一种羧酸酯酶的活性和羧酸酯酶抑制剂的活性的检测方法

摘要

一种羧酸酯酶的活性和羧酸酯酶抑制剂的活性的检测方法，属于生物技术领域。解决现有的酶活性检测方法灵敏度比较低、易出现假阳性信号、方法复杂、价格昂贵和耗时长的问题。该羧酸酯酶活性的检测方法是将底物分子和不同浓度羧酸酯酶反应，得到水解产物；将得到的水解产物、硝酸银溶液、聚阴离子溶液和带正电荷的小分子探针溶液混合，对羧酸酯酶的活性进行荧光检测。本发明还提供一种羧酸酯酶抑制剂的活性的检测方法。该方法具有更高的灵敏度，检测限为0.05mU/mL，比现有的某些检测方法低1或2个数量级，同时实验证明该方法具有很好的选择性、简便、成本低。

权利要求

1.一种羧酸酯酶的活性的检测方法，其特征在于，具体步骤如下：步骤一：将底物分子和不同浓度羧酸酯酶反应，得到水解产物；

步骤二：将步骤一得到的水解产物、重金属盐溶液、聚阴离子溶液和带正电荷的小分子探针溶液混合，对羧酸酯酶的活性进行荧光检测；

所述的底物分子为硫代乙酰胆碱；

所述的重金属盐为硝酸银或硝酸铜；

所述的聚阴离子为聚乙烯磺酸钠或单链DNA；

所述的带正电荷的小分子探针为3,4,9,10-四-(4-三甲基胺丁基氧-羰基)-苝，其结构式为：

2.根据权利要求1所述的一种羧酸酯酶的活性的检测方法，其特征在于，所述的羧酸酯酶为胆碱酯酶或脂肪酶。

3.根据权利要求1所述的一种羧酸酯酶的活性的检测方法，其特征在于，所述的步骤一中水解反应体系为：400μL总体系,包括浓度为6.875mMpH值为7.4的Tris-HAc缓冲溶液，浓度为0.06875mM底物分子，0-0.0004U/μL的羧酸酯酶，余量为无菌水。

4.根据权利要求1所述的一种羧酸酯酶的活性的检测方法，其特征在于，所述的步骤二中的检测体系为：550μL总体系,包括400μL水解反应体系，浓度为100μM重金属盐，浓度为60μM聚阴离子，浓度为100μM小分子探针，余量为无菌水。

5.根据权利要求1所述的一种羧酸酯酶的活性的检测方法，其特征在于，所述的荧光检测条件为：442nm荧光激发，460-650nm荧光检测。

6.一种羧酸酯酶抑制剂的活性的检测方法，其特征在于，具体步骤如下：步骤一：将不同浓度的羧酸酯酶抑制剂和羧酸酯酶混合，再和底物分子反应，得到水解产物；

步骤二：将步骤一得到的水解产物、重金属盐溶液、聚阴离子溶液和带正电荷的小分子探针溶液混合，对羧酸酯酶抑制剂的活性进行荧光检测；

所述的底物分子为硫代乙酰胆碱；

所述的重金属盐为硝酸银或硝酸铜；

所述的聚阴离子为聚乙烯磺酸钠或单链DNA；

所述的带正电荷的小分子探针为3,4,9,10-四-(4-三甲基胺丁基氧-羰基)-苝，其结构式为：

说明书

一种羧酸酯酶的活性和羧酸酯酶抑制剂的活性的检测方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种羧酸酯酶的活性和羧酸酯酶抑制剂的活性的检测方法。

背景技术

[0002] 配位聚合物（Coordination polymer）通常是指金属离子和有机配体通过自组装而形成的具有周期性网络结构的金属有机材料。例如，巯基配体-SR，氨基酸，氨基配体和金属离子M（M：Cu,Ag,Au等过度金属离子）可以通过有序自组装形成配位聚合物。结构通式如下：

[0003]

[0004] 目前，酶活性的检测方法主要有比色法，荧光法，电化学方法等多种方法。传统的比色方法测定酶活性，检测方便，用肉眼即能分辨，但是检测的灵敏度比较低，易出现假阳性信号，不利于酶活性的检测。以H2O2为介体的检测酶活性的化学发光法和荧光方法通常需要两个或更多的化学反应过程，或在检测过程中加入其他的酶，使得这些方法非常复杂，价格昂贵而且耗时长，灵敏度低。

[0005] 荧光检测酶活性是目前酶活性检测的普遍使用方法。但是对于这些方法而言都存在一定问题。例如，以共轭聚合物为基础的荧光共振能量转移法检测乙酰胆碱酯酶活性(Continuous Fluorometric Assays for Acetylcholinesterase Activity andInhibition with Conjugated Polyelectrolytes.Angew.Chem.Int.Ed.，2007,46,7882-7886)。该方法运用带猝灭基团dabcyl的乙酰胆碱酯酶底物。没有乙酰胆碱酯酶存在时，可以和共轭聚-合物PFP-SO3 通过静电相互作用，使共轭聚合物的荧光产生荧光共振能量转移荧光发生猝灭。加入乙酰胆碱酯酶后，ACh-dabcyl被水解，猝灭基团和胆碱底物分离，此时猝灭基团和-
PFP-SO3 带相同电荷，不发生荧光共振能量转移，所以荧光增强，从而定量检测乙酰胆碱酯酶的活性。这种方 法的检测限是0.05U/mL,灵敏度差，共轭聚合物的合成难度较高，而且需要额外标记猝灭基团，方法复杂，成本高。

发明内容

[0006] 本发明的目的是为了解决现有的酶活性检测方法灵敏度比较低、易出现假阳性信号、方法复杂、价格昂贵和耗时长的问题，而提供一种羧酸酯酶的活性和羧酸酯酶抑制剂的活性的检测方法。

[0007] 为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

[0008] 本发明提供一种羧酸酯酶的活性的检测方法，具体步骤如下：

[0009] 步骤一：将底物分子和不同浓度羧酸酯酶反应，得到水解产物；

[0010] 步骤二：将步骤一得到的水解产物、重金属盐溶液、聚阴离子溶液和带正电荷的小分子探针溶液混合，对羧酸酯酶的活性进行荧光检测。

[0011] 优选的是，所述的羧酸酯酶为胆碱酯酶或脂肪酶。

[0012] 优选的是，所述的底物分子为硫代乙酰胆碱。

[0013] 优选的是，所述的步骤一中水解反应体系为：400μL总体系,包括浓度为6.875mM pH值为7.4的Tris-HAc缓冲溶液，浓度为0.06875mM底物分子，0-0.0004U/μL的羧酸酯酶，余量为无菌水。

[0014] 优选的是，所述的聚阴离子为聚乙烯磺酸钠或单链DNA。

[0015] 优选的是，带正电荷的小分子探针为3,4,9,10-四-（4-三甲基胺丁基氧-羰基）-苝（3,4,9,10-tetra-(4-trimethylammoniobutyloxy-carbonyl)-perylene），其结构式为：

[0016]

[0017] 优选的是，所述的检测体系为：550μL总体系,包括400μL水解反应体系，浓度为100μM重金属盐，浓度为60μM聚阴离子，浓度为10μM小分子探针，余量为无菌水。

[0018] 优选的是，所述的重金属盐为硝酸银或硝酸铜。

[0019] 优选的是，所述的荧光检测条件为：442nm荧光激发，460-650nm荧光检测。

[0020] 本发明还提供一种羧酸酯酶抑制剂的活性的检测方法，具体步骤如下：

[0021] 步骤一：将不同浓度的羧酸酯酶抑制剂和羧酸酯酶混合，再和底物分子反应，得到水解产物；

[0022] 步骤二：将步骤一得到的水解产物、重金属盐溶液、聚阴离子溶液和带正电荷的小分子探针溶液混合，对羧酸酯酶抑制剂的活性进行荧光检测。

[0023] 优选的是，带正电荷的小分子探针为3,4,9,10-四-（4-三甲基胺丁基氧-羰基）-苝，其结构式为：

[0024]

[0025] 发明原理

[0026] 本发明提供一种羧酸酯酶的活性和羧酸酯酶抑制剂的活性的检测方法，选用的探针是带正电荷的小分子探针,能产生很强的荧光信号，加入聚阴离子后，通过静电相互作用和π-π相互作用诱导探针集聚，荧光发生猝灭；底物分子在羧酸酯酶作用下生成水解产物，该水解产物与硝酸银作用生成带正电的配位聚合物；该带正电荷的配位聚合物先与聚阴离子通过静电相互作用结合。此时，再加入荧光探针就不与聚阴离子发生作用而导致荧光猝灭。另外底物本身所带的正电荷对检测没有影响。羧酸酯酶的浓度越高，降解产生的水解产物越多，可以生成更多的带正电荷的配位聚合物，从而荧光恢复的程度也越强。因此，可以应用于检测羧酸酯酶的活性及其羧酸酯酶抑制剂的活性。

[0027] 有益效果

[0028] 本发明提供一种羧酸酯酶的活性的检测方法，该方法将底物分子和不同浓度羧酸酯酶反应，得到水解产物；将得到的水解产物、重金属盐溶液、聚阴离子溶液和带正电荷的小分子探针溶液混合，对羧酸酯酶的活性进行荧光检测。和现有技术中的荧光猝灭检测相比，本方法通过带正电荷的配位聚合物的形成， 运用聚阴离子为介体，选用荧光增强做为信号输出方式，避免了假阳性信号的生成，实验结果表明，该方法具有更高的灵敏度，检测限为0.05mU/mL，比现有的某些检测方法低1或2个数量级，同时实验证明该方法具有很好的选择性、简便、成本低。

[0029] 本发明还提供一种羧酸酯酶抑制剂的活性的检测方法，该方法将不同浓度的羧酸酯酶抑制剂和羧酸酯酶混合，再和底物分子反应，得到水解产物；将得到的水解产物、重金属盐溶液、聚阴离子溶液和带正电荷的小分子探针溶液混合，对羧酸酯酶抑制剂的活性进行荧光检测。该检测方法以羧酸酯酶水解产物能与金属离子形成配位聚合物的为基础，荧光增强间接检测酶抑制剂活性，该方法易于操作、简单、灵敏度高。

附图说明

[0030] 图1为本发明实施例1中3,4,9,10-四-（4-三甲基胺丁基氧-羰基）-苝的荧光强度随聚乙烯磺酸钠的浓度变化曲线图；

[0031] 图2为本发明实施例1荧光强度随乙酰胆碱酯酶浓度变化曲线图；

[0032] 图3为本发明实施例1乙酰胆碱酯酶的浓度与荧光强度的线性关系图；

[0033] 图4为本发明实施例4多奈哌齐浓度与抑制效率曲线图；

[0034] 图5为本发明实施例5中3-羟基呋喃丹与抑制效率曲线图。

具体实施方式

[0035] 本发明提供一种羧酸酯酶的活性的检测方法，具体步骤如下：

[0036] 步骤一：将底物分子和不同浓度的羧酸酯酶反应，得到水解产物；

[0037] 步骤二：将步骤一得到的水解产物、重金属盐溶液、聚阴离子溶液和带正电荷的小分子探针溶液混合，对羧酸酯酶的活性进行荧光检测。

[0038] 本发明所述的底物分子可选择天然底物结构极其相似的，以发挥其较高的水解活性，优选的是，所述的底物分子为硫代乙酰胆碱，硫代乙酰胆碱和乙酰胆碱酯酶的天然底物乙酰胆碱结构极其相似。

[0039] 优选的是，所述的羧酸酯酶为胆碱酯酶或脂肪酶。更优选的是，所述的羧酸酯酶为乙酰胆碱酯酶。

[0040] 本发明步骤一中的底物分子和羧酸酯酶优选在37°C反应1h，生成水解产物。优选的是，所述的步骤一中水解反应体系为：400μL总体系，包括浓度为6.875mM pH值为7.4的Tris-HAc缓冲溶液，浓度为0.06875mM底物分子，0-0.0004U/μL的羧酸酯酶，余量为无菌水。

[0041] 更优选的是，所述的检测体系为：400μL总体系，包括27.5μL 100mM pH值为7.4的Tris-HAc缓冲溶液，27.5μL 1mM底物分子溶液，2μL浓度为0-0.08U/μL的羧酸酯酶溶液，余量为无菌水。

[0042] 上述检测方法在步骤二之前，可以将不同浓度的聚阴离子溶液和带正电荷的小分子探针溶液混和，进行荧光检测，随着聚阴离子浓度的增大，荧光强度逐渐降低，目的是为了检测出荧光强度最低时，聚阴离子浓度的浓度。荧光检测的条件为442nm荧光激发，450－650nm荧光检测。

[0043] 本发明所述的重金属盐溶液和水解后的硫代胆碱形成带正电荷的配位聚合物，而聚阴离子溶液和带正电荷小分子探针溶液，通过静电相互作用和π-π相互作用诱导探针集聚，荧光发生猝灭，当将步骤一得到的水解产物、硝酸银溶液、聚阴离子溶液和带正电荷的小分子探针溶液混合时，该带正电荷的配位聚合物先与聚阴离子通过静电相互作用结合，荧光探针就不与聚阴离子发生作用而导致荧光猝灭。优选的是，所述的聚阴离子为聚乙烯磺酸钠或单链DNA，更优选为聚乙烯磺酸钠，所述的重金属盐溶液优选为硝酸银溶液或硝酸铜溶液。

[0044] 优选的是，所述的带正电荷的小分子探针为3,4,9,10-四-（4-三甲基胺丁基氧-羰基）-苝，其结构式为：

[0045]

[0046] 该探针带有四个正电荷，有极好的水溶性（>50mM）。可以和带负电荷的大分子如核酸，聚阴离子等诱导积聚，并利用相对应的分析手段的响应信号的改变，来检测和分析核酸分子和检测其它的目标分子，例如：蛋白质，生物小分子，或金属离子等，或检测某些生理过程，例如核酸酶的活性等。

[0047] 具体的制备方法为：

[0048] 步骤一：将苝酐溶于5％KOH水溶液中使其溶解，过滤，滤液用稀盐酸调节pH值至8～9，加入四正辛基溴化胺和1，4－二溴丁烷，在100℃回流反应2h，用氯仿进行萃取，分出的有机相用15％NaCl水溶液洗3次，蒸馏除去溶剂，得到的粗产物过层析柱纯化，得到化合物3,4,9,10-四-（4-溴丁基-酯基）-苝；所述的苝酐、四正辛基溴化胺和1，4－二溴丁烷的摩尔比为1：0.1：10；

[0049] 步骤二：将步骤一的得到的化合物3,4,9,10-四-（4-溴丁基-酯基）-苝溶于四氢呋喃与水的混合液中使其溶解，在混合溶液中加入三甲胺，在66℃回流72h，蒸馏除去溶剂，将得到的粗产物溶于水中，用氯仿萃取3次，水相蒸馏并真空干燥后得到产物3,4,9,10-四-（4-三甲基胺丁基氧-羰基）-苝。所述的3,4,9,10-四-（4-溴丁基-酯基）-苝与三甲胺的摩尔比为1：20，四氢呋喃与水的混合液中四氢呋喃和水是按体积比为
5：1混合的。

[0050] 合成路线如下：

[0051]

[0052] 本发明所述的检测体系优选为：550μL总体系，包括400μL水解反应体系，浓度为100μM重金属盐，浓度为60μM聚阴离子，浓度为10μM小分子探针，余量为无菌水。

[0053] 更优选为，550μL总体系,包括400μL水解反应体系，55μL浓度为1000μM重金属盐溶液，33μL浓度为1000μM聚阴离子溶液，55μL浓度为100μM小分子探针溶液,余量为无菌水。

[0054] 优选的是，所述的荧光检测条件为：442nm荧光激发，460-650nm荧光检测。

[0055] 本发明还提供一种羧酸酯酶抑制剂的活性的检测方法，具体步骤如下：

[0056] 步骤一：将不同浓度的羧酸酯酶抑制剂和羧酸酯酶混合，再和底物分子反应，得到水解产物；

[0057] 步骤二：将步骤一得到的水解产物、重金属盐溶液、聚阴离子溶液和带正电荷的小分子探针溶液混合，对羧酸酯酶抑制剂的活性进行荧光检测。

[0058] 本发明所述的底物分子可选择天然底物结构极其相似的，以发挥其较高的水解活性，优选的是，所述的底物分子为硫代乙酰胆碱，硫代乙酰胆碱和乙酰胆碱酯酶的天然底物乙酰胆碱结构极其相似。

[0059] 优选的是，所述的羧酸酯酶为胆碱酯酶或脂肪酶。

[0060] 本发明所述的羧酸酶抑制剂可根据酶的种类进行选择，没有特殊限制，包括多奈哌齐、3-羟基呋喃丹或3-己基-4-[(2S)-2-羟基十三烷基]-2-氧杂环丁酮N-甲酰基-L-亮氨酸酯，多奈哌齐和3-羟基呋喃丹为乙酰胆碱酯酶的抑制剂，3-己基-4-[(2S)-2-羟基十三烷基]-2-氧杂环丁酮N-甲酰基-L-亮氨酸酯为脂肪酶的抑制剂。

[0061] 本发明步骤一中的将不同浓度的羧酸酯酶抑制剂和羧酸酯酶混合优选在4°C放置15min，再和底物分子优选在37℃反应15min，生成水解产物。优选的是，所述的步骤一中水解反应体系为：400μL总体系,包括浓度为6.875mM pH值为7.4的Tris-HAc缓冲溶液，浓度为0.06875mM底物分子，浓度为0-0.2μM的羧酸酶抑制剂，0-0.0004U/μL的羧酸酯酶，余量为无菌水。

[0062] 更优选为，400μL总体系，包括27.5μL 100mM pH值为7.4的Tris-HAc缓冲溶液，27.5μL 1mM底物分子溶液，2μL浓度为0-40μM的酶抑制剂溶液，2μL浓度为0-0.08U/μL的羧酸酯酶溶液，余量为无菌水。

[0063] 本发明所述的重金属盐溶液溶液和水解后的硫代胆碱形成带正电荷的配位聚合物，而聚阴离子溶液和带正电荷小分子探针溶液，通过静电相互作用和π-π相互作用诱导探针集聚，荧光发生猝灭，当将步骤一得到的水解产物、硝酸银溶液、聚阴离子溶液和带正电荷的小分子探针溶液混合时，该带正电荷的配位聚合物先与聚阴离子通过静电相互作用结合，荧光探针就不与聚阴离子发生作用而导致荧光猝灭。优选的是，所述的聚阴离子为聚乙烯磺酸钠或单链DNA， 更优选为聚乙烯磺酸钠，所述的重金属盐溶液优选为硝酸银溶液或硝酸铜溶液。

[0064] 优选的是，所述的带正电荷的小分子探针为3,4,9,10-四-（4-三甲基胺丁基氧-羰基）-苝，其结构式为：

[0065]

[0066] 该探针带有四个正电荷，有极好的水溶性（>50mM）。制备方法同上述3,4,9,10-四-（4-三甲基胺丁基氧-羰基）-苝制备方法一致。

[0067] 优选的是，所述的550μL总体系,包括400μL水解反应体系，浓度为100μM重金属盐，浓度为60μM聚阴离子，浓度为10μM小分子探针，余量为无菌水。

[0068] 更优选的是，550μL总体系,包括400μL上述水解体系，55μL浓度为1000μM重金属盐溶液，33μL浓度为1000μM聚阴离子溶液，55μL浓度为100μM小分子探针溶液,余量为无菌水。

[0069] 优选的是，所述的荧光检测条件为：442nm荧光激发，460-650nm荧光检测。

[0070] 下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的描述。

[0071] 实施例1乙酰胆碱酯酶的检测

[0072] 1、将浓度为0μM、0.5μM,1μM,1.5μM,2μM、2.5μM、3μM、3.5μM、4μM、5μM、6μM和7μM的聚乙烯磺酸钠分别和1μM3,4,9,10-四-（4-三甲基胺丁基氧-羰基）-苝混合，在442nm荧光激发，460-650荧光检测条件下测定荧光光谱，如图1所示，
3,4,9,10-四-（4-三甲基胺丁基氧-羰基）-苝的荧光强度随聚乙烯磺酸钠的浓度逐渐降低，在聚乙烯磺酸钠浓度6μM时，猝灭效率达到99.9%；确定当3,4,9,10-四-（4-三甲基胺丁基氧-羰基）-苝与聚乙烯磺酸钠的浓度比例为1：6时，猝灭效率达到99.7%。固定两者比例，改变它们的浓度，得到最佳的在检测体系为550uL中，3,4,9,10-四-（4-三甲基胺丁基氧-羰基）-苝的浓度10μM,聚乙烯磺酸钠的浓度60μM。

[0073] 2、将68.75μM（水解体系中的浓度）硫代乙酰胆碱和浓度分别为0,0.1 mU/mL,2mU/mL,5mU/mL,10mU/mL,20mU/mL,40mU/mL,60mU/mL,80mU/mL,100mU/mL,120mU/mL,150mU/mL,200mU/mL,250mU/mL,300mU/mL的乙酰胆碱酯酶在37℃反应1h反应，得到水解产物硫代胆碱；

[0074] 所述的水解反应体系为：400μL体系,包括27.5μL 100mM的Tris-HAc缓冲液（pH7.4）,27.5μL 1mM硫代乙酰胆碱溶液，2μL浓度范围为0-0.06U/μL的乙酰胆碱酯酶溶液，余量为无菌水；

[0075] 3、将得到的水解产物浓度为50μM硫代胆碱（检测体系中的浓度）、浓度为100μM硝酸银溶液、浓度为60μM聚乙烯磺酸钠溶液和浓度为10μM3,4,9,10-四-（4-三甲基胺丁基氧-羰基）-苝溶液混合，在442nm荧光激发，460-650荧光检测条件下对乙酰胆碱酯酶进行活性检测。

[0076] 所述的检测体系优选为：550μL体系，55μL浓度为1mM硝酸银溶液，33μL浓度为1mM聚乙烯磺酸钠溶液，55μL浓度为100μM3,4,9,10-四-（4-三甲基胺丁基氧-羰基）-苝溶液,400μL水解反应体系，余量为无菌水。

[0077] 图2为乙酰胆碱酯酶活性的检测曲线，从图中可知可知，随着乙酰胆碱酯酶浓度升高，荧光强度逐渐增强，在乙酰胆碱酯酶浓度为100mU/mL时，荧光强度达到平衡，在0-10mU/mL浓度范围内，乙酰胆碱酯酶的浓度与荧光强度呈很好的线性关系，如图3所示，线性回归方程为IF=0.43C+1.07，其中IF为荧光强度，C是乙酰胆碱酯酶的浓度。实验表明，该方法的检测限为0.05mU/mL。

[0078] 实施例2脂肪酶的检测

[0079] 1、步骤1同实施例1中的步骤1；

[0080] 2、将68.75μM（水解体系中的浓度）硫代乙酰胆碱和浓度分别为0,5mU/mL,10mU/mL,20mU/mL,40mU/mL,60mU/mL,80mU/mL,100mU/mL,120mU/mL,150mU/mL,200mU/mL,250mU/mL,300mU/mL，400mU/mL的脂肪酶在37°C反应1h反应，得到水解产物硫代胆碱；

[0081] 所述的水解反应体系为：400μL体系,包括27.5μL 100mM的Tris-HAc缓冲液（pH7.4）,27.5μL 1mM硫代乙酰胆碱溶液，2μL浓度为0-0.08U/μL的脂肪酶溶液，余量为无菌水；

[0082] 3、将得到的水解产物浓度为50μM（检测体系中的浓度）硫代胆碱、浓度为100μM硝酸银溶液、浓度为60μM聚乙烯磺酸钠溶液和浓度为10μM3,4,9,10-四-（4-三甲基胺丁基氧-羰基）-苝溶液混合，在442nm荧光激发，460-650荧光检测条件下对脂肪酶进行活性检测。

[0083] 所述的检测体系优选为：550μL体系，55μL浓度为1mM硝酸银溶液，33μL浓度为1mM聚乙烯磺酸钠溶液，55μL浓度为100μM3,4,9,10-四-（4-三甲基胺丁基氧-羰基）-苝溶液,400μL水解反应体系，余量为无菌水。实验结果表明：随着脂肪酶浓度升高，荧光强度逐渐增强，在脂肪酶浓度为250mU/mL时，荧光强度达到平衡，在0-40mU/mL浓度范围内，乙酰胆碱酯酶的浓度与荧光强度呈很好的线性关系，实验表明，该方法的检测限为2mU/mL。

[0084] 实施例3

[0085] 1、步骤1同实施例1中的步骤1；

[0086] 2、将68.75μM（水解体系中的浓度）硫代乙酰胆碱和浓度分别为0,5mU/mL,10mU/mL,20mU/mL,40mU/mL,60mU/mL,80mU/mL,100mU/mL,120mU/mL,150mU/mL,200mU/mL,250mU/mL,300mU/mL，400mU/mL的乙酰胆碱酯酶在37°C反应1h反应，得到水解产物硫代胆碱；

[0087] 所述的水解反应体系为：400μL体系,包括27.5μL 100mM的Tris-HAc缓冲液（pH7.4）,27.5μL 1mM硫代乙酰胆碱溶液，2μL浓度为0-0.08U/μL的脂肪酶溶液，余量为无菌水；

[0088] 3、将得到的水解产物浓度为50μM（检测体系中的浓度）硫代胆碱、浓度为100μM硝酸铜溶液、浓度为60μM聚乙烯磺酸钠溶液和浓度为10μM3,4,9,10-四-（4-三甲基胺丁基氧-羰基）-苝溶液混合，在442nm荧光激发，460-650荧光检测条件下对脂肪酶进行活性检测。

[0089] 所述的检测体系优选为：550μL体系，55μL浓度为1mM硝酸铜溶液，33μL浓度为1mM聚乙烯磺酸钠溶液，55μL浓度为100μM3,4,9,10-四-（4-三甲基胺丁基氧-羰基）-苝溶液,400μL水解反应体系，余量为无菌水。

[0090] 实验结果表明：随着乙酰胆碱酯酶浓度升高，荧光强度逐渐增强，在乙酰胆碱 酯酶浓度为250mU/mL时，荧光强度达到平衡，在0-80mU/mL浓度范围内，乙酰胆碱酯酶的浓度与荧光强度呈很好的线性关系，实验表明，该方法的检测限为10mU/mL。

[0091] 实施例4羧酸酶抑制剂多奈哌齐检测

[0092] 1、将浓度分别为1nM,5nM，20nM，50nM，100nM多奈哌齐和0.1U/mL乙酰胆碱酯酶在4°C作用15min，再与68.75μM硫代乙酰胆碱在37°C反应15min反应，得到水解产物硫代胆碱；

[0093] 所述的水解反应体系为：400μL总体系，包括27.5μL100mM pH值为7.4的Tris-HAc缓冲溶液，27.5μL 1mM硫代乙酰胆碱溶液，2μL浓度为0.2-20μM的多奈哌齐溶液，2μL浓度为0.02U/μL的乙酰胆碱酯酶溶液，余量为无菌水。

[0094] 2、将得到的水解产物浓度为50μM（检测体系中的浓度）硫代胆碱、浓度为100μM硝酸银溶液、浓度为60μM聚乙烯磺酸钠溶液和浓度为10μM3,4,9,10-四-（4-三甲基胺丁基氧-羰基）-苝溶液混合，在442nm荧光激发，460-650荧光检测条件下对多奈哌齐进行活性检测。

[0095] 550μL总体系,包括400μL水解反应体系，55μL浓度为1mM硝酸银溶液，33μL浓度为1mM聚乙烯磺酸钠溶液，55μL浓度为100μM3,4,9,10-四-（4-三甲基胺丁基氧-羰基）-苝溶液,余量为无菌水。

[0096] 图4为多奈哌齐浓度与抑制效率曲线图，从图中可以看出，随之多奈哌齐浓度升高，乙酰胆碱酯酶被抑制的效率越高，即乙酰胆碱酯酶活性越来越低。

[0097] 实施例5羧酸酶抑制剂3-羟基呋喃丹检测

[0098] 1、先将抑制剂3-羟基呋喃丹用乙醇稀释，得到浓度分别为5nM，20nM，50nM，100nM,200nM的3-羟基呋喃丹，与0.1U/mL乙酰胆碱酯酶直接混合后，再与68.75μM硫代乙酰胆碱反应15min，得到水解产物硫代胆碱；

[0099] 所述的水解反应体系为：400μL总体系，包括27.5μL100mM pH值为7.4的Tris-HAc缓冲溶液，27.5μL 1mM硫代乙酰胆碱溶液，2μL浓度为1-40μM的3-羟基呋喃丹溶液，2μL浓度为0.02U/μL的乙酰胆碱酯酶溶液，余量为无菌水。

[0100] 2、将得到的水解产物浓度为50μM（检测体系中的浓度）硫代胆碱、浓度为100μM硝酸银溶液、浓度为60μM聚乙烯磺酸钠溶液和浓度为10μM3,4,9,10-四-（4-三甲基胺丁基氧-羰基）-苝溶液混合，在442nm荧光激发，460-650荧光检测条件下对3-羟基呋喃丹进行活性检测。

[0101] 550μL总体系,包括400μL水解反应体系，55μL浓度为1mM硝酸银溶液，33μL浓度为1mM聚乙烯磺酸钠溶液，55μL浓度为100μM3,4,9,10-四-（4-三甲基胺丁基氧-羰基）-苝溶液,余量为无菌水。

[0102] 图5为3-羟基呋喃丹浓度与抑制效率曲线图，从图中可以看出，随之3-羟基呋喃丹浓度升高，乙酰胆碱酯酶被抑制的效率越高，即乙酰胆碱酯酶活性越来越低。

[0103] 实施例6抑制剂3-己基-4-[(2S)-2-羟基十三烷基]-2-氧杂环丁酮N-甲酰基-L-亮氨酸酯的检测

[0104] 1、将浓度分别为5nM，20nM，50nM，100nM，200nM3-己基-4-[(2S)-2-羟基十三烷基]-2-氧杂环丁酮N-甲酰基-L-亮氨酸酯和0.15u/mL脂肪酶在4°C作用15min，再与68.75μM硫代乙酰胆碱在37°C反应15min反应，得到水解产物硫代胆碱；

[0105] 所述的水解反应体系为：400μL总体系，包括27.5μL 100mM pH值为7.4的Tris-HAc缓冲溶液，27.5μL 1mM硫代乙酰胆碱溶液，2μL浓度范围为1.5-40μM的3-己基-4-[(2S)-2-羟基十三烷基]-2-氧杂环丁酮N-甲酰基-L-亮氨酸酯溶液，2μL浓度为0.03U/μL的脂肪酶溶液，余量为无菌水。

[0106] 2、将得到的水解产物浓度为50μM（检测体系中的浓度）硫代胆碱、浓度为100μM硝酸银溶液、浓度为60μM聚乙烯磺酸钠溶液和浓度为10μM3,4,9,10-四-（4-三甲基胺丁基氧-羰基）-苝溶液混合，在442nm荧光激发，460-650荧光检测条件下对3-己基-4-[(2S)-2-羟基十三烷基]-2-氧杂环丁酮N-甲酰基-L-亮氨酸酯进行活性检测。

[0107] 550μL总体系,包括400μL水解反应体系，55μL浓度为1mM硝酸银溶液，33μL浓度为1mM聚乙烯磺酸钠溶液，55μL浓度为100μM3,4,9,10-四-（4- 三甲基胺丁基氧-羰基）-苝溶液,余量为无菌水。

[0108] 实验结果表明：随着3-己基-4-[(2S)-2-羟基十三烷基]-2-氧杂环丁酮N-甲酰基-L-亮氨酸酯浓度升高，脂肪酶被抑制的效率越高，即脂肪酶的活性越来越低。