注射用紫杉烷类药物白蛋白纳米粒制剂及其制备方法

摘要

本发明属于药物制剂领域，涉及一种可注射用紫杉烷类药物白蛋白纳米粒制剂。本发明以白蛋白和紫杉烷类药物结合、以磷脂加以分散和稳定而形成的白蛋白纳米粒，制成可溶性注射用白蛋白纳米粒制剂。本发明利用纳米粒子对肿瘤的增强渗透和滞留效应，使更多药物被动靶向而浓集于肿瘤组织，提高其抗肿瘤效果；同时，由于注射方式的生物利用度高以及所述的可溶性注射用白蛋白纳米粒制剂存在被动靶向作用，可大大降低给药剂量，从而使得非靶部位的药物浓度有效降低，有助于降低药物的毒副作用，具有良好的临床应用前景。本制剂制备方法简便，适宜工业化大生产。

权利要求

1.一种制备注射用紫杉烷类药物白蛋白纳米粒制剂的方法，其特征在于，采用乳化法制备注射用白蛋白纳米粒，初乳具有适合注射的粒径后，采用超声或高压均质工艺进一步控制粒径，其包括步骤：按质量比分别为2～5％，10～25％，50～75％，0.02～0.5％的紫杉烷类药物，人血清白蛋白，磷脂和药剂学上必要的辅料抗氧化剂，各组分之和为100％，取紫杉烷类药物溶于适量乙醇溶剂中，将磷脂溶于适量二氯甲烷中，将二者混合后作为油相；将人血清白蛋白和抗氧化剂溶于适量去离子水中，于室温或冰水浴中将油相滴入磁力搅拌的水相中，继续搅拌，然后40℃水浴旋转蒸发除去乙醇和二氯甲烷，制得载紫杉烷类药物的白蛋白纳米粒。

2.按权利要求1所述的方法制得的注射用紫杉烷类药物白蛋白纳米粒制剂，其特征在于，所述的紫杉烷类药物选自紫杉醇或/和多烯紫杉醇。

3.按权利要求1所述的方法制得的注射用紫杉烷类药物白蛋白纳米粒制剂，其特征在于，所述的磷脂选自蛋黄卵磷脂、大豆磷脂、氢化豆磷脂、二月桂酰卵磷脂、二硬脂酰卵磷脂、1-肉豆蔻酰-2-棕榈酰卵磷脂、1-棕榈酰-2-肉豆蔻酰卵磷脂、1-棕榈酰-2-硬脂酰卵磷脂、1-硬脂酰-2-棕榈酰卵磷脂、二油酰基卵磷脂、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰甘油、二棕榈酰磷脂酸、二棕榈酰神经鞘磷脂、二棕榈酰卵磷脂、二棕榈酰磷脂酰二丝氨酸、二月桂酰磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酸、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、脑磷脂酰丝氨酸、二肉豆蔻酰卵磷脂、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸、脑神经鞘磷脂、二硬脂酰磷脂酰甘油、二硬脂酰神经鞘磷脂或二硬脂酰磷脂酰乙醇胺中的一种或多种。

4.按权利要求1所述的方法制得的注射用紫杉烷类药物白蛋白纳米粒制剂，其特征在于，所述的药剂学上必要的辅料选自维生素E、维生素C、反丁烯二酸、苹果酸、没食子酸丙酯、亚硫酸氢钠和偏亚硫酸氢钠、L-半胱氨酸或L-异亮氨酸。

5.按权利要求1所述的方法制得的注射用紫杉烷类药物白蛋白纳米粒制剂，所述的白蛋白纳米粒制剂采用水、磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、碳酸盐缓冲液、5％葡萄糖溶液或生理盐水为分散介质。

说明书

注射用紫杉烷类药物白蛋白纳米粒制剂及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明属药物制剂领域，涉及注射用紫杉烷类药物白蛋白纳米粒制剂及其制备方法。

背景技术

[0002] 近年来，肿瘤的发病率急剧上升，其治疗难度大、死亡率高，己成为人类死亡的第二大病因。据报道，全世界每年约有600万人死于恶性肿瘤，其中，中国癌症患者约450万人，死亡率逾30％，已成为严重的社会问题。目前，临床上治疗恶性肿瘤通常采用手术、化疗及放疗等手段；对于早期肿瘤，手术切除辅以其它疗法往往可取得较好的治疗效果；而对于晚期肿瘤，多以放、化疗综合治疗以延缓病情的发展，但均伴随严重的免疫系统抑制或毒副作用，难以有效提高患者的生存率和生活质量。因此，探寻疗效好、不良反应较小的治疗手段或药物一直是肿瘤治疗领域的研究热点和努力方向。

[0003] 已知紫杉烷类药物对多种肿瘤具有较强的抗肿瘤活性，其作用是强化微管蛋白聚合作用和抑制微管解聚作用，导致形成稳定的非功能性微管束，从而抑制细胞的有丝分裂和增殖。其中多烯紫杉醇（docetaxel）是近年开发的新一代紫杉烷类药物，其作用机制与紫杉醇类似，但是抗肿瘤活性是紫杉醇的1.3~12倍，对乳腺癌、非小细胞肺癌、脑肿瘤等均有明显疗效。

[0004] 目前，尽管紫杉烷类具有较好的抗肿瘤作用，但治疗实践显示其仍存在以下缺陷：（1）由于药物难溶于水（紫杉醇在室温下水中溶解度为0.0005mg/mL，多烯紫杉醇在水中几乎不溶）），临床所用注射剂均需添加大量的表面活性剂，如紫杉醇采用Cremophor EL助溶，多烯紫杉醇采用吐温80助溶等，导致所述注射剂在临床应用中毒副作用较大，容易引起并发症，如过敏反应、骨髓抑制、神经毒性、心血管毒性、脱发等；（2）由于药物进入体内后快速分布和代谢，使得血药浓度快速降低，从而需要经常性给药，且长期服用；（3）由于药物为细胞毒类药物，不具有靶向性，常规注射剂给药后药物全身分布，产生全身性的毒副反应，而目前对其结构改造以减少不良反应的尝试尚无较大进展。

[0005] 现有技术已公开有较多有关紫杉烷类药物的制剂，但尚未见相关专利或文献报道能够同时克服上述缺陷。专利CN201010128467.6采用乙醇增溶紫杉烷类药物，但尚未制备为纳米制剂，因此不具有肿瘤靶向和缓释效果。

[0006] 专利CN200510084055.6将多烯紫杉醇制备为脂肪乳剂，虽然有望缓释药物，但是含药量低，含油量高，输入人体后易导致脂肪酸在组织器官内聚集；且脂肪乳剂平均粒径在500nm，不具备良好的肿瘤靶向性。

[0007] 专利CN200710170414.9，CN200980128786.2将紫杉烷类药物制备为乳剂，同样不具备肿瘤靶向性。

[0008] 专利CN200910011752.7将这类药物制备为自微乳，虽然该乳剂的粒径降到100nm左右，但是该乳剂中仍然存在具有较大毒性的表面活性剂。

[0009] 专 利 CN200710158464.5，CN200710158466.4，CN200810234186.1，CN200910112717.4，CN201010151501.1，CN200910187234.0，CN201010268907.8将这类药物制备为脂质体、纳米粒等，虽然具有较好的肿瘤靶向作用，但是现有技术仍存在不足，且该类制剂稳定性差，载药量低，制备方法繁琐，尚无法进行工业化大生产。

[0010] 专利CN03112082.2虽然将紫杉烷类药物制备为不含表面活性剂Cremophor EL和吐温80的制剂，但是其中紫杉烷类药物仅是复方中的一种药物，属于药物组合物领域，而非对紫杉烷类药物制剂的研究。并且该类研究仅仅提高了药物的溶解度，却并不具有肿瘤靶向和缓释效果。

[0011] 中国发明申请CN200380109606.9、CN97199720.9、CN20031023461.X、CN02811017.X、CN03108361.7、CN200610077006.4、及发明专利ZL01119258.5、ZL03108361.7公开了白蛋白宁用于制备纳米粒，但其中涉及的产品和技术仅仅是采用人血清白蛋白，且制备过程中采用大量有机溶剂，且需要高压均质，较为繁琐。

[0012] 磷脂常用于脂质体的制备中，已有专利采用脂质体作为载药系统包载活性药物。专利CN200710132056.2，CN200910011910.9虽采用磷脂作为组成物，但其中磷脂仅用于增加药物溶解度，且在用前加入水化介质形成亚微粒混悬液，并未事先制备为纳米颗粒，不具备肿瘤靶向作用。中国发明申请CN200610037609.1、CN02129204.3、CN02160028.7和发明专利ZL94191101.2、ZL96190332.5中构建了蛋白与磷脂的组合物，但其中的蛋白仅作为活性药物。

[0013] 迄今为止，有关紫杉烷类药物的基础和应用基础研究中，主要集中于其作为模型药物的靶向研究和药物合用的研究，尚未见有效地以白蛋白纳米粒将其制备为纳米制剂的文献报道。

发明内容

[0014] 本发明的目的是克服现有技术的缺陷和不足，提供一种紫杉烷类白蛋白纳米粒，尤其是注射用紫杉烷类药物白蛋白纳米粒制剂及其制备方法，本发明中将难溶性紫杉烷类药物制备为注射用肿瘤靶向白蛋白纳米粒，与现有制剂相比具有较高的载药量，良好的肿瘤靶向效果和缓释效果，且制备工艺简便，适宜工业化大生产。

[0015] 本发明所述的可溶性注射用白蛋白纳米粒制剂以磷脂为稳定剂，紫杉烷类药物与白蛋白结合后经磷脂分散并使其稳定。本发明利用紫杉烷类药物与白蛋白结合率高的特性，使两者自然形成并制成白蛋白纳米粒，再采用磷脂分散、稳定所述的纳米粒子（使其具有极高的水溶性），最终制得可溶性注射用白蛋白纳米粒制剂。

[0016] 本发明制剂与现有技术的本质的区别在于，将磷脂作为分散稳定药物和白蛋白复合物的介质，与药物和白蛋白共同构成稳定的纳米制剂，所述磷脂并不单独形成脂质体。

[0017] 具体而言，本发明的注射用紫杉烷类药物白蛋白纳米粒制剂，其特征在于，由紫杉烷类药物、白蛋白、磷脂及药剂学上必要的辅料制成，其中，紫杉烷类药物、白蛋白、磷脂和辅料所占的质量比分别为1～30%，5～70%，5～95%，0.01～1%，优选的，所述的紫杉烷类药物、白蛋白、磷脂和辅料所占的质量比分别为2～5%，10～25%，50～75%，0.02～0.5%。

[0018] 本发明中，所述的紫杉烷类药物选自紫杉醇和多烯紫杉醇（docetaxel）的一种或者两种的组合；

[0019] 本发明中，所述的白蛋白选自人血清白蛋白、牛血清白蛋白、羊血清白蛋白、驴血清白蛋白、马血清白蛋白、兔血清白蛋白、猪血清白蛋白及其他种类白蛋白，优选人血清白蛋白或牛血清白蛋白；

[0020] 本发明中，所述的磷脂选自蛋黄卵磷脂（EPC）、大豆磷脂（SPC）、氢化豆磷脂（HSPC）、二月桂酰卵磷脂（DLPC）、二硬脂酰卵磷脂（DSPC）、1-肉豆蔻酰-2-棕榈酰卵磷脂（MPPC）、1-棕榈酰-2-肉豆蔻酰卵磷脂（PMPC）、1-棕榈酰-2-硬脂酰卵磷脂（PSPC）、1-硬脂酰-2-棕榈酰卵磷脂（SPPC）、二油酰基卵磷脂（DOPC）、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺（DPPE）、二棕榈酰甘油（DPPG）、二棕榈酰磷脂酸（DPPA）、二棕榈酰神经鞘磷脂（DPSP）、二棕榈酰卵磷脂（DPPC）、二棕榈酰磷脂酰二丝氨酸（DPPS）、二月桂酰磷脂酰甘油（DLPG）、二油酰磷脂酰甘油（DOPG）、二肉豆蔻酰磷脂酸（DMPA）、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺（DMPE）、脑磷脂酰丝氨酸（PS）、二肉豆蔻酰卵磷脂（DMPC）、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸（DMPS）、脑神经鞘磷脂（BSP）、二硬脂酰磷脂酰甘油（DSPG）、二硬脂酰神经鞘磷脂（DSSP）或二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（DSPE）中的一种或多种；优选EPC、SPC或HSPC；

[0021] 本发明中，所述的药剂学上必要辅料主要为抗氧化剂如维生素E、维生素C、反丁烯二酸、苹果酸、没食子酸丙酯、亚硫酸氢钠和偏亚硫酸氢钠、L-半胱氨酸和L-异亮氨酸；优选维生素E、维生素C和亚硫酸氢钠；

[0022] 本发明采用乳化法制备注射用白蛋白纳米粒，初乳已经具有适合注射的粒径，可选择性采用超声或高压均质工艺进一步控制粒径。本发明的一个实施例中，分别将表1处方1～30中的紫杉烷类溶于适量乙醇或其他合适溶剂中，将磷脂溶于适量二氯甲烷中，将二者混合后作为油相；将白蛋白和抗氧化剂溶于适量去离子水中（水相），于室温或冰水浴中将油相滴入磁力搅拌的水相中，并继续搅拌一定时间，然后40°C水浴旋转蒸发除去乙醇和二氯甲烷，制得载紫杉烷类药物的白蛋白纳米粒。

[0023] 本发明中，所述的紫杉烷类药物制备为白蛋白纳米粒后，其分散介质可为水、磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、碳酸盐缓冲液、5％葡萄糖溶液或生理盐水。

[0024] 本发明的可溶性注射用白蛋白纳米粒制剂可用于制备治疗癌症的药物，或者作为药物用于癌症治疗；其中，所述的癌症包括肺癌、乳腺癌、卵巢癌、脑胶质瘤、肝癌、胰腺导管癌、食管癌、胃癌、胰腺癌、甲状腺癌、鼻咽癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、肾癌、前列腺癌、膀胱癌、结肠癌、直肠癌、睾丸癌、皮肤癌、淋巴瘤、头颈部肿瘤和起源于胆囊、口腔、外周神经系统、粘膜、腺体、血管、骨组织、淋巴结、眼睛的原发或继发的癌、肉瘤或癌肉瘤等。

[0025] 本发明中，所述的可溶性注射用白蛋白纳米粒制剂，可采用静脉、皮下、肌内、膜内、腹膜内或其它途径进行注射给药。

[0026] 本发明中，所述紫杉烷类药物被包载后，每次的紫杉烷类药物给药剂量为0.01～20mg/kg，优选的每次给药剂量为1～10mg/kg；给药方案为每天给药或间隔给药，每一疗程给药剂量为0.3～600mg/kg，优选的每一疗程给药剂量为4～40mg/kg。

[0027] 本发明的可溶性注射用白蛋白纳米粒制剂经药效学试验，结果表明，其治疗效果优于市售注射剂。

[0028] 本发明利用纳米粒子对肿瘤的增强渗透和滞留效应（EPR效应），使更多药物被动靶向而浓集于肿瘤组织，提高其抗肿瘤效果；同时，由于注射方式的生物利用度高以及所述的可溶性注射用白蛋白纳米粒制剂存在被动靶向作用，可大大降低给药剂量，从而使得非靶部位的药物浓度有效降低，有助于降低药物的毒副作用；所述的可溶性注射用白蛋白纳米粒制剂避免了上市口服制剂生物利用度较低、患者顺应性差的缺点，将白蛋白纳米粒的水溶性提高作用和被动靶向作用相融合，具有良好的临床应用前景。另一方面，本发明制备方法简单，药物回收率高，适于工业化大生产。

[0029] 本发明的可溶性注射用白蛋白纳米粒与现有技术相比，具有以下显著优点：

[0030] ①对紫杉烷类药物具有显著的增溶作用，其溶解度足够临床注射应用；

[0031] ②包封率几乎为100%，制备过程无损失，载药量亦较高；

[0032] ③可溶性注射用白蛋白纳米粒制剂可利用肿瘤部位的EPR效应，增加药物在肿瘤组织的蓄积，利于发挥药物的抗肿瘤效果，降低对其它组织的毒副作用。

[0033] ④具有缓释作用，能够持续杀死肿瘤细胞，减少给药次数。

[0034] 为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明的可溶性注射用白蛋白纳米粒制剂进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。

附图说明

[0035] 图1显示了本发明中各制剂组给药后人非小细胞肺癌A549瘤体体积与时间的关系。

[0036] 图2显示了本发明中各制剂组给药后荷人脑胶质瘤裸鼠的生存期。

[0037] 图3显示了本发明中紫杉醇白蛋白纳米粒在荷人脑胶质瘤裸鼠的组织分布。

[0038] 图4显示了本发明中正常小鼠给与紫杉醇白蛋白纳米粒或者紫杉醇注射液后体重随时间的变化。

[0039] 具体的实施方式

[0040] 实施例1、紫杉醇白蛋白纳米粒的处方工艺

[0041] 表1包载紫杉醇的白蛋白纳米粒处方中各组分的比例（mg）

[0042]

[0043]

[0044] 分别将表1处方1～30中的紫杉醇溶于适量乙醇或其他合适溶剂中，将磷脂溶于适量二氯甲烷中，将二者混合后作为油相；将白蛋白和抗氧化剂溶于适量去离子水中（水相），于室温或冰水浴中将油相滴入磁力搅拌的水相中，并继续搅拌一定时间，然后40°C水浴旋转蒸发除去乙醇和二氯甲烷，即得载紫杉醇的白蛋白纳米粒。

[0045] 实施例2、多烯紫杉醇白蛋白纳米粒的处方工艺

[0046] 表2包载多烯紫杉醇的白蛋白纳米粒处方中各组分的比例（mg）

[0047]

[0048]

[0049] 将表2处方1～30中的多烯紫杉醇溶于适量乙醇或其他合适溶剂中，将磷脂溶于适量二氯甲烷中，将二者混合后作为油相；将白蛋白和抗氧化剂溶于适量去离子水中（水相），于室温或冰水浴中将油相滴入磁力搅拌的水相中，并继续搅拌一定时间，然后40°C水浴旋转蒸发除去乙醇和二氯甲烷，即得载多烯紫杉醇的白蛋白纳米粒。

[0050] 实施例3、包载紫杉醇的白蛋白纳米粒对皮下非小细胞肺癌的药效学试验[0051] 肿瘤细胞：人非小细胞肺癌A549细胞（购自中国科学院上海细胞库），用含10%胎牛血清的DMEM培养液培养。

[0052] 动物：Balb/c裸鼠，4周龄，雄性。试验组及阴性对照组每组6只裸小鼠。

[0053] 肿瘤细胞的接种：采用右腋皮下接种模型，无菌条件下取生长旺盛的A549细胞，将细胞消化后离心重悬成约2.0E7/ml细胞悬液，于每只小鼠右腋皮下接种0.1ml癌细胞悬液。

[0054] 同前方法计算肿瘤体积及抑瘤率。

[0055] 各组按照表3的给药方案给药两周。

[0056] 表3各实验组的给药方案

[0057]组别 给药方案
生理盐水组 尾静脉注射一周两次
紫杉醇处方11（5mg/kg）组 尾静脉注射一周两次
紫杉醇处方11（10mg/kg）组 尾静脉注射一周两次
紫杉醇注射液（10mg/kg）组 尾静脉注射一周两次

[0058] 表4不同治疗组的肿瘤抑制效果

[0059]组别 肿瘤体积（mm3） 抑瘤率
生理盐水组 3213±743 /
紫杉醇处方11（5mg/kg）组 2021±561* 37.1%
紫杉醇处方11（10mg/kg）组 1001±461*※ 68.8%
紫杉醇注射液（10mg/kg）组 2357±442* 26.6%
* ※

[0060] P＜0.05，与生理盐水组相比；P＜0.05，与紫杉醇注射液组相比。

[0061] 肿瘤体积及抑瘤率等实验结果如表4所示、肿瘤体积变化如图1所示；结果显示，各药物治疗组的肿瘤体积在第20天时均显著小于生理盐水组（p<0.05），表明各制剂对A549细胞接种的皮下肿瘤均有一定的治疗效果。但紫杉醇处方11白蛋白纳米粒在5mg/kg剂量时其抑瘤效果比紫杉醇注射液10mg/kg时的抑瘤效果要好，但无显著性差异，此时白蛋白纳米粒的剂量仅为口服的50%；而紫杉醇处方11白蛋白纳米粒在10mg/kg剂量时，其抑瘤效果显著好于紫杉醇注射液10mg/kg组；本发明所制得的白蛋白纳米粒比现有临床使用的紫杉醇注射液具有更好的治疗效果。

[0062] 实施例4、包载多烯紫杉醇的白蛋白纳米粒对脑胶质瘤的药效学试验[0063] 肿瘤细胞：人脑胶质瘤U87细胞，用含10%胎牛血清的DMEM培养液培养。

[0064] 动物：Balb-c裸小鼠，4周龄，初始体重为18～20克，雌性。试验组及阴性对照组每组6只裸小鼠。

[0065] 肿瘤细胞的接种：脑部原位接种模型，无菌条件下取生长旺盛的U87细胞，以匀浆法制备成约2.0E5/5μl细胞悬液，于裸小鼠右脑纹状体接种细胞的数量为20万/鼠。

[0066] 评价指标：以裸鼠的生存期为指标，评价各组制剂的抗肿瘤效果。

[0067] 按照表5的方案给药两周。

[0068] 表5各实验组的给药方案

[0069]组别 给药方案
生理盐水组 尾静脉注射一周两次
多烯紫杉醇处方7（10mg/kg）组 尾静脉注射一周两次
多烯紫杉醇注射液（10mg/kg）组 尾静脉注射一周两次

[0070] 表6荷原位脑胶质瘤裸鼠经不同方案给药后的中位生存期比较

[0071]组别 中位生存期（天） 标准误差 95%置信区间
生理盐水组 20.0 2.4 15.2-24.8
多烯紫杉醇处方7（10mg/kg）组 23.0 4.2 14.5-31.4
多烯紫杉醇注射液（10mg/kg）组 28.0 2.4 19.6-26.3

[0072] *P＜0.05，与生理盐水组相比。

[0073] 结果如表6及图2所示，结果表明，多烯紫杉醇处方7组的中位生存期为28天，与生理盐水组的中位生存期相比，具有显著性差异（P<0.05）。而多烯紫杉醇注射液组与生理盐水组无显著性差异；表明多烯紫杉醇制备为白蛋白纳米粒后其抗肿瘤效果大大提高。

[0074] 实施例5、包载紫杉醇的白蛋白纳米粒对脑胶质瘤的组织分布试验

[0075] 肿瘤细胞：人脑胶质瘤U87细胞，用含10%胎牛血清的DMEM培养液培养。

[0076] 动物：Balb-c裸鼠，4周龄，初始体重为18～20克，雌性。试验组及阴性对照组每组6只裸小鼠。

[0077] 肿瘤细胞的接种：脑部原位接种模型，无菌条件下取生长旺盛的U87细胞，以匀浆法制备成约2.0E5/5μl细胞悬液，于裸小鼠右脑纹状体接种细胞的数量为20万/鼠。同时有裸鼠在脑部接种等体积不含细胞的PBS作为对照。

[0078] 按照紫杉醇处方18，并在磷脂的二氯甲烷溶液中添加适量近红外荧光探针DiR，制备载DiR的紫杉醇白蛋白纳米粒。小鼠接种肿瘤或PBS10天后，尾静脉给予10mg/kg载DiR的拉紫杉醇白蛋白纳米粒，于2、4和8h在活体成像仪中观察小鼠的整体荧光分布。8h时将小鼠处死取出各脏器观察荧光分布。结果如图3所示。

[0079] 结果表明，荷原位脑胶质瘤裸鼠尾静脉注射载DiR的紫杉醇白蛋白纳米粒后可以快速分布到脑部，并随着时间的延长而逐步消除，24h时离体的脑组织仍有较为明显的荧光分布，并且在肿瘤部位有明显的蓄积，且明显强于正常的左半脑。而假手术裸鼠脑部则仅有微弱的荧光分布，且从离体脑部可以看出在手术部位无蓄积现象。说明紫杉醇白蛋白纳米粒的被动靶向作用主要是由于肿瘤生长产生的EPR效应，而非手术对脑部造成的创伤。

[0080] 实施例11、包载多烯紫杉醇的白蛋白纳米粒的急性毒性试验

[0081] 动物：ICR小鼠，4周龄，初始体重为18～20克，雌雄各半，每组6只。

[0082] 按照多烯紫杉醇处方20制备多烯紫杉醇蛋白纳米粒，并浓缩至6、12、24、50mg/mL，其中多烯紫杉醇为50mg/mL时制剂（含辅料）的浓度为1g/mL，已达溶解度极限。将不同浓度纳米粒静脉给予小鼠0.2mL/20g，并采用不同浓度的市售注射液作为对照，观察其2天内死亡情况。

[0083] 结果表明，市售注射液的LD50为104mg/kg，而载多烯紫杉醇纳米粒的LD50为204mg/kg，是市售注射液的1.96倍。并且该剂量远远高于药效实验中的最高使用剂量（10mg/kg即有很好的抗肿瘤效果），表明此制剂安全性良好。

[0084] 实施例12、包载紫杉醇的白蛋白纳米粒的长期毒性试验

[0085] 动物：ICR小鼠，4周龄，初始体重为18～20克，雌雄各半，每组6只。

[0086] 考察指标：给药过程中监测动物体重，给药结束后24h摘眼球取血，测血常规。

[0087] 按照表7的方案给药两周。

[0088] 表7各实验组的给药方案

[0089]组别 给药方案
生理盐水组 尾静脉注射一周两次
紫杉醇处方22（10mg/kg）组 尾静脉注射一周两次
紫杉醇注射液（10mg/kg）组 尾静脉注射一周两次

[0090] 表8各组动物的血常规参数

[0091]

[0092] ap<0.05vs生理盐水,bp<0.05vs紫杉醇白蛋白纳米粒.

[0093] 结果如表8及图4所示，结果表明，随着给药次数的增多，紫杉醇注射液组小鼠体重的增长显著慢于生理盐水组和紫杉醇白蛋白纳米粒组，说明紫杉醇注射液具有较大的毒性，而紫杉醇白蛋白纳米粒毒性较小。在血常规检验中，不同实验组具有一定差异。紫杉醇纳米粒组各项指标如白细胞数目（WBC）、红细胞数目（RBC）等虽与生理盐水组有一定差异，但是紫杉醇注射液的各项指标与生理盐水组的差异更大，且与紫杉醇白蛋白纳米粒组有显著性差异，说明相比紫杉醇注射液，紫杉醇白蛋白纳米粒的毒性显著降低。紫杉醇处方22的毒性可能主要由其辅料牛血清白蛋白起的，由于牛血清白蛋白对小鼠来说为异体蛋白，很容易引起免疫系统的排斥。另外处方中牛血清白蛋白的浓度为紫杉醇的5倍，，引起血液系统的毒性也就不足为怪了；另一方面用于人体时处方可以选用人血清白蛋白从而可以避免此毒性，紫杉醇白蛋白纳米粒仍然有望具有较好的安全性。