一种固相微萃取纤维萃取头及其制备方法

摘要

本发明公开了一种固相微萃取纤维萃取头的制备方法，按以下步骤进行：（1）对裸石英纤维进行硅烷化处理；（2）在聚合溶剂中加入丙烯酰胺功能单体、交联剂及引发剂，充分混合，得到预聚合溶液；（3）在硅烷化的石英纤维表面涂渍多孔聚合物涂层；（4）对石英纤维进行老化处理；（5）重复（2）至（4）步骤若干次，在石英纤维表面重复涂渍若干次多孔聚合物涂层；（6）对多孔聚合物涂层石英纤维进行键合反应；（7）将经第（6）步处理后的石英纤维置于核酸适配体溶液中，室温下键合反应。本发明通过上述步骤对石英纤维进行处理，可显著提高核酸适配体在纤维表面的键合量，制备得到新型核酸适配体/多孔聚合物涂层的SPME萃取头。

权利要求

1.一种固相微萃取纤维萃取头的制备方法，按以下步骤进行：

（1）对裸石英纤维进行氢氟酸腐蚀、碱洗、酸洗及活化处理，然后采用具有不饱和双键的硅烷化试剂进行硅烷化处理；

（2）在聚合溶剂中加入丙烯酰胺功能单体、交联剂及引发剂，充分混合，得到预聚合溶液；

（3）取一定量预聚合溶液于试管中，放入步骤1硅烷化后所得的石英纤维，通氮气除氧，密封试管口，水浴中热引发共聚反应，使石英纤维表面涂渍多孔聚合物涂层；

（4）聚合一定时间后，拔出石英纤维，放入另一洁净试管中，通氮气除氧，密封试管口，置于干燥箱中于一定温度下老化；

（5）在同一根石英纤维上重复以上（2）至（4）步骤若干次，在石英纤维表面重复涂渍若干次多孔聚合物涂层；

（6）将第（5）步中最后得到的多孔聚合物涂层石英纤维置于羰基二咪唑键合剂溶液中，室温下键合反应一定时间，取出石英纤维，用蒸馏水清洗，氮气吹干；

（7）将经第（6）步处理后的石英纤维置于分析对象对应的核酸适配体溶液中，室温下键合反应一定时间，取出石英纤维，用缓冲液清洗，氮气吹干，低温保存。

2.如权利要求1所述的固相微萃取纤维萃取头的制备方法，其特征在于：所述具有不饱和双键的硅烷化试剂为三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯。

3.如权利要求1所述的固相微萃取纤维萃取头的制备方法，其特征在于：所述聚合溶剂为丙酮，交联剂为三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯。

4.如权利要求3所述的固相微萃取纤维萃取头的制备方法，其特征在于：丙酮与三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯体积比为9:1，丙烯酰胺与三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯摩尔比为1:4。

5.如权利要求3所述的固相微萃取纤维萃取头的制备方法，其特征在于：多孔聚合物涂层在石英纤维表面重复涂渍达2～5层。

6.如权利要求5所述的固相微萃取纤维萃取头的制备方法，其特征在于：所述羰基二咪唑浓度为0.7mol/L，键合时间为1.5小时。

7.如权利要求5所述的固相微萃取纤维萃取头的制备方法，其特征在于：核酸适配体溶液的缓冲液为TE缓冲液，适配体键合时间为24小时。

8.由权利要求1～7任一方法所制备的固相微萃取纤维萃取头。

说明书

一种固相微萃取纤维萃取头及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于化学分析测试仪器领域，涉及到固相微萃取涂层纤维的制备方法，该纤维适用于复杂生物样品中痕量生物碱、抗生素或核苷酸类物质的分离与富集。

背景技术

[0002] 高效、高选择性的样品前处理技术是分析复杂基体如生物、医药、环境样品和食品中痕量、超痕量物质的重要步骤。色谱分析过程中，样品预处理通常是最耗时和不易自动化的步骤，也是目前公认的最为关键的步骤。但相对于仪器分析技术的发展，样品前处理技术的进展一直较缓慢。传统的样品前处理技术如液-液萃取、索氏提取、柱色谱等，普遍存在耗时长、效率低、操作繁琐、有机溶剂用量大等缺点。这些问题的存在，使样品前处理工作成为整个分析测定过程中最费时、费力，也最容易引入误差的一个环节。

[0003] 固相微萃取(Solid-Phase Microextraction,SPME)技术由Belardi与Pawliszyn在1989年提出，基于分析物在流动相以及固定在熔融二氧化硅纤维表面的高分子固定相之间两相分配的原理，实现样品中分析物的萃取与富集，然后可直接在联用仪器中解吸、进样及分析，使样品预处理过程大为简化，提高了分析速度及灵敏度。SPME技术的核心在于其萃取头表面的涂层，但商品化涂层种类有限，仅有少数几种，涂层选择性较差，且不适合于处理极性或碱性物质。虽然一些文献报道了各类新型SPME涂层的研制工作，如聚硅氧烷-富勒烯(Xiao C.H.,Han S.Q.,Wang Z.Xing Y.,J.,and Wu C.Y.2001.J.Chromatogr.A 927:121-130)、 冠 醚 (Zeng,Z.R.,W.L.Qiu,and Z.F.Huang.2001.Anal.Chem.73:2429-2436)、杯 芳 烃 (Li,X.J.,Z.R.Zeng,S.Z.Gao,and H.B.Li.2004.J.Chromatogr.A 1023:15-25)等，选择性相对于商品化涂层有一定提高，但分析对象范围较窄，主要用于测定挥发或半挥发性有机环境污染物，且选择性仍不够强。自1990年以来，分子印迹技术因其类似于酶-底物的“钥匙-锁”相互作用识别原理，在分析化学领域，尤其是在固相萃取、色谱填料、化学传感器等研究领域获得了广泛应用。该技术制备的分子印迹聚合物(Molecularly imprinted polymer，MIP)具有选择性高、化学稳定性好、制备简单等特点，特别适合作为SPME的选择性涂层材料(Hu X.G.,Hu Y.L.,and Li G.K.2007.J.Chromatogr.A 1147:1-9.)。但由于分子印迹技术本身的局限，MIP作为SPME涂层材料尚存在以下不足之处：MIP合成需加入大量模板分子，难以完全洗脱，萃取时可能出现模板分子渗漏现象；MIP选择性主要基于氢键作用，分析生物样品（水溶液）时受干扰严重；MIP涂层萃取时常使用苯、甲苯、氯仿或其它有机溶剂，易污染环境；MIP涂层的刚性识别“空穴”在制备过程中或萃取时容易被破坏或变形，其特异性及亲合力不如生物识别体系如酶-底物、抗体-受体等相互作用。因此，研制选择性更强、更适合于复杂生物样品中痕量物质分析的SPME涂层材料非常必要，而生物识别体系无疑是更为合适的选择。

[0004] 核酸适配体(Aptamer)是通过指数富集配基的系统进化技术(SELEX)经体外筛选得到的一段短的单链寡核苷酸序列，它通过链内某些互补碱基间的配对和静电作用、氢键作用等自身发生适应性折叠，形成一些稳定的三维空间结构，如发夹、假结、凸环、G2四分体等，通过空间构型互补与配体分子高亲和力、高特异性地结合。例如，茶碱在哮喘、支气管炎和肺气肿的治疗中常用作支气管扩张药物，易引起中毒，与血清中的咖啡因（两者结构上只相差一个甲基）难以区分。Jenison等从RNA库中分离得到茶碱适配体，与茶碱的亲和力比咖啡因高10000倍以上(Jenison R.D.,Gill S.C.,Pardi A.,and Polisky B.1994.Science 263:1425-1429.)；Sazani等筛选得到的三磷酸腺苷(ATP)RNA适配体与ATP的亲和力比二磷酸腺苷(ADP)高64倍，比单磷酸腺苷(AMP)高1100倍(Sazani P.L.,Larralde R.,and Szostak J.W.2004.J.Am.Chem.Soc.126:8370-8371.)。核酸适配体除具有与抗体一样能与相应配体高效、专一结合的特点外，还具有以下优点：易化学修饰；体外筛选，化学合成，容易获取，成本低；稳定性好，可复性；目标分子范围广。适配体通过SELEX技术从随机寡核苷酸库筛选得到，加之单链核酸形成三维结构的多样性和适配体与配体之间相互作用力的多样性，理论上自然界中的绝大多数物质都能够筛选到相应的适配体(Burgstaller P.,Girod A.,and Blind M.2002.Drug Discovery Today 7:1221-1228.)，目前已报道的配体范围相当广泛，有小分子(Ferapontova E.E.,Olsen E.M.,and Gothelf K.V.2008.J.Am.Chem.Soc.130:4256-4258.)、糖类(Jeong S.,Eom T.,Kim S.,Lee S.,and Yu J.2001.Biochem.Biophys.Res.Commun.281:237-243.)、氨 基 酸 (Famulok M.1994.J.Am.Chem.Soc.116:1698-1706.)、核 苷酸 (Zhang S.S.,Xia J.P.,and Li X.M.2008.Anal.Chem.80:8382-8388.)、 肽 (Davis J.J.,Tkac J.,Laurenson S.,and Ferrigno P.K.2007.Anal.Chem.79:1089-1096.)、蛋白质(Yigit M.V.,Mazumdar D.,and Lu Y.2008.Bioconjugate Chem.19:412-417.)、甚至整个细胞(Hamula C.L.A.,Zhang H.Q.,Guan L.L.,Li X.F.,and Le X.C.2008.Anal.Chem.80:7812-7819.)。

[0005] 核酸适配体在分析化学领域的应用已成为国内外研究者关注的焦点。适配体在化学修饰后作为配基可固定在各种材料表面，如金属、硅胶、玻璃、磁性微球、量子点等，应用于各类分离技术，包括液相色谱、亲和色谱、毛细管电泳、毛细管电色谱、生物传感器及原子力显微镜等。例如，Brumb等人将L-精氨酸的RNA适配体修饰在亲和色谱填料上，实现L-精氨酸与D-精氨酸的高效分离(Brumbt A.,Ravelet C.,Grosset C.,Ravel A.,Villet A.,and Peyrin E.2005.Anal.Chem.77:1993-1998.)；Chris Le等将适配体固定在毛细管色谱整体柱中，用于蛋白质混合物中细胞色素C的分离与检测(Zhao Q.,Li X.F.,and Chris Le X.2008.Anal.Chem.80:3915-3920.)。适配体在样品前处理领域的应用也有很大潜力，Tan等将适配体固定在磁性纳米颗粒表面，用于复杂生物样品中癌症细胞的选择性分离富集(Herr J.K.,Smith J.E.,Medley C.D.,Shangguan D.H.,and Tan W.H.2006.Anal.Chem.78:2918-2924.)；Oktem等将适配体固定在磁珠表面，用于细菌粗提液中重组Taq DNA聚合酶的纯化，一次提取操作萃取率达到93%(Oktem H.A.,Bayramoglu G.,Ozalp V.C.,and Arica M.Y.2007.Biotechnol.Prog.23:146-154.)。

发明内容

[0006] 本发明针对前文所述的SPME涂层种类较少、选择性不高及生物样品兼容性较差等问题，将核酸适配体亲合力高、特异性强、生物样品相容性好等特性与SPME技术耗时少、效率高、操作简单等优点结合在一起，在硅烷化石英纤维表面制备一层高通透性的多孔聚合物涂层，通过化学键合方法将核酸适配体固定到涂层多孔结构中，研制一种基于核酸适配体/多孔聚合物涂层的新型SPME纤维萃取头，用于复杂生物样品中痕量、超痕量生物碱、抗生素或核苷酸类物质的高选择性分离与富集。

[0007] 本发明通过以下技术方案实现：

[0008] 一种固相微萃取纤维萃取头的制备方法，按以下步骤进行：

[0009] （1）对裸石英纤维进行氢氟酸腐蚀、碱洗、酸洗及活化处理，然后采用具有不饱和双键的硅烷化试剂进行硅烷化处理；

[0010] （2）在聚合溶剂中加入丙烯酰胺功能单体、交联剂及引发剂，充分混合，得到预聚合溶液；

[0011] （3）取一定量预聚合溶液于试管中，放入步骤1所制得的硅烷化石英纤维，通氮气除氧，密封试管口，水浴中热引发共聚反应，使石英纤维表面涂渍聚合物涂层；

[0012] （4）聚合一定时间后，拔出石英纤维，放入另一洁净试管中，通氮气除氧，密封试管口，置于干燥箱中于一定温度下老化；

[0013] （5）在同一根石英纤维上重复以上（2）至（4）步骤若干次，在石英纤维表面重复涂渍若干次多孔聚合物涂层；

[0014] （6）将第（5）步中最后得到的多孔聚合物涂层石英纤维置于键合液中，室温下反应一定时间，取出石英纤维，用蒸馏水清洗，氮气吹干；

[0015] （7）将经第（6）步处理后的石英纤维置于核酸适配体溶液中，室温下键合反应一定时间，取出石英纤维，用缓冲液清洗，氮气吹干，低温保存。

[0016] 具体来说，所述硅烷化试剂为三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯。

[0017] 具体来说，所述聚合溶剂为丙酮，交联剂为三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯；所述引发剂为偶氮二异丁腈。

[0018] 优选地，丙酮与三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯体积比为9:1，丙烯酰胺与三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯摩尔比为1:4。

[0019] 多孔聚合物涂层在石英纤维表面重复涂渍达2~5层。

[0020] 具体来说，所采用的键合剂为羰基二咪唑，利用羰基二咪唑通过化学键合链接多孔聚合物涂层表面的氨基及核酸适配体端基上修饰的氨基。

[0021] 进一步来说，所采用的键合条件：羰基二咪唑浓度为0.7mol/L，键合时间为1.5小时。

[0022] 核酸适配体键合所用缓冲液为TE缓冲液，核酸适配体溶液浓度为6.25μg/mL，适配体键合时间为24小时。

[0023] 石英纤维表面均匀平滑，表面积小，不利于核酸适配体的键合。本发明对石英纤维表面进行化学改性及硅烷化处理后，通过自由基共聚合方法及重复涂渍方式在石英纤维表面制备具有一定厚度的多孔聚合物涂层，利用多孔聚合物涂层的三维多孔结构及高比表面积，显著提高核酸适配体在纤维表面的键合量。

[0024] 核酸适配体固载有多聚物包埋、物理吸附、直接自组装、间接自组装等方法，但普遍存在固载率较低、固载不牢固、适配体易流失等问题。本发明采用羰基二咪唑作为链接剂，通过化学键合方式链接多孔聚合物涂层表面功能单体丙烯酰胺的氨基基团与核酸适配体末端修饰的氨基基团，将核酸适配体共价键合固载于多孔聚合物涂层表面，制备得到新型核酸适配体/多孔聚合物涂层的SPME萃取头。

附图说明

[0025] 图1.核酸适配体/多孔聚合物涂层SPME萃取头制备过程示意图。（A.石英纤维表面化学处理及硅烷化；B.多孔聚合物涂层纤维制备；C.多孔聚合物涂层表面键合核酸适配体）

[0026] 图2.核酸适配体/多孔聚合物涂层SPME萃取头电子显微镜照片。（图2A为1000放大倍数；图2B为18000放大倍数）

[0027] 图3.ATP核酸适配体/多孔聚合物涂层SPME萃取头(Apt-Pol-fiber)、双碱基错配ATP核酸适配体/多孔聚合物涂层SPME萃取头(TMApt-Pol-fiber)、乱序ATP核酸适配体/多孔聚合物涂层SPME萃取头(SApt-Pol-fiber)分别萃取0.1mg/L三磷酸腺苷ATP、二磷酸腺苷ADP、单磷酸腺苷AMP、腺苷Adenosine、三磷酸鸟苷(GTP)、三磷酸尿苷(UTP)、三磷酸胞苷(CTP)、异丙甲草胺Metolachlor、茶碱Theophylline单标标准溶液萃取量对比图。

[0028] 图4.ATP核酸适配体/多孔聚合物涂层SPME萃取头萃取不同浓度ATP、ADP、AMP混标标准溶液萃取量曲线。

具体实施方式

[0029] 本实施以ATP核酸适配体/多孔聚合物涂层SPME萃取头制备为例，对本发明进行详细描述，但并不以此限定本发明的保护范围。

[0030] 如图1所示，ATP核酸适配体/多孔聚合物涂层新型SPME萃取头的制备步骤如下：

[0031] （1）取直径为125μm、长度为6.0cm的裸石英纤维，用10%氢氟酸溶液腐蚀20s，取出后用蒸馏水冲洗三次；将纤维置于1.0mol/L NaOH碱洗液中室温浸泡0.5h，取出后用蒸馏水冲洗三次；碱洗后将石英纤维置于1.0mol/L HCl酸洗液中浸泡0.5h，取出后用蒸馏水冲洗三次；将石英纤维放入培养皿中置于烘箱内150℃脱水活化1h。从烘箱中取出石英纤维，立即放入10％的三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯的丙酮溶液中，硅烷化反应0.5h，取出后用无水乙醇冲洗三次，氮气吹干。

[0032] （2）在磨口锥形瓶中依次加入27.0mL丙酮聚合溶剂、172mg丙烯酰胺功能单体、3.00mL三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯交联剂以及45.0mg偶氮二异丁腈引发剂，充分摇匀，制得预聚合溶液。取一洁净小试管，加入2.0mL预聚合溶液，超声脱气5min。在试管中放入一根硅烷化石英纤维，通氮气除氧1min，立即用胶塞封住试管口，将试管置于恒温水浴锅中，60℃加热聚合2h，打开胶塞，匀速拔出石英纤维，转移入另一洁净试管中，通氮气除氧，用胶塞封口，置于恒温干燥箱中65℃下加热老化12h。

[0033] （3）从干燥箱中取出上述装有涂渍一次聚合物石英纤维的试管，置于空气中冷却，加入2.0mL上述新鲜配制并经5min超声脱气处理后的预聚合溶液，通氮气除氧1min，立即用胶塞封住试管口，将试管置于恒温水浴锅中，60℃加热聚合2h，打开胶塞，匀速拔出石英纤维，转移入另一洁净空试管中，通氮气除氧，用胶塞封口，置于恒温干燥箱中65℃下加热老化12h。重复上述步骤，直至制得重复涂渍5次的多孔聚合物涂层石英纤维，最后置于恒温干燥箱中150℃下加热老化处理2h。

[0034] （4）取涂渍5次的多孔聚合物涂层石英纤维，用小刀将离纤维头部1cm以上的聚合物涂层刮去，剩下的多孔聚合物涂层长度统一为1.0cm。取一干燥洁净试管，在试管中加入1.5mL 0.7mol/L羰基二咪唑溶液（干乙腈溶解），放入上述处理好的多孔聚合物涂层石英纤维，键合1.5h后取出，用干乙腈冲洗3次，氮气吹干。

[0035] （5）在干燥洁净样品瓶中加入1.5mLTE缓冲液(10mmol/L tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH=7.5)，放入经羰基二咪唑键合处理后的多孔聚合物涂层石英纤维，室温下孵育30min。纤维取出后插入装有100μL6.25μg/mL的ATP核酸适配体标准溶液（TE缓冲液溶解，10mmol/l tris-HCl,1mmol/LEDTA,pH=7.5）的玻璃内衬管中，室温下键合反应24h。取出纤维，用TE缓冲液冲洗3次，得到ATP核酸适配体/多孔聚合物涂层SPME萃取头。

[0036] 本实施案例制备的ATP核酸适配体/多孔聚合物涂层SPME萃取头具有以下优点：

[0037] 1.采用化学键合方法，通过优化条件的自由基共聚反应在石英纤维表面涂渍多孔聚合物涂层，制备方法重复性好，同时制备20根多孔聚合物涂层纤维，涂层平均厚度为10.5μm，精密度为4.9％。

[0038] 2.制备得到的多孔聚合物涂层均匀、致密，表面呈疏松多孔结构（如图2所示），可显著提高后续核酸适配键合步骤中适配体固载量。该聚合物涂层具有良好的化学和机械稳定性能，以直接萃取方式重复使用200多次后，涂层没有出现任何开裂、剥落或磨损现象。

[0039] 3.如图3所示，本发明制备的ATP核酸适配体/多孔聚合物涂层SPME萃取头对ATP具有很高的选择性萃取能力（ATP萃取量为其它分析对象的6~62倍），对ATP结构类似物如ADP、AMP、GTP具有较好的选择性，对非结构相似物如茶碱、异丙甲草胺等没有选择性萃取能力，可用于复杂生物样品中痕量ATP、ADP、AMP的分离与富集。改变ATP核酸适配体碱基序列中两个关键识别位点碱基（21和34号碱基），制得的双碱基错配ATP核酸适配体/多孔聚合物涂层SPME萃取头对ATP、ADP、AMP的萃取量显著下降，而采用乱序ATP核酸适配体后萃取头对ATP、ADP、AMP没有选择性，这表明本发明所制备的新型SPME萃取头的选择性识别能力源自于萃取头表面键合的ATP核酸适配体。

[0040] 4.本发明所制备的ATP核酸适配体/多孔聚合物涂层SPME萃取头，对ATP、ADP、AMP具有较高的分离富集能力，萃取容量约为7.4、0.7、0.3ng，如图4所示。