一株苜蓿根际促生菌MJM-5及其应用

摘要

本发明公开了一株苜蓿根际促生菌MJM-5及其应用。本发明提供的荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）菌株MJM-5，其保藏编号为CGMCC No.6293。上述的荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）菌株MJM-5在如下1）-4）至少一种中的应用：1）制备ACC脱氨酶；2）制备吲哚乙酸；3）制备嗜铁素；4）在盐碱胁迫下促进植物生长。本发明的实验证明，本发明分离得到一株苜蓿根际促生菌MJM-5，其可以合成ACC脱氨酶、IAA嗜铁素，而且可在盐碱胁迫环境中有效地促进植物营养吸收、调节植物生长以及提高植物在逆境条件下抗逆能力。

权利要求

1.荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）菌株MJM-5，其保藏编号为CGMCC No.6293。

2.权利要求1所述的荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）菌株MJM-5在如下

1）-4）至少一种中的应用：

1）制备ACC脱氨酶；

2）制备吲哚乙酸；

3）制备嗜铁素；

4）促进植物生长；所述促进植物生长具体在盐碱胁迫条件下进行；

所述植物为小麦或苜蓿。

3.一种制备产物的方法，包括如下步骤：发酵权利要求1所述的荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）菌株MJM-5，即得到产物；所述产物为ACC脱氨酶、吲哚乙酸或嗜铁素；

若所述产物为ACC脱氨酶时，所述发酵采用的培养基为TSB培养基和ADF培养基；

若所述产物为吲哚乙酸时，所述发酵采用的培养基为DF培养基或含有色氨酸的DF培养基；

若所述产物为嗜铁素时，所述发酵采用的培养基为MKB培养基。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述制备ACC脱氨酶的方法包括如下步骤：

1）在所述TSB培养基中培养权利要求1所述的荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）菌株MJM-5，收集菌体，得到培养菌1；

2）将所述培养菌1接种到所述ADF培养基中诱导培养，收集菌体，即得到ACC脱氨酶。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述制备吲哚乙酸的方法包括如下步骤：在所述DF培养基或所述含有色氨酸的DF培养基中培养权利要求1所述的荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）菌株MJM-5，收集发酵产物，即得到吲哚乙酸。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述含有色氨酸的DF培养基中色氨酸的终浓度为0-500μg/mL，且不为0。

7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述制备嗜铁素的方法包括如下步骤：在MKB培养基中培养权利要求1所述的荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）菌株MJM-5，收集发酵产物，即得到嗜铁素。

8.一种促进植物生长的方法，包括如下步骤：播种前，将植物种子浸泡到权利要求1所述的荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）菌株MJM-5菌悬液中；播种后，将权利要求

1所述的荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）菌株MJM-5菌悬液浇灌所述植物；实现促进植物生长；

所述促进植物生长在盐碱胁迫条件下进行；

所述植物为小麦或苜蓿。

说明书

一株苜蓿根际促生菌MJM-5及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一株苜蓿根际促生菌MJM-5及其应用。

背景技术

[0002] 盐碱土是陆地上分布广泛的一种土壤类型，是陆地表面生态脆弱区域。目前全世界盐碱地面积约10亿公顷以上，且随着生态环境的日益恶化，土壤次生盐碱化也日益加剧，影响了农牧业的发展，加重了沙漠化、荒漠化程度，已成为世界性环境问题。中国盐碱化土地约有0.12亿公顷，占世界盐碱地面积的1.2%左右，占中国现有耕地面积的15%左右，这些地区植被减少，已经成为限制中国农业经济发展的重要因素。盐碱化土地资源的及时恢复和合理利用开发对推动经济和生态环境协调发展具有重大意义。作物耐盐碱性的提高、盐碱土的生物治理和综合开发是未来农业的重大课题。

[0003] 盐碱胁迫从多方面对植物整个生命周期都会产生影响。盐碱胁迫能抑制种子萌发、幼苗生长，影响根、茎、叶、花、果实等器官的生长发育，抑制植物的光合作用过程，影响根系对矿质离子的吸收、转运、分布和利用，干扰植物碳、氮、氧的利用及次生代谢的形成，同时严重影响植物的呼吸作用，给农牧业生产造成了严重的损失。

[0004] 1-氨基环丙烷-1-羧酸（1-aminocyclopropane-1-carboxylate，ACC）是植物体内乙烯的合成前体，含ACC脱氨酶的植物根际促生细菌(plant growth-promoting rhizobacteria,简称PGPR)对植物的促生作用基于细菌能产生ACC脱氨酶，降低了逆境条件下植物体内乙烯积累来减少植物胁迫，促进植物根部生长和繁殖，从而提高植物抗逆性。同时，PGPR合成的植物生长素IAA，能刺激植物细胞生长和增殖，还能诱导ACC合成酶的活性。通过接种PGPR有助于减轻盐分对植物产生的不良反应，被认为是一种环境友好、经济有效提高作物产量、改良盐渍化土壤的方法。

发明内容

[0005] 本发明的一个目的是提供一株荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）菌株MJM-5。

[0006] 本发明提供的荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）菌株MJM-5，其保藏编号为CGMCC No.6293。

[0007] 上述的荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）菌株MJM-5在如下1）-4）至少一种中的应用也是本发明保护的范围：

[0008] 1）制备ACC脱氨酶；

[0009] 2）制备吲哚乙酸；

[0010] 3）制备嗜铁素；

[0011] 4）促进植物生长；所述促进植物生长具体在盐碱胁迫条件下进行。

[0012] 本发明的另一个目的是提供一种制备产物的方法。

[0013] 本发明提供的方法，包括如下步骤：发酵上述的荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）菌株MJM-5，即得到产物；所述产物为ACC脱氨酶、吲哚乙酸或嗜铁素。

[0014] 上述方法中，若所述产物为ACC脱氨酶时，所述发酵采用的培养基为TSB培养基和ADF培养基；其中，TSB培养基：胰蛋白胨17g、大豆胨3g、NaCl5g、葡萄糖2.5g、K2HPO42.5g溶解到1000ml蒸馏水中，调整pH值至pH=7.5。

[0015] ADF培养基：KH2PO44.0g、Na2HPO46.0g、MgSO4·7H2O0.2g、FeSO4·7H2O0.1g、葡萄糖2.0g、葡萄糖酸2.0g、柠檬酸2.0g、微量元素0.1mL、加入蒸馏水中溶解后，调整pH值至pH=7.5，定容至1000ml，高温灭菌后加入1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC），使其终浓度为3.0mmol/L（可先配制母液0.5mol/L）；其中，微量元素(100mL)：H3BO310mg、MnSO411.2mg、ZnSO4124.6mg、CuSO478.2mg、MoO310mg。若所述产物为吲哚乙酸（IAA）时，所述发酵采用的培养基为DF培养基或含有色氨酸的DF培养基；其中DF培养基：KH2PO44.0g、Na2HPO46.0g、MgSO4·7H2O0.2g、FeSO4·7H2O0.1g、葡萄糖2.0g、葡萄糖酸2.0g、柠檬酸2.0g、(NH4)2SO42.0g、微量元素0.1mL、加入蒸馏水中溶解后，调整pH值至pH=7.5，定容至1000ml。
微量元素配制同上。

[0016] 若所述产物为嗜铁素时，所述发酵采用的培养基为MKB培养基，其中MKB培养基(1L)：酸解酪蛋白5g，甘油15mL，K2HPO42.5g，MgSO4·7H2O2.5g，pH7.2。121℃，20min灭菌。

[0017] 上述制备ACC脱氨酶的方法包括如下步骤：

[0018] 1）在所述TSB培养基中培养上述的荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）菌株MJM-5，收集菌体，得到培养菌1；

[0019] 2）将所述培养菌1接种到所述ADF培养基中诱导培养，收集菌体，即得到ACC脱氨酶。

[0020] 在上述制备ACC脱氨酶的方法中，步骤1）中，所述培养条件为28℃，180rpm培养12h；

[0021] 步骤2）中，所述诱导培养为28℃，180rpm培养48h。

[0022] 上述制备ACC脱氨酶的方法中还包括如下步骤：先将所述菌体、0.1mol/L Tris-HCl（pH=8.5）、甲苯和0.5mol/L ACC混匀，培养，得到甲苯培养物；再将所述甲苯培养物加入0.56mol/L HCl混匀，离心收集上清液，得到ACC脱氨酶。

[0023] 在上述制备ACC脱氨酶的方法具体包括如下步骤：

[0024] 挑取上述的荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）菌株MJM-5于50ml TSB培养基中28℃，180rpm培养12h后，4℃离心收集菌体，用50ml DF培养基洗涤三次，将菌体转接于ADF培养基中28℃，180rpm诱导培养48h，收集诱导培养产物；将诱导培养产物离心收集菌体，再将菌体悬浮于1ml0.1mol/L Tris-HCl（pH=7.6）中转移至1.5ml的离心管中，1600g离心去上清，收集菌体；再重悬菌体于600μl0.1mol/LTris-HCl（pH=8.5）中，加入
30μl甲苯漩涡震荡30s，得到甲苯细胞，向甲苯细胞中加入20μl0.5mol/L ACC短暂震荡后，30℃培养15min，之后加入1ml0.56mol/LHCl混合震荡室温（25℃）离心5min，收集上清液，得到ACC脱氨酶。

[0025] 上述制备吲哚乙酸的方法包括如下步骤：在所述DF培养基或所述含有色氨酸的DF培养基中培养上述的荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）菌株MJM-5，收集发酵产物，即得到吲哚乙酸。

[0026] 上述制备吲哚乙酸的方法中，所述含有色氨酸的DF培养基中色氨酸的终浓度为0-500μg/mL，且不为0。

[0027] 上述制备吲哚乙酸的方法中的培养条件为28℃，180rpm培养2天；

[0028] 上述制备吲哚乙酸的方法还包括如下步骤：将所述发酵产物离心，收集上清液，得到吲哚乙酸。

[0029] 上述制备吲哚乙酸的方法具体包括如下步骤：

[0030] 上述的荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）单菌落MJM-5于DF液体培养基-1培养基中28℃，180rpm培养2d，转接到添加不同浓度（0、50、100、200、500μg·mL ）色氨酸的DF培养基中，28℃，180rpm培养2d，收集发酵产物，然后将发酵产物8000rpm离心10min，收集上清液，得到IAA。

[0031] 上述制备嗜铁素的方法包括如下步骤：在MKB培养基中培养上述的荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）菌株MJM-5，收集发酵产物，即得到嗜铁素。

[0032] 上述制备嗜铁素的方法的培养条件为28℃，180rpm培养48h；

[0033] 上述制备嗜铁素的方法中还具体包括如下步骤：将所述发酵产物离心，收集上清液，得到嗜铁素。

[0034] 上述制备嗜铁素的方法具体包括如下步骤：

[0035] 将上述的荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）菌株MJM-5接种于MKB培养-1基中，28℃摇床培养(180r·min )48h；收集发酵产物，发酵产物1000rpm、离心10min取上清液，得到嗜铁素。

[0036] 本发明的第三个目的是提供一种促进植物生长的方法。

[0037] 本发明提供的方法，包括如下步骤：播种前，将植物种子浸泡到上述的荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）菌株MJM-5菌悬液A中；播种后，将上述的荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）菌株MJM-5菌悬液B浇灌所述植物；实现促进植物生长。

[0038] 上述方法中，所述植物生长在盐碱胁迫条件下进行；本发明的实施例中用的是表1指标所示的盐碱土。

[0039] 所述植物具体为单子叶植物或双子叶植物；

[0040] 所述单子叶植物进一步具体为小麦或苜蓿。

[0041] 上述促进植物生长体现在提高发芽率、株高、根长、地上植株鲜重、地上植株鲜重干重、地下根系鲜重和/或地下根系干重。

[0042] 上述方法中，播种后的菌悬液浇灌植物的根部。

[0043] 上述播种前的菌悬液（菌悬液A）浓度为1×1010cfu/ml；播种后的菌悬液（菌悬液9
B）浓度为1×10cfu/ml。

[0044] 上述荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）菌株MJM-5菌悬液A按照如下方法制备：将荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）菌株MJM-5接种于LB培养基中，于10
28℃，180rpm条件下振荡培养24h，收集菌液，用无菌水调节菌液浓度为1×10 cfu/ml，得到菌悬液A。

[0045] 上述荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）菌株MJM-5菌悬液B按照如下方9
法制备：用无菌水调节上述菌悬液A至浓度为1×10cfu/ml，得到菌悬液B。

[0046] 上述促进植物生长的方法具体包括如下步骤：播种前，将植物种子预先用10%(V/V)次氯酸钠表面消毒10min后用无菌水洗涤三次，浸泡于菌悬液A中处理1h；播种后，将菌悬液B均匀浇灌于植物苗根部周围。

[0047] 上述菌株MJM-5（Pseudomonas fluorescens）于2012年6月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏号为CGMCC No.6293，分类命名为荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens)。

[0048] 本发明的实验证明，本发明分离得到一株苜蓿根际促生菌MJM-5，其可以合成ACC脱氨酶、IAA嗜铁素，而且可在盐碱胁迫环境中有效地促进植物营养吸收、调节植物生长以及提高植物在逆境条件下抗逆能力，该菌株可应用在作物栽培，能够增进肥效，提高产量。

附图说明

[0049] 图1为菌株MJM-5（Pseudomonas fluorescens）在ADF培养基上生长的菌落形态[0050] 图2为菌株MJM-5（Pseudomonas fluorescens）在不同色氨酸浓度下IAA合成含量

[0051] 图3为菌株MJM-5（Pseudomonas fluorescens）嗜铁素定性检测平板效果图[0052] 图4为菌株MJM-5（Pseudomonas fluorescens）在盐碱胁迫下对苜蓿促生效果图[0053] 图5为菌株MJM-5（Pseudomonasfluorescens）在盐碱胁迫下对小麦促生效果图具体实施方式

[0054] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0055] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0056] 实施例1、苜蓿根际促生菌的筛选和鉴定

[0057] 1、筛选

[0058] 取1g根际土样于50mL PAF培养基中，28℃振荡培养。该PAF培养基中含有蛋白胨，酪蛋白水解物，MgSO4，K2HPO4，甘油。取1mL震荡后的PAF培养液，于50mL PAF培养基中，28℃振荡培养。取1mL得到的PAF培养液，于50mL DF盐培养液中，28℃振荡培养。该DF盐培养液含有KH2PO4，Na2HPO4，MgSO4，FeSO4，葡萄糖，葡萄糖酸，柠檬酸，(NH4)2SO4，H3BO3，MnSO4，ZnSO4，CuSO4，MoO3。取1mL得到的DF盐培养液，于50mL不含(NH4)2SO4，但含有3mM1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）的上述DF盐培养液中，28℃振荡培养。取1mL得到的培养液，涂布于含3mM ACC的DF盐琼脂培养基上，28℃培养。取培养基上生长的单菌落纯化，对纯化后的细菌进行编号，挑取单菌落，转接到ADF培养基上保存备用，命名为MJM-5。

[0059] 2、菌落特征及菌体形态

[0060] 该菌株MJM-5在ADF培养基（配方见后面）上形成圆形、不透明、淡黄色、突起光滑、边缘整齐、有粘性的菌落。如图1所示。

[0061] 3、生理生化特征

[0062] 根据《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰细菌手册》对分离出的菌株MJM-5进行革兰氏染色、接触酶、甲基红、乙酰甲基甲醇、淀粉水解、吲哚、柠檬酸盐作用生理生化实验的检测和鉴定。MJM-5（Pseudomonas fluorescens）为革兰氏阴性菌，表现出接触酶阳性，淀粉水解阳性，吲哚实验表现为阳性，甲基红、乙酰甲基甲醇、柠檬酸盐作用实验表现为阴性。

[0063] 4、16S rDNA序列分析

[0064] MJM-5的16S rDNA基因序列，见核苷酸序列表1所示。将MJM-5的16S rDNA基因序列与数Genbank据库中的序列进行BLAST比对分析，结果表明：MJM-5与Pseudomonas fluorescens的16S rDNA基因序列的相似性达99％。

[0065] 上述菌株MJM-5（Pseudomonas fluorescens）于2012年6月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏号为CGMCC No.6293，分类命名为荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens)。

[0066] 实施例2、菌株MJM-5（Pseudomonas fluorescens）在制备ACC脱氨酶中的应用[0067] 1、发酵制备ACC脱氨酶

[0068] TSB培养基：胰蛋白胨17g、大豆胨3g、NaCl5g、葡萄糖2.5g、K2HPO42.5g溶解到1000ml蒸馏水中，调整pH值至pH=7.5。

[0069] ADF培养基：KH2PO44.0g、Na2HPO46.0g、MgSO4·7H2O0.2g、FeSO4·7H2O0.1g、葡萄糖2.0g、葡萄糖酸2.0g、柠檬酸2.0g、微量元素0.1mL、加入蒸馏水中溶解后，调整pH值至pH=7.5，定容至1000ml，高温灭菌后加入1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC），使其终浓度为3.0mmol/L（可先配制母液0.5mol/L）；其中，微量元素(100mL)：H3BO310mg、MnSO411.2mg、ZnSO4124.6mg、CuSO478.2mg、MoO310mg。

[0070] 无 (NH4)2SO4 的 DF 培 养 基：KH2PO44.0g、Na2HPO46.0g、MgSO4·7H2O0.2g、FeSO4·7H2O0.1g、葡萄糖2.0g、葡萄糖酸2.0g、柠檬酸2.0g、微量元素0.1mL、加入蒸馏水中溶解后，调整pH值至pH=7.5，定容至1000ml。微量元素配制同上。

[0071] 挑取由实施例1获得的MJM-5（Pseudomonas fluorescens）CGMCC NO.6293单菌落于50ml TSB培养基中28℃，180rpm培养12h后，4℃、8000g、离心10min收集菌体，用50ml无(NH4)2SO4的DF培养基洗涤三次，将菌体转接于ADF培养基中28℃，180rpm诱导培养48h，得到收集诱导培养产物。将诱导培养产物4℃、8000g、离心10min收集菌体。

[0072] 将菌体悬浮于1ml0.1mol/L Tris-HCl（pH=7.6）中转移至1.5ml的离心管中，1600g离心5min去上清液，收集菌体。重悬菌体于600μl0.1mol/L Tris-HCl（pH=8.5）中，加入30μl甲苯漩涡震荡30s，取其200μl的甲苯细胞做酶活测定（其余做蛋白测定）；在甲苯细胞中加入20μl0.5mol/L ACC短暂震荡后，30℃培养15min，之后加入1ml0.56mol/L HCl混合震荡室温（25℃）离心5min，收集上清液，得到ACC脱氨酶。空白对照为
600μl0.1mol/L Tris-HCl（pH=8.5）中加入30μl甲苯，再加入20μl0.5mol/L ACC短暂震荡后，30℃培养15min，之后加入1ml0.56mol/LHCl混合震荡室温（25℃）离心5min，收集上清液（对照）。

[0073] 2、ACC脱氨酶活性测定

[0074] 取上清液1ml与800μl0.56mol/L HCl混合，再加入300μl2,4-二硝基苯肼混合，将混合溶液30℃培养30min后，向其中加入2ml2mol/L NaOH使其终止反应。于540nm-1处测得吸光值。以1mL浓度为0、0.1、0.3、0.7、1和2μmol·L 的α-丁酮酸为标准液，加入800μl0.56mol/L HCl混合，再加入300μl2,4-二硝基苯肼混合，将混合溶液30℃培养
30min后，向其中加入2ml2mol/L NaOH使其终止反应，测540nm波长下吸光值，测定ACC标准曲线y=3.7396x-0.0385。以上清液（对照）为对照空白。

[0075] 蛋白含量测定采用考马斯亮蓝法测定311.53μg/ml上清液。

[0076] ACC脱氨酶的活性以在测酶体系中每毫克蛋白每小时形成α-丁酮酸（α-KA）的-1量表示，单位为μmolα-KA·(mgPr·h) 。酶活性测定均扣除样品对照空白后计算，重复3次。

[0077] 结果显示，MJM-5（Pseudomonas fluorescens）菌株产生的ACC脱氨酶有较高的-1活性，高达29.67μmolα-KA·(mgPr·h) 。

[0078] 实施例3、菌株MJM-5（Pseudomonas fluorescens）在制备IAA合成中的应用[0079] 1、制备IAA

[0080] DF培养基：KH2PO44.0g、Na2HPO46.0g、MgSO4·7H2O0.2g、FeSO4·7H2O0.1g、葡萄糖2.0g、葡萄糖酸2.0g、柠檬酸2.0g、(NH4)2SO42.0g、微量元素0.1mL、加入蒸馏水中溶解后，调整pH值至pH=7.5，定容至1000ml。微量元素配制同上。

[0081] 供试菌株MJM-5（Pseudomonas fluorescens）于DF培养基中28℃，180rpm培养-12天，再转接到添加不同浓度（0、50、100、200、500μgL-Trp·mL ）色氨酸（L-Trp）的新鲜的DF培养基中，28℃，180rpm培养2d，收集发酵产物。取样测得菌液的OD600值，然后将其余发酵产物（菌液）室温（25℃）下8000rpm离心10min，收集上清液，得到IAA。

[0082] 2、检测IAA含量

[0083] 取其500μl上清液加入2ml Salkowsk试剂，室温（25℃）培养20min后，于535nm处测得吸光值。用DF空白培养基相同处理作为对照调零。以不同浓度（0.01、0.05、0.25、-10.5mg·mL ）IAA标准液，相同处理测得标准曲线y=0.1729x-0.0098，进行计算。

[0084] 结果如图2所示，菌株MJM-5（Pseudomonas fluorescens）能产生吲哚乙酸，且合成吲哚乙酸量随着L-Trp浓度的增加而增加，具体在浓度为0、50、100、200、-1 -1500μgL-Trp·mL 中的吲哚乙酸量分别为0.93、3.56、5.78、9.49、17.64μg(ml·OD600) 。

[0085] 实施例4、菌株MJM-5（Pseudomonas fluorescens）在制备嗜铁素中的应用[0086] 1、嗜铁素合成的定性检测

[0087] 铬奥醇CAS平板培养基制备：

[0088] CAS蓝色染液：

[0089] 溶液A：将0.06g CAS溶于50mL去离子水中，再加入10mL1mmol·L-1的FeCl3溶液-1(含10mmol·L 的HCl)；

[0090] 溶液B：将0.073g的十六烷基三甲基溴化铵(Hexadecyl trimethyl ammonium bromide,HDTMA)溶于40mL去离子水中；

[0091] 将溶液A着烧杯壁缓缓加入到溶液B中，轻轻晃动混匀溶液A和溶液B，得到CAS蓝色染液。

[0092] 溶液a：15g KH2PO4、25gNaCl、50gNH4Cl溶于500ml去离子水；

[0093] 20%的葡萄糖溶液：20g葡萄糖溶于100ml去离子水；

[0094] 溶液c：25gNaOH溶于150ml去离子水；

[0095] 酸性酪蛋白水解物溶液：3g酸性酪蛋白水解物溶于27ml去离子水，应用滤膜过滤灭菌；

[0096] 量取100ml溶液a与750ml去离子水混合，向其中加入32.24gPIPES(哌嗪-1，4-二乙磺酸；PIPES在pH小于5以下不溶，应调节溶液酸碱度在缓慢加入PIPES，并不断搅拌，最终用溶液c将溶液调到pH=6.8)，加入细菌培养专用琼脂15g,120℃、15min灭菌。待溶液冷却到50℃左右加入30ml酸性酪蛋白水解物溶液，10ml20%的葡萄糖溶液，再缓慢加入100mlCAS蓝色染液，充分混匀，倒平板。

[0097] 按照Schwyn和Neilands的方法，将已分离保存的菌株MJM-5（Pseudomonas fluorescens）接于铬奥醇CAS(chrome azurol S)平板培养基上，28℃培养72h，观察菌落周围的颜色变化，结果如图3所示，有橘黄色圈产生，则该菌株可产生嗜铁素。

[0098] 2、嗜铁素合成定量分析

[0099] 1）制备嗜铁素

[0100] MKB培养基(1L)：酸解酪蛋白5g，甘油15mL，K2HPO42.5g，MgSO4·7H2O2.5g，pH7.2。121℃，20min灭菌。

[0101] 将菌株MJM-5（Pseudomonas fluorescens）接种于MKB培养基中，28℃摇床培养-1(180r·min )48h，收集发酵产物（菌液）；发酵产物1000rpm离心10min，取上清液，得到嗜铁素。

[0102] 2）检测嗜铁素

[0103] CAS检测液的制备

[0104] 1、将0.182g CTAB溶于50ml去离子水。

[0105] 2、将0.0054g FeCl·6H2O溶于20ml10mM HCl水溶液。

[0106] 3、将0.0605g铬天青S溶于50ml去离子水。

[0107] 4、将1.5ml步骤2得到的溶液与7.5ml步骤3得到的溶液混合，再与6ml步骤1得到的溶液混合，得到混合液。

[0108] 5、将4.307g PIPES用20-30ml去离子水溶解，加入6.25ml浓HCl，调pH为5.6。

[0109] 6、将全部步骤4得到的溶液和全部步骤5得到的溶液混合，并用去离子水定容至溶100ml。

[0110] 以1:1的体积比向上清液中加入CAS检测液，充分混匀。静止1h后，630nm处测吸光值(A)，去离子水与CAS检测液等体积混合测得的Ar为对照，A/Ar代表样品中嗜铁素的相对含量。该值越低，表明嗜铁素含量越高。

[0111] 结果MJM-5（Pseudomonas fluorescens）的A/Ar为1.52；表明MJM-5（Pseudomonas fluorescens）可以合成嗜铁素。

[0112] 实施例5、菌株MJM-5（Pseudomonas fluorescens）在盐碱胁迫下对植物促生的盆栽实验

[0113] 一、菌株MJM-5（Pseudomonas fluorescens）在盐碱胁迫下对苜蓿促生的盆栽实验

[0114] 本发明所用土样均取自黑龙江省大庆市采油厂附近盐碱土。采集样品时在每个区2
域内设置5个样方，样方面积为1×1m，收集表层土壤（0~20cm），土壤混合后，装入事先准备好的干净保鲜袋中，迅速将土样带回实验室，土壤经碾碎，混匀，风干后过筛保存。供试土壤的理化性质见表1。

[0115] 表1供试土壤理化性质

[0116]

[0117] 将由实施例1得到的荧光假单孢菌MJM-5（Pseudomonas fluorescens）在ADF固体培养基上活化，挑取单菌落于LB培养基中，于28℃，180rpm条件下振荡培养24h，用无菌10
水调菌液浓度为1×10 cfu/ml（悬液A），备用。

[0118] 将苜蓿种子（龙牧803苜蓿）预先用10%(V/V)次氯酸钠表面消毒10min后用无菌水洗涤三次。再于悬液A中浸泡1h处理（MJM-5），经无菌水浸泡处理1h的为对照（CK）。将悬液A处理后的种子和对照处理后的种子均匀播种于同一规格的花盆中。

[0119] 将悬液A处理后的种子定期取50ml菌悬液B均匀浇灌于小麦苗根部周围；菌悬液9
B为将制备好的菌悬液A调菌液浓度至1×10cfu/ml(菌悬液B)。对照用等量水浇灌。

[0120] 每盆20株，重复5次，室温培养。一周内测定发芽势，40天后测定株高、根长、地上植株干重、地下根系干重，统计结果如表2所示，盆栽效果如图4所示。

[0121] 表2菌株MJM-5（Pseudomonas fluorescens）对苜蓿促生作用的生物量测定[0122]

[0123] 由表可知，在根际促生菌MJM-5（Pseudomonas fluorescens）的作用下，苜蓿种子的发芽率提高了近23%，小麦植株的株高增高了近27%，根长增长了近44%，地上部分植株鲜重分别增加了35%、干重增加了近56%，而地下部分根系鲜重增加了近36%、干重增加了近1.7倍，综合各指标可见促生效果显著。

[0124] 二、菌株MJM-5（Pseudomonas fluorescens）在盐碱胁迫下对小麦促生的盆栽实验

[0125] 本实验土样同上述一。

[0126] 将由实施例1得到的荧光假单孢菌MJM-5（Pseudomonas fluorescens）在ADF固体培养基上活化，挑取MJM-5（Pseudomonas fluorescens）单菌落于LB培养基中，于28℃，180rpm条件下振荡培养24h，用无菌水调节菌液浓度为1×1010cfu/ml(菌悬液A)，备用。

[0127] 将小麦种子（中国春）预先用10%(V/V)次氯酸钠表面消毒10min后用无菌水洗涤三次，浸泡于菌悬液A中处理1h，经无菌水浸泡处理1h的为对照（CK）。将悬液A处理后的种子和对照处理后的种子均匀播种于同一规格的花盆中。

[0128] 将悬液A处理后的种子定期取50ml菌悬液B均匀浇灌于小麦苗根部周围；菌悬液B为将制备好的菌悬液A调菌液浓度至1×109cfu/ml(菌悬液B)。对照用等量水浇灌。每盆10株，重复5次，室温（25℃）培养。一周内测定发芽势，一个月后测定株高、根长、地上植株干重、地下根系干重。

[0129] 测定经MJM-5（Pseudomonas fluorescens）菌处理的小麦与对照相比，发芽率、株高、根长、鲜重、干重均有显著提高，统计结果如表3所示，盆栽效果如图5所示。

[0130] 表3为菌株MJM-5（Pseudomonas fluorescens）

[0131] 对小麦促生作用的生物量测定

[0132]

[0133] 由表可知，在根际促生菌MJM-5（Pseudomonas fluorescens）的作用下，小麦种子的发芽率提高了近17%，小麦植株的株高增高了近12%，根长增长了近43%，地上部分植株鲜重分别增加了近31%、干重增加了近48%，而地下部分根系鲜重增加了近4倍、干重增加了近81%，促生效果显著。MJM-5菌对小麦具有显著的促进生长作用。