吸收组织和巨细胞的可见疤痕；
图14A表示在21天的真皮匀浆物施用后皮肤的切向截面，可见毛囊中次生毛发的数目增加以及存在许多束胶原纤维，图14B显示在21天的生理盐水(对照)施用后皮肤的对照切向截面；图15显示在21天的真皮内匀浆物施用后真皮的平行截面。万吉森染色(Van Gieson staining)显示新形成的胶原纤维；图16显示在包括皮肤的所有层的组织切片分离后第5个24小时的时期中已愈合的伤口。

[0030] 本发明的主题也示于不限定本发明的保护范围的示例性实施方案中。

[0031] 实施例1.包含来自鹿茸的间质MIC-1干细胞的匀浆物的产生

[0032] 将培养物在标准条件下，在+37℃的温度和含有5%CO2的大气下维持在培养箱中。生茸细胞是贴壁的，将其在175ml培养瓶(BD Falcon细胞培养瓶)中于Cambrex的MEM培养基中进行培养，所述培养基含有10%胎牛血清、100U/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素。来自一个瓶的效率为约3000万个细胞/14天的培养周期。在获得完全单层后，使用0.05%胰蛋白酶和0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)将细胞与培养瓶底部分离，然后转移至离心管。通过添加10ml的上清液灭活离心管中的胰蛋白酶。随后在PBS中洗涤细胞2次，将其离心出来。
在Heraeus离心机中以约1000RPM离心10分钟。倾倒掉上清液，从而产生细胞沉淀。将该细胞沉淀以每50ml的液体10亿个细胞的比率悬浮于0.9%的氯化钠中。将匀浆悬浮液在水冷式匀浆室中冷却至约4℃的温度。在钢匀浆室中(伴随持续冷却)，以20kHz的频率使用超声，进行30秒以破坏细胞(超声粉碎机UD-20,Techpan)。以生物学单位标定溶液，1个单位代表获自100万个细胞的提取物。在-80℃下冷冻贮存匀浆物。

[0033] 实施例2.含有来自鹿茸的间质干细胞MIC-1的细胞匀浆物的形式的产生[0034] 基于细胞匀浆物的制剂可以以软膏、乳膏、补药(tonic)的形式或适用于局部施用的任何其它形式存在。制剂还可具有真皮用途。软膏基质的实例为Hascobase或被专家使用的任何其它已知和常用的软膏基例如Lekobaza、无水eucerine、胆固醇软膏或凡士林(Farmacja stosowana.red.Stanislaw Janicki i Adolf Flebig,PZWL Warszawa1996)。用40g介质补充10g含50个单位的匀浆物的悬浮液。使用半自动混合仪PA 200 Alpine a(Poland)将混合物均质化。在自动装置上在50ml容积的专用容器中进行均质化，进行5分钟。

[0035] 在制备补药时，用50ml含有100个生物学单位的匀浆物的悬浮液补充50ml 96%乙醇。在冷却条件下贮存所得的制剂。

[0036] 实施例3.在单次局部或真皮内给药后检查细胞匀浆物对皮肤的作用[0037] 对4组(每组包括选自24只新西兰白兔的6个个体)中的2组进行单次局部或真皮内施用后，评估细胞匀浆物对皮肤的作用。

[0038] 在局部施用过程中，用0.5ml制剂处理兔子的一侧(在胸廓的区域中)上的6cm2的脱毛的未损伤的皮肤。用适当的介质处理另一侧上的相同表面(对照)。在96小时的时间段内检查施用的位置。

[0039] 在真皮内施用过程中，用0.5ml制剂在标记的位置处真皮内注射兔子的一侧(在2
胸廓的区域中)上的6cm 的脱毛的未损伤的皮肤。用0.5ml生理盐水注射兔子的另一侧上标记的位置，且在96小时后评估皮肤的状况。

[0040] 在单次给药后，我们观察到，在观察的第二天开始的皮肤的轻微发红，其在10天后终止。两种形式都被良好地耐受。

[0041] 实施例4.在多次局部和真皮内施用后评估细胞匀浆物对皮肤的作用[0042] 对4组(每组包含选自24只新西兰白兔的6个个体)中的2组进行多次局部或真皮内施用后，评估细胞匀浆物对皮肤的作用。

[0043] 在局部施用过程中，用0.5ml制剂处理兔子的一侧(在胸廓的区域中)上的6cm2的脱毛的未损伤的皮肤，每天一次，进行连续的28天。以与受检制剂相同的方式用适当的介质处理另一侧(对照)上的相同表面。在处理的前8个小时内多次查验施用位置，然后每天查验一次，进行随后的21天。

[0044] 在真皮内施用过程中，用0.5ml制剂处理兔子的一侧(在胸廓的区域中)上的6cm2的脱毛的未损伤的皮肤，每天一次，进行连续的14天。以与受检制剂相同的模式用适当的介质处理另一侧上的相同表面(对照)。在处理的前8个小时内多次查验施用位置，然后每天查验一次，进行随后的21天。

[0045] 在观察的第14天，在6只来自多次给药组的动物中，我们从具有浓密毛发生长的位置收集皮肤切片用于组织学评估。在来自对照组的3只动物中，从其中施用了生理盐水的位置收集组织切片，以进行组织学评估。匀浆物的真皮内施用未对皮肤造成任何损伤并且被良好地耐受。在制剂中，与对照组相比，我们在生长期观察到增加的毛发数，以及毛囊周围的毛发变密。在真皮中，我们观察到胶原纤维的数目增加。在真皮内接收MIC-1细胞匀浆物的组中，非常明确地观察到这些过程。

[0046] 用细胞处理的皮肤区域显示比用生理盐水处理的区域更快的毛发再生。在观察的第6天观察到可见的差异。对于给定的个体，在约10至14周后出现，毛发至其固有长度的完全再生，平均35至42mm。2-3周期间的毛发生长加速，且相当于约4mm/周。在对照组中未观察到显著生长。随后，每周生长2-3mm。匀浆物的真皮内施用未对皮肤造成损伤并且被良好耐受。在施用匀浆物后，与对照组相比较，组织学制剂导致次生毛发的大量生长以及新合成的胶原纤维的数量增加。

[0047] 实施例5.基于MIC-1干细胞匀浆物的软膏的作用的评估

[0048] 使用3种类型的不同浓度的软膏(1U/1g的Hascobase、0.5U/1g的Hascobase以及0.1U/1g的Hascobase)，在9只兔子(分成3组，每组3只动物)上进行评估。用1U/1g软膏处理组1的兔子，用0.5U/1g软膏处理组2，且用0.1U/1g处理组3。按照下列方法处2
理所有组：在连续28天中每天用0.5ml制剂处理兔子的一侧(在胸廓的区域中)上的6cm的脱毛的未损伤的皮肤一次。以与受检制剂相同的方式用适当的介质(Hascobase)处理对侧上的相同表面(对照)。在施用后前8个小时中多次查验施用位置，然后每天查验一次，进行随后的28天。

[0049] 在接受0.1U/1g软膏的组中未观察到增强的毛发生长。用0.5U/1g软膏处理的组，在施用后约26天观察到加速的毛发生长。在施用后约第21天，最大浓度是有效的。

[0050] 我们在处理侧和对照侧上测量组1的兔子的皮肤中的血流。

[0051] 使用激光多谱勒流量计和MBF3D(Moor Instruments Ltd)及P4s探针(直径为0.46mm)进行测量。该装置发射由功率1.5mW的半导体激光器产生的780-820nm波长的单色光。多普勒激光法基于单色光辐射至组织内的发射和返回组织表面的弥散光的检测。在光在正在运动的红细胞上散射的过程中，取决于红细胞的速度和由红细胞与光子的路径产生的角度，波的频率发生改变(多普勒现象)。具有信号转换器和分析器的适当检测装置使得能够收集关于给定的组织的血液饱和度(定义为局部血液速度与每体积光穿透的组织的平均红细胞浓度之积)的信息。一个区域的皮肤的血流测量持续1分钟。以最慢20秒流动间隔进行分析。使用相对单位(灌注单位(perfusion unit))将血液流动的程度，灌注，表示为红细胞的浓度与它们的速度之积。与对照皮肤相比较，观察到皮肤中的血液灌注增加47%。

[0052] 软膏在皮肤上的使用被良好地耐受。我们在施用区域中观察到不显著的过度灌注，在使用软膏或补药的一侧上观察到更快速的毛发再生。在收集组织样品用于组织学分析的位置上的伤口愈合比在对照侧上快得多。组织学分析显示，与接受注射形式的匀浆物的组中的变化相似的变化。

[0053] 实施例6.体外评估

[0054] 体外研究显示，包含在鹿茸中和鹿茸提取物中的物质刺激成纤维细胞、脾细胞和造血干细胞的增殖。考虑到血管肌肉在鹿茸中的存在，我们还评估了生茸细胞的匀浆物对成纤维细胞(结缔和上皮组织)、平滑肌细胞(肌肉组织)、成软骨细胞(结缔组织)、肝细胞(上皮组织)和神经元(神经组织)的作用。

[0055] 为了进行该研究，我们使用下列参照细胞系：小鼠胚胎成纤维细胞(3T3Balb/c)和来自胚胎主动脉的人肌细胞(UASMC)。原代成软骨细胞培养物来源于机械破坏的兔耳软骨碎片(约4kg体重的雌性加利福尼亚白兔)。为了建立原代肝细胞培养物和神经元培养物，我们使用从新生大鼠(Wistar)收集的器官碎片，将其进行机械破碎并且在平滑肌生长培养基(Cambrex Bio Science,Walkersville Maryland USA)中进行温育。在平滑肌生长培养基中培养肌细胞，然而将其余细胞系培养在添加了10%胎牛血清和1%的含L-谷氨酰、青霉素和链霉素的溶液(Sigma-Aldrich,Chemie,Steinheim,Germany)的DMEM (Bio Whittaker,Lonza,Verviers,Belgium)中。将培养物在37℃下在含有5%CO2的潮湿大气中进行维持。在培养瓶(75ml)中达到70%汇合所需的时间为：5天(对于肌细胞和神经元)、10天(对于成纤维细胞和成软骨细胞)和21天(对于肝细胞)。使用0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液(Sigma Aldrich)从培养瓶中取出评估的细胞，将其以100,000个细胞/孔重新接种在12孔板上。24小时后，更换培养基，以0.2单位(1个生物学单位等于从1000000个MIC-1细胞获得的匀浆物)的剂量添加MIC-1细胞的匀浆悬浮液。将板温育120小时，在该时间后，给细胞照相，使用SRB比色测试进行计数(其中SRB测试测定结合染料磺酰罗丹明B的活细胞的数目)。用50%三氯乙酸固定细胞，随后用0.4%的在1%醋酸中的SRB染色30分钟。通过在1%醋酸中漂洗，除去未结合的染料，用10mM未缓冲的Tris提取结合至细胞的蛋白质的染料。随后在Elx-800板读数器(Bio-Tek instruments,USA)上在562nm的波长处读取光密度。样品对照由用于该方法中的相同培养基组成。用于测试的全部试剂购自Sigma。

[0056] 为了评估各个组之间的结果的差异的显著性，我们使用学生氏t-检验，且对于统计学上的显著性，我们接受p<0.05。使用来自Statsoft的Statistica 7.1软件包进行所有统计分析。

[0057] 对于成纤维细胞和肌细胞，获得了增殖的最大增加，因为它们的数目分别增加了32和28%。在利用MIC-1细胞的匀浆物进行的Contra母细胞(blast)的培养中，与在未添加所述匀浆物的情况下培养的那些细胞相比较，饥饿的母细胞的数目增加19%。对于肝细胞，观察到匀浆物的相似的刺激作用，其中与未用匀浆物处理的数据点相比较，肝细的数目增加16%(图1)。这些差异在统计学上都是显著的。对于用匀浆物处理的神经元，未观察到细胞数目的增加。在用匀浆物温育所有细胞类型120小时后，它们未显示如在未用匀浆物处理的细胞的情况下观察到的衰老的征兆(皱缩)。

[0058] 引入受损组织的间质干细胞(MSC)参与受损组织的再生，且在施用后数周，它们中仅有少数得到保留，这导致结论：再生是由MSC分泌的因子引起的，其调节损伤位置的微环境，并且以该方式诱导内源宿主细胞的存活和增殖。上述因子包括调节造血、血管生成、愈合、免疫应答以及造血干细胞的动员和增殖的蛋白质。在将生茸干细胞施用至在兔子的耳和颚骨中的软骨损伤中后，观察到相似的机制。重建的组织包含未分化干细胞的浓聚物，其随时间过去经历细胞凋亡。同样地，单独的研究确认了MSC对其它细胞的存活和分泌活性的影响。MIC-1细胞参与受损组织的再生以及茸角中包含的物质对细胞的增殖和断裂处的愈合的加速的已描述的刺激作用，已导致我们研究MIC-1细胞的匀浆物在体外对不同类型的细胞的影响。获得的结果显示，MIC-1细胞的匀浆物显著刺激成纤维细胞的和肌细胞的增殖，且对成软骨细胞和肝细胞的增殖具有较小的作用。仅对于神经元，在添加匀浆物的培养过程中未观察到数目的增加。尽管如此，细胞的生存能力增强3倍，并且神经元，除它们的尺寸增加外，还产生了相互连接的致密网络。因此，添加生茸细胞匀浆物的细胞培养物在再生医学中创造了新的机会，提高了获得足够材料来充填任何组织的损伤的可能性。

[0059] 实施例7.体内测定，上皮组织(角膜)

[0060] 在本研究中，我们使用了12只兔子，幼小的8月龄雌性新西兰白色品种，体重2.5至2.9kg。在实验过程中，将动物以12小时光照:12小时黑暗的周期保持在单独的笼内，随意接触食物和水。在开始实验之前，已检查了所有兔子的眼睛以消除角膜或结膜以及眼球前段(anterior eyeball)(前房和虹膜)的任何程度的障碍。我们进行荧光素测定(在给结膜施用2%的荧光素溶液后，使用钴滤色片评估前段部分)且使用裂隙灯(slot lamp)进行评估。未观察到异常。在每一只动物中，检查一只眼睛并且另一只眼睛构成对照。以下列方式进行角膜上皮的磨损。在用爱尔卡因(盐酸丙美卡因,5mg/ml,Alcon)溶液局部麻醉后，通过应用在正庚醇(Sigma Aldrich)中浸透的Whatman#1组织的直径3mm的圆盘来损伤每一只兔子的双眼的角膜上皮。将所述圆盘应用至角膜中心并且原位停留30秒，在移走其后，用等渗盐水0.9%NaCl漂洗眼睛。在整个实验中，在6只兔子中，每天以相等的间隔(每8小时)用浓度为0.5U/ml(编号1滴眼剂)(3只眼)和0.25U/ml(编号2滴眼剂)(3只眼)的匀浆物以3滴的比率处理右眼(实验眼)3次直至最后一天。一个生物学单位等于获自1000000个MIC-1细胞的匀浆物(其相应于置于100mg蒸馏水中的1mg的细胞团)。使用介质以相同的方式和体积处理左眼，组成对照。在另外6只兔子中，我们以软膏形式使用与滴眼剂相同浓度的匀浆物。将这些匀浆物以胡椒子大小的一团软膏的形式以相同的模式给每一只眼施用。评估包括与对照相比较的实验组(2x 6只动物)中的角膜损伤及其再生速度。为了评估兔子的眼中损伤的愈合速度，用2%的荧光溶液对眼进行染色，然后进行检查，损伤与测量的起始之间间隔10个小时。该时间相应于体内观察到的角膜的愈合中的停滞期(lag phase)。使用裂隙灯检查眼睛，我们还对所有实验和对照角膜进行荧光测定和照相(摄影文件)。在损伤后每一个10小时的过程中进行照相。以像素测量角膜的受损区域的表面，使用Adobe Photoshop CS Extended软件包分析损伤的尺寸。将获得的结果求平均值，以评估伤口表面随时间过去的减小。当在两个组(实验和对照)中获得角膜的
100%的伤口闭合时结束实验。将结果收集在表1以及图2中，显示了在施用浓度为50万个细胞/ml制剂的滴剂后以像素表示的损伤的表面，表2和图3显示在施用浓度为50万个细胞/ml制剂的软膏后以像素表示的损伤表面的数据。

[0061] 表1

[0062]右眼 左眼
时间 平均值 SD 平均值 SD
0
10 195735 11690 197212 4883
24 178169 10004 316094 15551
48 15175 981 95291 5462
72 0 19987 1885
82 0 0

[0063] 表2

[0064]右眼 左眼
时间 平均值 SD 平均值 SD
0
10 196968 11639 201174 8293
24 169675 12902 292304 13688
48 16110 4860 92942 12295
72 0 19133 2534
82

[0065] 在用含有MIC-1匀浆物的制剂(滴剂或软膏)的制剂处理的所有眼中，愈合更快得多地发生。在处理后的前24小时中，未观察到损伤面积的增加。在72小时的观察结束之前发生完全愈合。两种制剂的有益效果大致相等。具有较低浓度的匀浆物的制剂显示减小约1/3的功效。

[0066] 实施例8.体内测定，神经组织(皮肤上隐窝神经(ski attic nerve))[0067] 在这些实验中，我们使用了两种性别的幼小(2至3月龄)Wistar大鼠，体重为240至310克。在实验过程中，将动物以12:12的光照/黑暗周期保持在笼内，让其随意接触水和食物。实验组由4只动物组成并且对照组由3只动物组成(一只大鼠在实验过程中死亡，未能从麻醉中醒来)。通过以75/5mg/千克体重的剂量腹膜内注射氯胺酮和赛拉嗪来在完全麻醉下对动物进行手术。我们在无菌条件下使用显微镜和显微外科工具进行手术。在脱毛和用Octenisept(Schulke&Meyr GmbH,Norderstedt,Germany)消毒后，区域被无菌织物(tissue)包围。在大腿的外部上纵向产生约2.5cm的切口。在分离大腿肌肉层后，使用钝的工具使坐骨神经可见，坐骨神经位于后部和内部大腿肌肉与股骨的胫之间。在1.5cm的长度上使神经游离，在其轴上切去1cm的片段。重新植入神经的切断部分，通过在植入物下面应用两根不溶性4/0尼龙单纤维的神经外膜缝合线(MEDICO(SHJIAZHUANG)INDUSTRIES AND TRADE CO.,LTD)在两个末端连接两个残端，我们放置一片大小为1x0.5cm的可吸收明胶海绵(由Johnson & Johnson,Warsaw Poland生产的可吸收明胶海绵)，该可吸收明胶海绵已用浓度为1个单位/1mm 0.9% NaCl的细胞匀浆物饱和。将切口缝合为单层，对皮肤再次消毒，让大鼠在装置上行走并且不包扎伤口。在对照组中，spam上的织物仅用0.9%NaCl浸透。进行术后恢复，矫正所有动物的通过原发性粘连愈合的伤口，在该方法后第7天除去皮肤缝线。我们在实验组中观察到明显更快的伤口愈合。12周后，通过施用以120mg/kg的速率添加的硫喷妥钠处死动物。使用显微外科手术分离已对其进行手术的神经，收集其片段，所述片段包括近端片段、植入物和远端片段(图4A和4B)。将分离的植入物分成3部分，置于4%的缓冲的福尔马林溶液中。比较对照组(图5,6)与实验组(图7,8,9)的结果，该植入物中的神经再生的显著差异与用MIC-1细胞匀浆物饱和的明胶海绵被放置的位置处的神经纤维外周而非神经束相关。在所述位置处，我们观察到配对周细胞(mural cell)的活化和刺激以及数目增加的细血管。在外周，在神经束中，存在许多有髓鞘和无髓鞘的轴突，这是重建神经纤维的连续性的过程的证据(图7,8)。在植入物的中央部分，存在较少有的有髓鞘轴突(图9)。

[0068] 实施例9.体内评估，肌肉组织(三头肌)

[0069] 在本实验中，我们使用了幼小的3月龄BALB/c小鼠(每只体重为18至22g)。将动物分成2组(每组4只)，实验组和对照组。在麻醉条件(按50/5mg/kg的比率腹膜内注射氯胺酮和赛拉嗪)下对两组的小鼠进行手术。在剃除皮肤毛发和用Octenisept消毒后，2
产生纵向切口以暴露纤细的肌肉。通过以约80kg/cm 的压力用外科卡钳挤压约3x3x 3mm的区域30秒来损伤腘绳肌。将皮肤缝合为单层，伤口用Octenisept进行消毒，不包扎伤口。
在遭受损伤的区域给实验组的动物提供7剂的浓度为1U/ml制剂的0.5ml细胞匀浆物。在挤压后立即进行第一次肌内注射，随后以48小时的间隔进行肌内注射。在对照组中，我们以相同的模式使用水进行注射。愈合总是正确地发生。在手术后第7天取出缝合线。我们在2周的过程中观察到，实验组的伤口显著更快的再生，如使用小鼠的运动活力评估的。为此目的，我们使用Smart 2.5.20包(在手术后第5、第10和第15天)。表3和图10显示，在180秒的视频记录过程中小鼠的以厘米表示的路径长度和以秒表示的休息时间。

[0070] 表3

[0071]

[0072]

[0073] 同样地，我们观察到，在接受匀浆物注射的动物中存在更高的运动活力和更短的休息时间。在2周后(在第15天)，我们从再生区域收集肌肉的碎片以在组织学上对其进行评估。在制备过程中，我们用显微镜观察到，在每一个案例中实验组的受损区域都比对照组的小(图11A-11D)。这些观察结果确证了行为研究的结果。将收集的碎片置于4%的缓冲的福尔马林中。将其用于制备组织学载片。与对照组相比较，在损伤位置接受匀浆物的所有动物中，我们观察到完全的再生(图12A,12B,13A,13B)。

[0074] 体外和体内实验明确地证实了，匀浆物对所有组织的再生过程具有有益作用。因此，该制剂可广泛用作用于刺激组织和器官再生的通用试剂。值得一提的是，发生这些过程且不产生疤痕。

[0075]

[0076]