一株阴沟肠杆菌及其应用

摘要

本发明公开了一株阴沟肠杆菌及其应用。本发明提供的阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）SXH-1，它的保藏编号为CGMCC No.6296。本发明还保护阴沟肠杆菌SXH-1在促进植物生长中的应用。所述植物具体可为韭菜。本发明所提供的阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）SXH-1可在好氧条件下将ACC作为唯一氮源进行生长，同时将其分解。该菌株有望在韭菜促生方面起到重要作用。

权利要求

1.阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）SXH-1，它的保藏编号为CGMCC No.6296。

2.权利要求1所述阴沟肠杆菌SXH-1在促进植物生长中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述植物为韭菜。

4.一种植物生长促进剂，其活性成分为权利要求1所述阴沟肠杆菌SXH-1。

5.如权利要求4所述的植物生长促进剂，其特征在于：所述植物为韭菜。

6.权利要求4所述植物生长促进剂在促进植物生长中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于：所述植物为韭菜。

8.权利要求1所述阴沟肠杆菌SXH-1在生产1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶和/或吲哚乙酸和/或嗜铁素中的应用。

9.权利要求1所述阴沟肠杆菌SXH-1的发酵液。

10.权利要求1所述阴沟肠杆菌SXH-1的细胞破碎物。

说明书

一株阴沟肠杆菌及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一株阴沟肠杆菌及其应用。

背景技术

[0002] 韭菜(Allium tuberosum Rottl．ex Spr．)为百合科葱属(Allium tuberosum)的多年生宿根植物，原产中国，国内各地均有栽培。

[0003] 韭菜富含维生素及各种矿物质，并且囚含有多种硫醚而具有特殊芳香味，可增进食欲，并有一定的药用价值。它的种子和叶等可入药，具健胃、提神、止汗固涩、补肾助阳、固精等功效。在中医里，韭菜有一个很响亮的名字叫“壮阳草”，还有人把韭菜称为“洗肠草”，韭菜还有很多其它别名，如草钟乳、起阳草、长生草、扁菜等。由于韭菜口感佳、味道鲜美所以受到大家的喜爱，尤其在春节前更是备受追捧，故而是一种经济植物。

[0004] 种植韭菜需要使用大量化肥，这不仪影响了韭菜的品质，也破坏了土壤环境，并且随着化肥的大量使用，其利用率不断降低已是众所周知的事实。这说明，仪靠大量增施化肥来提高韭菜产量是有限的。为此各国科学家一直在努力探索提高化肥利用率，达到平衡施肥、合理施肥以克服其弊端的途径。微生物肥料在解决这方面问题上有独到的作用。所以，根据我国作物种类和土壤条件，采用微生物肥料与化肥配合施用，既能保证增产，又减少了化肥使用量，降低成本，同时还能改善土壤及作物品质，减少污染。

[0005] 微生物肥料是指一类含有活微生物的特定制品，应用于农业生产中，能够获得特定的肥料效应。在这种效应的产生过程中，活微生物起关键作用。目前一般将微生物肥料制品分为两大类：一类是狭义的微生物肥料，指通过微生物的生命活动，增加了植物营养元素的供应量，包括土壤和生产环境中植物营养元素的供应总量，导致植物营养状况的改善，进而产量增加，这一类微生物肥料的代表品种是根瘤菌肥；另一类是广义的微生物肥料，指通过其中的微生物的生命活动，不但能提高植物营养元素的供应量，还能产生植物生长激素，促进植物对营养元素的吸收利用或有拮抗某些病原微生物的致病作用，减轻农作物病虫害而促进作物产量的增加。与化学肥料相比，微生物肥料具有以下特点：不破坏土壤结构、保护生态、不污染环境，对人、畜和植物无毒无害；肥效持久；提高作物产量和改进作物产品品质；成本低廉；

[0006] 近年来，有关植物根际促生细菌(PGPR)的研究日益受到人们的关注。由于化肥、农药对环境造成严重污染，化肥价格高涨，能源紧缺，澳大利亚、美国、欧共体组织和日本等国，都开展了PGPR的专项研究。1988～1997年已分别在加拿大、瑞士、澳大利亚和日本召开了四次国际研讨会，并将继续3年一届轮流在世界各大洲举行。PGPR研究和应用已成为当前农业微生物研究的新热点之一，与它有关的方面正在形成一个新的领域。作为微生物肥料的PGPR 能直接为宿主植物提供营养或间接为宿主植物根部的生长提供积极的作用，或者帮助宿主植物与其它共生体形成有益的共生关系。

发明内容

[0007] 本发明的目的是提供一株阴沟肠杆菌及其应用。

[0008] 本发明提供的阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）SXH-1，已于2012年06月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），保藏号为CGMCC No.6296。阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）SXH-1CGMCC No.6296简称阴沟肠杆菌SXH-1。

[0009] 本发明还保护阴沟肠杆菌SXH-1在促进植物生长中的应用。所述植物具体可为韭菜。

[0010] 本发明还保护一种植物生长促进剂，其活性成分为阴沟肠杆菌SXH-1。所述植物具体可为韭菜。所述活性成分具体可为将阴沟肠杆菌SXH-1悬浮于水中得到的菌悬液。所述9
菌悬液中，阴沟肠杆菌SXH-1的浓度具体可为10CFU/mL。

[0011] 本发明还保护所述植物生长促进剂在促进植物生长中的应用。所述植物具体可为韭菜。

[0012] 以上任一所述的韭菜具体可为如下品种：“大青苗”品种。

[0013] 本发明还保护阴沟肠杆菌SXH-1在生产1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶、吲哚乙酸或嗜铁素中的应用。

[0014] 应用阴沟肠杆菌SXH-1生产1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶具体可包括如下步骤：

[0015] （1）将阴沟肠杆菌SXH-1悬浮于ADF培养液，振荡培养后收集菌体；

[0016] （2）将步骤（1）得到的菌体悬浮于0.1mol/L Tris-HCl缓冲液(pH=8.0)，加入甲苯并破碎细胞，得到ACC脱氨酶。

[0017] 所述菌体、所述0.1mol/L Tris-HCl缓冲液(pH=8.0)和所述甲苯的配比具体可为：湿重为0.005g的菌体：600μL 0.1mol/L Tris-HCl缓冲液(pH=8.0)：30μL甲苯。

[0018] 步骤（1）中，所述破碎细胞的方法具体可为采用涡旋震荡仪振荡30s。

[0019] 应用阴沟肠杆菌SXH-1生产吲哚乙酸具体可包括如下步骤：将阴沟肠杆菌SXH-1接种于含有色氨酸的DF培养液，培养后得到吲哚乙酸。所述色氨酸在所述DF培养液中的-1浓度具体可为50-500μg·mL 。所述培养的条件可为：室温培养2天。所述培养的条件具-1
体可为：28℃、180r·min 振荡培养2天（48小时）。

[0020] 应用阴沟肠杆菌SXH-1生产嗜铁素具体可包括如下步骤：将阴沟肠杆菌SXH-1接种于MKB培养基，培养过后得到嗜铁素。所述培养的条件可为：室温培养2天。所述培养的-1条件具体可为：28℃、180r·min 振荡培养2天（48小时）。

[0021] 本发明还保护阴沟肠杆菌SXH-1的发酵液。所述发酵液是将阴沟肠杆菌SXH-1接种于发酵培养基并进行发酵后得到的。所述发酵培养基具体可为含有色氨酸的DF培养液-1或MKB培养基。所述色氨酸在所述DF培养液中的浓度具体可为50-500μg·mL 。所述发-1
酵的条件可为：室温培养2天。所述发酵的条件具体可为：28℃、180r·min 振荡培养2天。
所述发酵液中含有吲哚乙酸或嗜铁素。所述发酵液具有将来自Ca3(PO4)2的不溶形式磷酸根离子变为可溶形式磷酸根离子的能力。

[0022] 本发明还保护阴沟肠杆菌SXH-1的细胞破碎物。所述细胞破碎物中含有1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶。

[0023] 从韭菜根际土中筛选出的根际菌再重新施用于韭菜可以避免根际菌对微环境的不适同时也可以更好的与其他根际菌共同作用达到对韭菜的促生效果。本发明所提供的阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）SXH-1可在好氧条件下将ACC作为唯一氮源进行生长，同时将其分解。该菌株有望在韭菜促生方面起到重要作用。

附图说明

[0024] 图1为阴沟肠杆菌SXH-1在ADF培养基上的生长状况。

[0025] 图2为阴沟肠杆菌SXH-1合成生长激素的能力。

[0026] 图3为阴沟肠杆菌SXH-1合成嗜铁素的能力。

[0027] 图4为阴沟肠杆菌SXH-1的溶磷能力。

[0028] 图5为阴沟肠杆菌SXH-1对韭菜的大田促生效果。

[0029] 图6为阴沟肠杆菌SXH-1对韭菜促生14天时的株高。

[0030] 图7为阴沟肠杆菌SXH-1对韭菜促生14天时的植株地上部分鲜重。

[0031] 图8为阴沟肠杆菌SXH-1对韭菜促生14天时的植株地上部分干重。

具体实施方式

[0032] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

[0033] 1-氨基环丙烷-1-羧酸，英文名称为1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid，简称为ACC)：购于上海笛柏化学品技术有限公司，货号为P201735。哌嗪-1,4-二乙磺酸，英文名称为piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid，简称为PIPES）：购于Sigma公司，货号为MFCD06658739。

[0034] TSB培养液（pH7.5）：取胰蛋白胨17g、大豆胨3g、NaCl 5g、葡萄糖2.5g和K2HPO42.5g，加入蒸馏水并用蒸馏水定容至1L。

[0035] DF培养液（pH7.5）：取KH2PO44g、Na2HPO46g、MgSO4·7H2O 0.2g、FeSO4·7H2O 1mg、葡萄糖2g、葡萄糖酸2g、柠檬酸2g、（NH4）2SO42g和微量元素溶液0.1ml，加入蒸馏水并用蒸馏水定容至1L。

[0036] ADF培养液（pH7.5）：用3.0mmol ACC替代DF培养液中的2.0g (NH4)2SO4，其它完全同DF培养液；ADF培养液中ACC为唯一氮源。

[0037] 微 量 元 素 溶 液：取 H3BO310mg、MnSO411.2mg、ZnSO4124.6mg、CuSO478.2mg 和MoO310mg，加入蒸馏水并用蒸馏水定容至100mL。

[0038] MKB培养基（pH7.2）：取酸水解酪蛋白5g、甘油15mL、K2HPO42.5g、MgSO4·7H2O 2.5g，与蒸馏水混匀并用蒸馏水定容至1000mL。

[0039] NBRIP液体培养基(pH7.0)：取葡萄糖10g、Ca3(PO4)25g、MgCl25g、MgSO4·7H2O0.25g、KCl 0.2g和(NH4)2SO40.1g，加入去离子水并用去离子水定容至1L。

[0040] NBRIP固体培养基：在NBRIP液体培养基的基础上，每升添加琼脂15g。

[0041] 实施例1、阴沟肠杆菌SXH-1的分离和鉴定

[0042] 一、菌株SXH-1的获得

[0043] 1、取样

[0044] 供试韭菜及土壤取于黑龙江省哈尔滨市呼兰区双井镇（土壤理化性质：pH8.15，全盐含量1.83%，碱解氮36mg/kg，有效磷8mg/kg，速效132mg/kg，有机质2.69%）。将韭菜及植物根际土壤装入事先准备好的干净保鲜袋中，带回实验室种植待测。

[0045] 2、筛选和纯化

[0046] （1）取1g根际土样于50mL PAF培养基中，28℃振荡培养。PAF培养基含有蛋白胨、酪蛋白水解物、MgSO4、K2HPO4和甘油。

[0047] （2）取1mL（1）震荡后的PAF培养液，于50mL PAF培养基中，28℃振荡培养。

[0048] （3）取1mL（2）得到的PAF培养液，于50mL DF盐培养液中，28℃振荡培养。DF盐培养液含有KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4、FeSO4、葡萄糖、葡萄糖酸、柠檬酸、(NH4)2SO4、H3BO3、MnSO4、ZnSO4、CuSO4和MoO3。

[0049] （4）取1mL（3）得到的DF盐培养液，于50mL不含(NH4)2SO4，但含有3mM ACC的DF盐培养液中，28℃振荡培养。

[0050] （5）取1mL（4）得到的培养液，涂布于含3mM ACC的DF盐琼脂培养基上，28℃培养。

[0051] （6）取（5）培养基上生长的菌落，纯化并得到纯培养的菌株。

[0052] 将得到的一株菌命名为SXH-1。

[0053] 二、菌株SXH-1的鉴定

[0054] 1、形态鉴定

[0055] 菌株SXH-1在ADF培养基上形成圆形、半透明、乳白色、突起光滑、边缘整齐、有粘性的菌落（见图1）。

[0056] 2、分子鉴定

[0057] 提取菌株SXH-1的基因组DNA，进行16S rDNA的PCR扩增和测序。

[0058] PCR扩增采用的引物如下：

[0059] 利用引物F8/20：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；

[0060] R1541/20：5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'。

[0061] PCR扩增条件：94℃变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1.5min，共30个循环；72℃10min；4℃无限。

[0062] 对PCR扩增产物进行测序，测序结果如序列表中序列1所示。

[0063] 三、菌株SXH-1的保藏

[0064] 通过步骤二的鉴定，菌株SXH-1属于阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）。

[0065] 阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）SXH-1，已于2012年06月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），保藏号为CGMCC No.6296。阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）SXH-1CGMCC No.6296简称阴沟肠杆菌SXH-1。

[0066] 实施例2、阴沟肠杆菌SXH-1生产ACC脱氨酶的能力

[0067] 实验机理：1-氨基环丙烷-1-羧酸在ACC脱氨酶的作用下，降解生成α-丁酮酸（α-KA）和氨气。

[0068] 实验步骤如下：

[0069] 1、将阴沟肠杆菌SXH-1在TSB培养液中过夜培养，4℃离心收集菌体并用DF培养液洗涤三次。

[0070] 2、将步骤1得到的菌体悬浮于ADF培养液，室温(21士1℃)振荡培养2d，4℃离心收集菌体，用0.1mol/L Tris-HCl缓冲液(pH=7.6)洗涤三次。

[0071] 3、将步骤2得到的菌体（湿重约0.005g）重新悬浮于600μL 0.1mol/L Tris-HCl缓冲液(pH=8.0)中，加入30μL甲苯并迅速振荡30s（采用涡旋震荡仪）以破碎细胞，整个破碎后体系即为细胞提取物。

[0072] 4、分组处理

[0073] 实验组：取200μL细胞提取物，加入20μL 0.5mol/L ACC水溶液并混匀，30℃培养15min（即反应时间为15min，也就是0.25小时）；然后加入1mL 0.56mol/L HCl水溶液，16000g离心5min，取上清液；取1mL上清液，加入800μL 0.56mol／L Hcl水溶液和300μL
2，4-二硝基苯肼溶液(溶剂为2M Hcl水溶液)，30℃培养30min，加入2mL 2mol／L NaOH水溶液，540nm测吸光度，得到OD540nm数值。

[0074] 空白对照组：用20μL水代替20μL 0.5mol／L ACC水溶液，其它同实验组。

[0075] 采用α-丁酮酸标准品代替以上细胞提取物进行步骤4的实验组相同的实验并制2
作标准曲线，标准曲线方程(方程甲)如下：y=192x-1.7864，R=0.9713，x代表OD540nm数值，y代表a-丁酮酸(μmol／L)。

[0076] 采用考马斯亮蓝法(Bradford法)检测细胞提取物的总蛋白含量。以采用牛血清白蛋白为标准品，制作标准曲线，标准曲线方程(方程乙)如下：y=404.53x-1.6665，2
R=0.9972，y代表总蛋白浓度(mg／L)，x代表OD595nm吸光值。

[0077] ACC脱氨酶活性的计算方法如下：将(实验组的OD540nm数值-空白对照组的OD540nm数值)的结果代入方程甲，得到数值A；将细胞提取物的总蛋白浓度作为数值B；用数值A除以数值B，再除以反应时间(0.25小时)，得到的结果即为ACC脱氨酶活性，单位为μmol -1α-KA·(mg蛋白质·h) 。

[0078] 阴沟肠杆菌SXH-1得到的细胞提取物具有ACC脱氨酶活性，数值为-1
0.465μmolα-KA·(mg蛋白质·h) 。

[0079] 实施例3、阴沟肠杆菌SXH-1生产生长激素(吲哚乙酸，IAA)的能力

[0080] l、将阴沟肠杆菌SXH-1在DF培养液中28℃、180 r·min-1振荡培养2d，再微量转入-1添加不同浓度色氨酸(L-Trp)的DF培养液(L-Trp的浓度为0、50、100、200或500μg·mL )中继续培养2d，取样于600nm测吸光度(OD600nm数值)，其余培养液室温下8000g离心取上清液。

[0081] 2、取500μL步骤1的上清液，添加2mL Salkowski试剂(每升含150mL H2SO4、250mLddH2O和7.5mL 0.5mol／L Fecl3。水溶液，其余为水)，室温黑暗培养20min后在
535nm处测吸光度(OD535nm数值)。

[0082] 将DF培养液代替步骤1的上清液进行步骤2的实验，作为测吸光度的调零处理。

[0083] 将不同浓度的IAA水溶液代替步骤1的上清液进行步骤2的实验，制作标准曲2
线，标准曲线方程如下：y=0.0784x-0.0139，R=0.9792，x代表OD535nm数值，y代表IAA浓度-1
(μg·mL )。

[0084] 对照标准曲线，计算步骤1得到的上清液中的IAA浓度。将IAA浓度除以OD600nm数值，结果见表1和图2。

[0085] 表1阴沟肠杆菌SXH-1生产IAA的能力，单位为μg·(mL·OD600)-1

[0086]

[0087] 结果表明，阴沟肠杆菌SXH-1能产生吲哚乙酸，且随着L-Trp浓度的增加，吲哚乙酸合成量也随之增加。

[0088] 实施例4、阴沟肠杆菌SXH-1生产嗜铁素的能力

[0089] 某些菌株通过产生嗜铁素(Siderophores)与环境中的铁离子高度结合，使植物病原菌缺乏铁营养而不能生长繁殖，从而占据一定的生态位。

[0090] 一、铬天青S固体培养基平板的制备

[0091] 1、蓝色染液的制备

[0092] (1)将0.06g铬天青S(chrome azurol S)溶于50ml去离子水。

[0093] (2)取0.0027g FeCl·6H2O溶于l0ml l0mM HCl水溶液(溶剂为去离子水)。

[0094] (3)取0.073g CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)溶于40ml去离子水。

[0095] (4)将全部步骤(1)的溶液与9ml步骤(2)的溶液混合，再混合全部步骤(3)的溶液，此时为蓝色，121℃灭菌20min。

[0096] 2、铬天青S固体培养基平板的制备

[0097] (1)MM9培养液：将15g KH2PO4、25g NaCl和50g NH4Cl溶于500ml去离子水。

[0098] (2)将20g葡萄糖溶于100mL去离子水，110℃灭菌。

[0099] (3)将3g酪蛋白水解物溶于27ml去离子水，滤膜过滤并收集滤液。

[0100] (4)铬天青S固体培养基平板的制备

[0101] 将100ml MM9培养液与750ml去离子水混匀，然后加入32.24g PIPES并使其溶解，加入15g琼脂，121℃灭菌20min后冷却到50℃，然后加入30ml步骤(3)得到的滤液和10ml步骤(2)得到的溶液，然后缓慢加入100ml步骤1制备的蓝色染液(沿玻璃瓶壁加入，充分混匀)，倒板。

[0102] 一、阴沟肠杆菌SXH-1生产嗜铁素的能力

[0103] 将阴沟肠杆菌SXH-1接种至于铬天青S固体培养基平板上，28℃培养48h，观察菌落周围的颜色变化，如有橘黄色圈产生说明阴沟肠杆菌SXH-1产生了嗜铁素。

[0104] 28℃培养48h后的照片见图3。阴沟肠杆菌SXH-1菌落周围有橘黄色晕圈产生，即阴沟肠杆菌SXH-1可产生嗜铁素。分别测量橘黄色圈的直径(D)和菌落直径(d)，直径比(D／d)为1.359。

[0105] 三、CAS检测液的制备

[0106] 1、将0.182g CTAB溶于50ml去离子水。

[0107] 2、将0.0054g FeCl·6H2O溶于20ml 10mM HCl水溶液。

[0108] 3、将0.0605g铬天青S溶于50ml去离子水。

[0109] 4、将1.5ml步骤2得到的溶液与7.5ml步骤3得到的溶液混合，再与6ml步骤1得到的溶液混合，得到混合液。

[0110] 5、将4.307g PIPES用20-30ml去离子水溶解，加入6.25ml浓HCl，调pH为5.6。

[0111] 6、将全部步骤4得到的溶液和全部步骤5得到的溶液混合，并用去离子水定容至溶100ml。

[0112] 四、阴沟肠杆菌SXH-1生产嗜铁素的能力

[0113] 1、将阴沟肠杆菌SXH-1接种于MKB培养基，28℃、180r·min-1振荡培养48h，离心（10000rpm/min，10min）取上清液。

[0114] 2、将3ml步骤1得到的上清液与3ml CAS检测液混匀，28℃静置1h，然后在630nm处测吸光值（OD630nm数值），结果为A。

[0115] 3、将3ml MKB培养基与3ml CAS检测液混匀，28℃静置1h，然后在630nm处测吸光值（OD630nm数值），结果为Ar。

[0116] A/Ar值越小，说明合成嗜铁素能力越强。阴沟肠杆菌SXH-1的A/Ar值为1.067，说明其具有一定的合成嗜铁素的能力。

[0117] 实施例5、阴沟肠杆菌SXH-1的溶磷能力

[0118] 一、溶磷性测定

[0119] 将阴沟肠杆菌SXH-1点接在NBRIP固体培养基上，30℃培养4天，拍照并测量溶磷圈直径（D）和菌落直径（d）。

[0120] 照片见图4。阴沟肠杆菌SXH-1具有溶解Ca3(PO4)2的能力，可以使磷酸根离子由不溶形式变为可溶形式，从而被植物或菌株利用。阴沟肠杆菌SXH-1的D/d值为1.958。

[0121] 二、溶磷量测定

[0122] 1、将阴沟肠杆菌SXH-1按1%的接种量接种于NBRIP液体培养基中，使得阴沟肠9
杆菌SXH-1的初始浓度为10CFU/mL，30℃、170r/min振荡培养7天，然后10000r/min离心
10min，收集上清液。

[0123] 2、检测步骤1得到的上清液的含磷量（钼锑抗比色法）。

[0124] 硫酸钼锑抗混合显色剂的制备：①52ml浓硫酸注入100ml去离子水搅拌；②5g钼酸铵溶于60℃、50ml去离子水中；③0.5%酒石酸锑钾：0.125g酒石酸锑钾溶于25ml去离子水中；将①倒入②中，再将③加入①和②的混合液中，用水定容到250ml，然后每100ml加入1.5g左旋抗坏血酸；现配现用。

[0125] 取5ml步骤1得到的上清液，置于50ml容量瓶中，加入5ml 7.5mol／L硫酸钼锑抗混合显色剂，加去离子水定容至刻度，充分摇匀，静置30min，然后在660nm处测吸光值(OD660nm数值)

[0126] 采用不同浓度的磷酸水溶液代替步骤1得到的上清液进行上述实验，制作标准2
曲线，标准曲线方程如下：y=2.0858x+0.0868，R=0.969(x为OD660nm数值，y代表磷酸浓度(μg／ml)。

[0127] 对照标准曲线，步骤1得到的上清液中的磷酸根浓度为5.549μg／ml，即阴沟肠杆菌SXH-1的溶磷能力较强。

[0128] 实施例6、阴沟肠杆菌SXH-1对韭菜的促生效果

[0129] 韭菜：本实施例中进行试验的韭菜为黑龙江省哈尔滨市呼兰区双井镇的“大青苗”品种的韭菜，购买于呼兰区双井镇双井村。

[0130] 一、阴沟肠杆菌SXH-1菌液的制备

[0131] 将阴沟肠杆菌SXH-1接种于TSB培养液，28℃下振荡培养，4℃离心收集菌体，用无9
菌水洗涤2次后重悬于无菌水中，使活菌数在无菌水中的终浓度达10CFU／mL，即为阴沟肠杆菌SXH-1菌液。

[0132] 二、灌根实验

[0133] 实验组：对黑龙江省哈尔滨市呼兰区双井镇田地中生长的多年生韭菜进行灌根实验，即浇灌步骤一得到的菌液，每平方米浇灌2000毫升，正常管理，一个月后拍照，照片见图5；

[0134] 对照组：用2000毫升水代替2000毫升步骤一得到的菌液，其它同实验组。

[0135] 结果表明，实验组韭菜的生长情况显著优于对照组的韭菜。

[0136] 三、浸种实验

[0137] 土壤取于黑龙江省哈尔滨市呼兰区双井镇，采集样品时在每个区域内设置5个样2
方，样方面积为1×0.3m，收集表层土壤(0~20cm)，土壤混合后，装入事先准备好的干净保鲜袋中，迅速将土样带回实验室，土壤经碾碎，混匀，风干后过筛保存。

[0138] 将韭菜种子用0.5％(体积比)次氯酸钠水溶液表面消毒10min，用无菌水洗涤，然后分组处理：实验组：用步骤一制备的菌液浸泡1h；对照组：用无菌水浸泡1h。

[0139] 然后将处理后的韭菜种子均匀种在盆中(填充物为土壤)，每盆20株，每组种植5盆，于培养室内25℃培养，隔天浇水。发芽14天后观察生长情况并测量株高、植株地上部分鲜重及植株地上部分干重。

[0140] 株高测量结果见图6(纵坐标的单位为cm)。与对照组相比，实验组韭菜的株高增加46.76％。

[0141] 植株地上部分鲜重（纵坐标单位为g，以10株植株计）测量结果见图7。与对照组相比，实验组韭菜的鲜重增加314.22%。

[0142] 植株地上部分干重（纵坐标单位为g，以10株植株计）测量结果见图8。与对照组相比，实验组韭菜的干重增加243.84%。

[0143] 结果表明，实验组韭菜的生长情况显著优于对照组韭菜。