一种用于生物化学发光检测的微流控芯片及其检测方法

摘要

本发明公开了一种用于生物化学发光检测的微流控芯片，芯片包括由上到下依次设置的接口层、透光层、沟道层、反光层和固定层，各层之间通过粘合剂上下连接并通过紧固件固定，接口层、透光层上分别设有进液孔和出液孔，接口层上还设有光纤接孔，沟道层上设有依次连通的进液流动通道、微混合器、检测池、废液缓冲池，光纤接孔设置在检测池的上方，光纤接孔的底部与透光层连接，检测池开设至沟道层的下表面，检测池的底部与反光层连接，废液缓冲池的底部与固定层连接。还公开了用上述微流控芯片进行检测的方法。该微流控芯片提高了检测溶液反应发光强度，提高了光检测效率；该微流控芯片制作方法简单，操作方便，检测速度快，检测灵敏度高，检测结果准确。

权利要求

1.一种用于生物化学发光检测的微流控芯片，其特征在于：所述的芯片包括由上到下依次设置的接口层（1）、透光层（2）、沟道层（3）、反光层（4）和固定层（5），所述的各层之间通过粘合剂上下连接并通过紧固件（6）固定，所述的接口层（1）、透光层（2）上分别设有进液孔（11）和出液孔（12），接口层（1）上还设有光纤接孔（13），所述的沟道层（3）上设有依次连通的进液流动通道（31）、微混合器（32）、检测池（33）、废液缓冲池（34），所述的进液流动通道（31）与进液孔（11）连通，废液缓冲池（34）与出液孔（12）连通，所述的光纤接孔（13）设置在检测池（33）的上方，光纤接孔（13）的底部与透光层（2）连接，检测池（33）的上部与透光层（2）的下表面相接，检测池（33）的底部与反光层（4）连接，所述的废液缓冲池（34）的底部与固定层（5）连接，所述的微混合器（32）呈折线形沟道、方形内设交叉线形沟道或矩形内设并排沟道形结构，微混合器（32）沟道的宽度和深度分别为0.45mm～1.05mm，所述的检测池（33）呈圆孔形，检测池（33）的孔径d与沟道层厚度h、光纤芯径∅及数值孔径α满足： ，所述的检测池（33）的容积小于废液缓冲池（34）的容积。

2.根据权利要求1所述的一种用于生物化学发光检测的微流控芯片，其特征在于：所述的接口层（1）上设有若干个进液孔（11），所述的进液孔（11）的孔径为0.8mm～2.2mm，接口层（1）上设置的出液孔（12）的孔径为1.2mm～2.8mm，所述的光纤接孔（13）的孔径为1 mm～5.5mm。

3.根据权利要求1或2所述的一种用于生物化学发光检测的微流控芯片，其特征在

于：沟道层（3）上设有与接口层（1）上进液孔（11）数目一致的进液流动通道（31），每个进液流动通道（31）分别与微混合器（32）连通，所述的进液流动通道（31）的宽度为1.2mm～

2.8mm，深度为1.2mm～2.2mm。

4.根据权利要求1或2所述的一种用于生物化学发光检测的微流控芯片，其特征在于：

接口层（1）的厚度为3.4mm～4.6mm，透光层（2）的厚度为0.25mm～0.45mm，沟道层（3）的厚度为2.4mm～3.6mm，反光层（4）的厚度为0.7mm～1.6mm，固定层（5）的厚度为1.8mm～

4.2mm。

5.一种用权利要求1所述的用于生物化学发光检测的微流控芯片的检测方法，其特征在于：所述的检测方法为以下步骤，

1）将用于生物化学发光检测的微流控芯片接口层（1）上的进液孔（11）通过进液流路管与蠕动泵连接，出液孔（12）与出液流路管连接，检测光纤一端插入光纤接孔（13），另一端连接至光子计数器，将光子计数器连接至计算机上；蠕动泵的数目与进液孔的数目一致；

2）洗清流路，依次用0.1～1mol/L的碱溶液， 0.1～1mol/L酸溶液， 0.1～1mol/L的碱溶液，以1uL/s～10uL/s的流速冲洗微流控芯片的液体流路通道和溶液池，再用超纯水，以1uL/s～10uL/s的流速冲洗微流控芯片的液体流路通道和溶液池；

3）以0.1uL/s～3uL/s的流速向进液流动通道（31）内分别通入15uL～100uL荧光素酶发光检测液和15uL～100uL 含ATP的待测样品液，即可测得生物发光反应的光子计数响应曲线。

6.根据权利要求5所述的一种用于生物化学发光检测的微流控芯片的检测方法，其特征在于：步骤1）中进液孔（11）与进液流路管、出液孔（12）与出液流路管、检测光纤与光纤接孔（13）分别使用粘合剂固化，粘合剂选自乙烯-醋酸乙烯热熔胶。

说明书

一种用于生物化学发光检测的微流控芯片及其检测方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生化检测领域，具体地说涉及一种用于生物化学发光检测的微流控芯片及其检测方法。

背景技术

[0002] 目前，在化学和生命科学的研究中，荧光(Fluorescence)和化学发光是应用最为广泛的高灵敏度定量检测方法之一。由于荧光基团的光子能量吸收效率高，分子中的受激荧光基团可以释放大量的光能，产生较高强度的光信号，因而，对样品的预处理简单，检测方便。但是，由于受激样品本身含有复杂的背景荧光基团，会产生非特异的激发荧光，激发光源复杂的光谱会干扰荧光的光探测器检测，因而，需要有各种滤光装置才能保证样品测量的质量。不同于荧光，生物化学发光是一种特异性生化反应促发的自发光，不需要外部光源的激发，因而，具有背景噪声小、响应迅速和检测阈值低等优点。化学发光 (Chemiluminescence)是它主要是依据待测物与具有特异性试剂混合产生发光物而表明待测物的存在和浓度，生物发光（bioluminescence）则是依靠存在于萤火虫和发光细菌等生物体内的酶，催化特异性化学反应产生的能量发光而表明待测物的存在和浓度。生物化学发光检测正是利用了上述反应体系中待测物浓度与发光强度在一定条件下呈定量关系的特性，通过检测体系发光强度确定待测物含量。这已经成为较常用的高灵敏度生物化学分析方法。

[0003] 近20年发展起来的微流控技术，以其集成化、微量化、分析速度快、准确度高等优势，被广泛应用于生化检测、医学研究、环境监测等领域。微流控芯片可在一片芯片上完成进样、混合、反应、检测等多个溶液操控步骤，也可以在一片芯片上实现多个液体流路通道的立体结构，进行多个样品的高通量检测。将微流控芯片技术与生物化学发光检测技术相结合，解决多种试剂的传导、混合等步骤的一体化操控建立发光体系；将微流控芯片技术与光电检测技术相结合，利用光电二极管、光电耦合器（CCD）、光电倍增管等检测器件实现稳定和高灵敏度原位光电检测，以期在保证检测灵敏度的前提下，提高生物化学发光检测的通用性和便捷性，减少试剂消耗和提高检测速度，是目前微流控芯片技术的重要研究和技术开发方向。

[0004] 目前，文献报道的与发光检测有关的微流控芯片存在着以下一些缺点：1、依赖显微镜平台或透镜和滤光片组成的复杂光路：如申请号为200910114403.8的中国专利公开的微流控芯片化学发光测定人单个血红细胞内物质的方法和申请号为201110153526.X的中国专利公开的生物芯片荧光微光谱检测装置及制作方法；2、流路结构单一，进样未经充分混合从而导致反应效率较低，无法达到最大发光强度：如申请号为200910154432.7的中国专利公开的毛细管电泳分离和化学发光检测的微流控芯片；3、发光区域全透明，不同方向的散射光没有被充分利用，光检测效率低。

发明内容

[0005] 本发明的目的是为了解决目前与发光检测有关的微流控芯片存在的上述三个技术问题而提供一种用于生物化学发光检测的微流控芯片，本发明的微流控芯片通过改善溶液混合程度提高生物化学反应发光强度，改善光学设计提高光检测效率，从而提高生物化学发光检测的操作便捷性和检测灵敏度。

[0006] 本发明的另一个目的是提供一种用于生物化学发光检测的微流控芯片的检测方法，该检测方法操作简单、响应速度快，检测灵敏度高。

[0007] 本发明实现其第一个技术目的所采用的技术方案是：一种用于生物化学发光检测的微流控芯片，所述的芯片包括由上到下依次设置的接口层、透光层、沟道层、反光层和固定层，所述的各层之间通过粘合剂上下连接并通过紧固件固定，所述的接口层、透光层上分别设有进液孔和出液孔，接口层上还设有光纤接孔，所述的沟道层上设有依次连通的进液流动通道、微混合器、检测池、废液缓冲池，所述的进液流动通道与进液孔连通，废液缓冲池与出液孔连通，所述的光纤接孔设置在检测池的上方，光纤接孔的底部与透光层连接，检测池开设至沟道层的下表面，检测池的底部与反光层连接，所述的废液缓冲池的底部与固定层连接。该微流控芯片通过依次设置接口层、透光层、沟道层、反光层和固定层，并在芯片上设置进液孔、进液流动通道，微混合器，检测池，废液缓冲区，出液孔，光纤接孔，上述结构使得进样从进液孔进入进液流动通道，然后通过微混合器后被充分混合，混合后的进样反应速率大大提高。光纤接孔设置在检测池的上方，光纤接孔与检测池之间隔有透光层，检测池与沟道层的下表面贯通，检测池的底部与反光层连接，透光层设置在光纤接孔与检测池之间可以避免光纤与溶液直接接触引起的光纤和溶液污染以及流路不平滑，同时又保证检测池与光纤之间的良好透光性。进液孔和出液孔用于插入进液细管和出液细管，对着检测池处的光纤接孔，用于插入光纤。该微流控芯片不需要依赖由显微镜平台或透镜和滤光片组成的复杂光路，不需要外部激发光源，不需要施加外部高压电场驱动流路，采用微混合器，设计特定的流路结构，溶液经进样和混合器流通通道后，就能够达到最大发光强度。发光区域采用反光结构，射向光纤接孔以外不同方向的散射光也能够被充分利用，提高了光检测效率。

[0008] 1.作为优选，所述的接口层上设有若干个进液孔，所述的进液孔的孔径为0.8mm～2.2mm，接口层上设置的出液孔的孔径为1.2mm～2.8mm。进液孔的数量根据需要可以设置为多个，以满足不同检测目的的需要。进液孔径和与之连接的进液流路管的尺寸适配，出液孔径与出液流路管的尺寸适配, 光纤接孔的孔径为1 mm～5.5mm。

[0009] 作为优选，沟道层上设有与接口层上进液孔数目一致的进液流动通道，每个进液流动通道分别与微混合器连通，所述的进液流动通道的宽度为1.2mm～2.8mm，深度为1.2mm～2.2mm。在沟道层上设置有与接口层上进液孔数目一致的进液流动通道，这样的结构使得多个通道上的不同进样在微混合器中得到充分混合，从而提高反应速度。

[0010] 作为优选，所述的微混合器呈折线形沟道、方形内设交叉线形沟道或矩形内设并排沟道形结构，微混合器沟道的宽度和深度分别为0.45mm～1.05mm。微混合器呈折线形沟道、方形内设交叉线形沟道或矩形内设并排沟道形结构，可使两种溶液在快速通过的同时发生充分混合。当然微混合器还可以采用S形等其他结构，只要能够满足本技术方案的目的都在本方案的保护范围之内。

[0011] 作为优选，所述的检测池呈圆孔形，检测池的孔径(d)与沟道层厚度(h)、光纤芯径(∅)及数值孔径(α)满足： ，所述的检测池的容积小于废液缓冲池的容积。为保证检测池发出的光充分耦合进光纤，检测池底部是反光层，检测池的直径(d)应与沟道层厚度(h)、光线芯径(∅)及数值孔径(α)相匹配，满足： ，所述
的数值孔径(α)是由光纤材料和光纤芯径决定的。检测池前端连接废液缓冲池,检测池的容积小于废液缓冲池容积，是为了防止废液倒流入检测池而影响检测效果。

[0012] 作为优选，接口层的厚度为3.4mm～4.6mm，透光层的厚度为0.25mm～0.45mm，沟道层的厚度为2.4mm～3.6mm，反光层的厚度为0.7mm～1.6mm，固定层的厚度为1.8mm～4.2mm。接口层的厚度优选为3.4mm～4.6mm，一是可以选用厚度3.4mm～4.6mm的聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）材质基片作为接口层，选材方便，二是这样的结构使得进液孔、出液孔以及光纤接孔的深度设置为最佳，方便进样的流入和流出，以及光纤插入后连接长度达到最佳。透光层的厚度优选为0.25mm～0.45mm，可以选用厚度0.25mm～0.45mm的聚对苯二甲酸乙二酯（PET）薄膜作为透光层，在接口层与沟道层中间设置0.25mm～0.45mm的透光层可以避免光纤与溶液直接接触引起的光纤和溶液污染以及流路不平滑，同时又保证检测池与光纤之间的良好透光性。沟道层的厚度优选为2.4mm～3.6mm，可以采用厚度2.4mm～
3.6mm的PMMA材质基片作为沟道层，这样可以在沟道层上设置适合宽度和深度的依次连通的进液流动通道、微混合器、检测池、废液缓冲池，各通道宽度和深度分别设置为1.2mm～
2.2mm，目的是维持一个合适的流路阻力，保证进液在蠕动泵驱动下通畅运行，同时溶液在通道中不会滞留过久；进液流动通道长度为5mm～10mm,前端连接微混合器。反光层的厚度优选为0.7mm～1.6mm，选用0.7mm～1.6mm的镜面作为反光层，由于生物化学发光是无定向的，镜面可以将很大一部分散射光反射到光纤端口，提高了光检测效率。固定层厚度优选为1.8mm～4.2mm，这样可以选用厚度为1.8mm～4.2mm的 PMMA材质基片作为固定层，设置在反光层下面，用来加固芯片。

[0013] 本发明实现其第二个发明目的所采用的技术方案是：一种用于生物化学发光检测的微流控芯片的检测方法，所述的检测方法为以下步骤，

[0014] 1）将用于生物化学发光检测的微流控芯片接口层上的进液孔通过进液流路管与蠕动泵连接，出液孔与出液流路管连接、检测光纤一端插入光纤接孔，另一端连接至光子计数器，将光子计数器连接至计算机上；蠕动泵的数目与进液孔的数目一致；

[0015] 2）洗清流路，依次用0.1～1mol/L的碱溶液， 0.1～1mol/L酸溶液， 0.1～1mol/L的碱溶液，以1uL/s～10uL/s的流速冲洗微流控芯片的液体流路通道和溶液池，再用超纯水，以1uL/s～10uL/s的流速冲洗微流控芯片的液体流路通道和溶液池；

[0016] 3）以0.1uL/s～3uL/s的流速在进液流动通道内分别通入15uL～100uL荧光素酶发光检测液和15uL～100uL含ATP的待测样品液，即可测得生物发光反应的光子计数响应曲线。

[0017] 作为优选，步骤1）中进液孔与进液流路管、出液孔与出液流路管连接、检测光纤与光纤接孔分别使用粘合剂固化，粘合剂选自乙烯-醋酸乙烯热熔胶。

[0018] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：

[0019] （1）检测溶液经微混合器发生快速而充分的混合，提高了反应发光强度；

[0020] （2）发光检测池下方的反光层镜面可以减少散射光损失，提高了光检测效率；

[0021] （3）发光检测池尺寸根据光纤芯径和数值孔径优化设计，达到较优的光耦合效率，同时免去了复杂的透镜等光路装置；

[0022] （4）该微流控芯片制作方法简单，操作方便，检测速度快，检测灵敏度高。

附图说明

[0023] 图1为本发明用于生物化学发光检测的微流控芯片的一种结构示意图；

[0024] 图2为图1的A-A剖面示意图；

[0025] 图3为实施例的测试结果的光子计数相应曲线图；

[0026] 图4是本发明用于生物化学发光检测的微流控芯片的另一种结构示意图；

[0027] 图5是本发明用于生物化学发光检测的微流控芯片的第三种结构示意图；

[0028] 图中：1、接口层，11、进液孔，12、出液孔，13、光纤接孔，2、透光层，3、沟道层，31、进液流动通道，32、微混合器，33、检测池，34、废液缓冲池，4、反光层，5、固定层， 6、紧固件。

具体实施方式

[0029] 下面通过具体实施例并结合附图对本发明的技术方案作进一步具体说明，实施例中所需原料均可市购或采用公知方法合成。

[0030] 实施例1：

[0031] 在图1所示的实施例中，一种用于生物化学发光检测的微流控芯片，芯片包括由上到下依次设置的接口层1、透光层2、沟道层3、反光层4和固定层5，各层之间通过粘合剂上下粘接在一起并通过四套紧固件6固定，接口层1为PMMA材质基片，接口层1的厚度为4mm，接口层1上设置有2个直径1.5mm的进液孔11、一个直径2mm的出液孔12、一个直径
2.25mm的光纤接孔13，沟道层3采用厚度3mm的PMMA材质基片，沟道层3上设有依次连通的两条进液流动通道31、一个微混合器32、一个检测池33、一个废液缓冲池34，各通道宽度为2mm，深度1.5mm；进液流动通道31的长度为5mm，前端连接微混合器32；微混合器32为折线形，单折长度为10mm，沟道宽度为0.5mm，深度为0.6mm，沟道间距为1mm，微混合器32前端连接检测池33，微混合器32和检测池33之间连接长度为1.5mm；检测池33为直径4mm的圆孔（孔径d根据公式 计算得到，本实施例中沟道层厚度3mm，所选用
的光纤芯径为1mm及数值孔径为0.37），底部是反光层4，反光层4采用厚度为1mm, 长宽尺寸为24mmx24mm的镜面, 检测池33的前端连接废液缓冲池34 ,连接长度为2mm；废液缓冲池34的直径为6mm，深度为2.7mm。

[0032] 进液流动通道31与进液孔11连通，废液缓冲池34与出液孔12连通，光纤接孔13设置在检测池33的上方，光纤接孔13的底部与透光层2连接，检测池33开设至沟道层3的下表面，检测池33的底部与反光层4连接，废液缓冲池34的底部与固定层5连接。固定层5为2mm的PMMA材质基片，长宽尺寸为50mm×50mm，在四角位置有直径5mm的紧固孔。紧固件6将接口层1、透光层2、沟道层3、反光层4和固定层5紧固成一体，构成微流控芯片（见图2）。

[0033] 一种用于生物化学发光检测的微流控芯片的制作方法为以下步骤，

[0034] 1）使用激光打标机在接口层1上刻出进液孔11、出液孔12、光纤接孔13，在透光层2上刻出进液孔11、出液孔12，在沟道层3上刻出进液流动通道31、微混合器32、检测池33、废液缓冲池34，在接口层1、透光层2、沟道层3和固定层5上分别刻出紧固孔；微混合器32沟道的宽度和深度分别为0.5mm，所述的检测池33呈圆孔形，检测池33的孔径(d)与沟道层厚度(h)、光纤芯径(∅)及数值孔径(α)满足： ，所述的数值孔
径(α)是由光纤材料和光纤芯径决定的，光纤芯径为1mm，数值孔径为0.37，所述的检测池
33的容积小于与废液缓冲池34的容积；

[0035] 2）粘合剂的制备：由聚二甲基硅氧烷单体（PDMS）与固化剂按照体积比为10:1混合制成，静置到气泡消失为止，PDMS及固化剂为市购产品；PDMS可选用Dow Corning的Sylgard 184 silicone elastomer base，固化剂可选用Dow Corning的Sylgard 184 silicone elastomer curing agent。

[0036] 3）使用步骤2中制备的粘合剂涂覆各层之间的接触面，并将接口层1、透光层2、沟道层3、发光层4和固定层5由上到下叠放，在四角位置用紧固件6紧固，然后置于70～90℃烘箱中固化60～120分钟（本实施例中置于80℃烘箱中固化120分钟）制成用于生物化学发光检测的微流控芯片。

[0037] 一种用于生物化学发光检测的微流控芯片的检测方法，所述的检测方法为以下步骤，

[0038] 1）将用于生物化学发光检测的微流控芯片接口层1上的两个进液孔11通过两根进液流路管与两台蠕动泵（型号LongerPump BT100-2J）连接，出液孔12与一根出液流路管连接、一根芯径1000um、数值孔径0.37的检测光纤，检测光纤一端插入光纤接孔13，另一端连接至光子计数器(IDQ id100-MMF50-ULN)，将光子计数器连接至计算机上；进液孔11与进液流路管、出液孔12与出液流路管连接、检测光纤与光纤接孔13分别使用粘合剂固化，粘合剂选自乙烯-醋酸乙烯热熔胶；

[0039] 2）洗清流路，依次用1000uL 0.5mol/L NaOH溶液，1000uL 0.5mol/L HCl溶液，1000uL 0.5mol/L NaOH溶液，以1uL/s的流速通过微流控芯片，再用3000ul超纯水，以1uL/s的流速通过微流控芯片，清洗流路；

[0040] 3）以1uL/s的流速在两个进液流动通道11分别通入60uL荧光素酶发光检测液和60uL ATP样品液，即可测得生物发光反应的光子计数响应曲线(图3-1)。

[0041] 实施例2：

[0042] 在图4所示的实施例中，一种用于生物化学发光检测的微流控芯片，芯片包括由上到下依次设置的接口层1、透光层2、沟道层3、反光层4和固定层5，各层之间通过粘合剂上下粘接在一起并通过四套紧固件6固定，接口层1为PMMA材质基片，接口层1的厚度为3.5mm，接口层1上设置有3个直径1mm的进液孔11、一个直径1.5mm的出液孔12、一个直径1.5mm的光纤接孔13，沟道层3采用厚度2.5mm的PMMA材质基片，沟道层3上设有依次连通的3条进液流动通道31、一个微混合器32、一个检测池33、一个废液缓冲池34，各通道宽度为1mm，深度1mm；进液流动通道31的长度为7.5mm，前端连接微混合器32；微混合器
32为方形内设交叉线形沟道，交叉沟道单条长度为10mm，沟道宽度为1mm，深度为0.5mm，微混合器32前端连接检测池33，微混合器32和检测池33之间连接长度为0.5mm；检测池33为直径3mm的圆孔（本实施例中所选用的光纤芯径为0.8mm及数值孔径为0.37），底部是反光层4，反光层4采用厚度为0.8mm, 长宽尺寸为24mmx24mm，的镜面, 检测池33的前端连接废液缓冲池34 ,连接长度为2mm；废液缓冲池34的直径为5mm，深度为2.5mm。

[0043] 进液流动通道31与进液孔11连通，废液缓冲池34与出液孔12连通，光纤接孔13设置在检测池33的上方，光纤接孔13的底部与透光层2连接，检测池33开设至沟道层3的下表面，检测池33的底部与反光层4连接，废液缓冲池34的底部与固定层5连接。固定层5为3mm的PMMA材质基片，长宽尺寸为50mm×50mm，在四角位置有直径5mm的紧固孔。紧固件6将接口层1、透光层2、沟道层3、反光层4和固定层5紧固成一体，构成微流控芯片。

[0044] 一种用于生物化学发光检测的微流控芯片的制作方法为以下步骤，

[0045] 1）使用激光打标机在接口层1上刻出进液孔11、出液孔12、光纤接孔13，在透光层2上刻出进液孔11、出液孔12，在沟道层3上刻出进液流动通道31、微混合器32、检测池33、废液缓冲池34，在接口层1、透光层2、沟道层3和固定层5上分别刻出紧固孔；微混合器
32沟道的宽度和深度分别为0.8mm，所述的检测池33呈圆孔形，检测池33的孔径(d)与沟道层厚度(h)、光纤芯径(∅)及数值孔径(α)满足： ，所述的数值孔径
(α)是由光纤材料和光纤芯径决定的，光纤芯径可取0.8mm，数值孔径可取0.37，所述的检测池33的容积小于与废液缓冲池34的容积；

[0046] 2）粘合剂的制备：由聚二甲基硅氧烷单体（PDMS）与固化剂按照体积比为3:1混合制成，静置到气泡消失为止，PDMS及固化剂为市购产品；PDMS可选用Dow Corning的Sylgard 184 silicone elastomer base，固化剂可选用Dow Corning的Sylgard 184 silicone elastomer curing agent。

[0047] 3）使用步骤2中制备的粘合剂涂覆各层之间的接触面，并将接口层1、透光层2、沟道层3、发光层4和固定层5由上到下叠放，在四角位置用紧固件6紧固，然后置于70℃烘箱中固化60分钟制成用于生物化学发光检测的微流控芯片。

[0048] 一种用于生物化学发光检测的微流控芯片的检测方法，所述的检测方法为以下步骤，

[0049] 1）将用于生物化学发光检测的微流控芯片接口层1上的三个进液孔11通过三根进液流路管与三台蠕动泵（型号LongerPump BT100-2J）连接，出液孔12与一根出液流路管连接、一根芯径1000um、数值孔径0.37的检测光纤，检测光纤一端插入光纤接孔13，另一端连接至光子计数器(IDQ id100-MMF50-ULN)，将光子计数器连接至计算机上；进液孔11与进液流路管、出液孔12与出液流路管连接、检测光纤与光纤接孔13分别使用粘合剂固化，粘合剂选自乙烯-醋酸乙烯热熔胶；

[0050] 2）洗清流路，依次用1000uL 0.1mol/L KOH溶液，1000uL 0.1mol/L H2SO4溶液，1000uL 0.1mol/L KOH溶液，以5uL/s的流速冲洗微流控芯片的液体流路通道和溶液池，再用3000ul超纯水，以10uL/s的流速冲洗微流控芯片的液体流路通道和溶液池；

[0051] 3）以0.1uL/s的流速向两个进液流动通道11分别通入15uL荧光素酶发光检测液和15uL ATP样品液，即可测得生物发光反应的光子计数响应曲线。

[0052] 实施例3：

[0053] 在图5实施例中，一种用于生物化学发光检测的微流控芯片，芯片包括由上到下依次设置的接口层1、透光层2、沟道层3、反光层4和固定层5，各层之间通过粘合剂上下粘接在一起并通过四套紧固件6固定，接口层1为PMMA材质基片，接口层1的厚度为4.5mm，接口层1上设置有4个直径2mm的进液孔11、一个直径2.5mm的出液孔12、一个直径5mm的光纤接孔13，沟道层3采用厚度3.5mm的PMMA材质基片，沟道层3上设有依次连通的4条进液流动通道31、一个微混合器32、一个检测池33、一个废液缓冲池34，各通道宽度为1.5mm，深度2mm；进液流动通道31的长度为10mm，前端连接微混合器32；微混合器32为矩形内设并排沟道形结构，并排沟道单条长度为10mm，沟道宽度为0.8mm，深度为1mm，沟道间距为1mm，微混合器32前端连接检测池33，微混合器32和检测池33之间连接长度为2mm；
检测池33为直径5.5mm的圆孔，（本实施例中所选用的光纤芯径为1mm及数值孔径为0.5），底部是反光层4，反光层4采用厚度为1.5mm, 长宽尺寸为24mm*24mm的镜面, 检测池33的前端连接废液缓冲池34 ,连接长度为2mm；废液缓冲池34的直径为6.5mm，深度为3mm。

[0054] 进液流动通道31与进液孔11连通，废液缓冲池34与出液孔12连通，光纤接孔13设置在检测池33的上方，光纤接孔13的底部与透光层2连接，检测池33开设至沟道层3的下表面，检测池33的底部与反光层4连接，废液缓冲池34的底部与固定层5连接。固定层5为4mm的PMMA材质基片，长宽尺寸为50mm×50mm，在四角位置有直径5mm的紧固孔。紧固件6将接口层1、透光层2、沟道层3、反光层4和固定层5紧固成一体，构成微流控芯片。

[0055] 一种用于生物化学发光检测的微流控芯片的制作方法为以下步骤，

[0056] 1）使用激光打标机在接口层1上刻出进液孔11、出液孔12、光纤接孔13，在透光层2上刻出进液孔11、出液孔12，在沟道层3上刻出进液流动通道31、微混合器32、检测池33、废液缓冲池34，在接口层1、透光层2、沟道层3和固定层5上分别刻出紧固孔；微混合器32沟道的宽度和深度分别为1mm，所述的检测池33呈圆孔形，检测池33的孔径(d)与沟道层厚度(h)、光纤芯径(∅)及数值孔径(α)满足： ，所述的数值孔
径(α)是由光纤材料和光纤芯径决定的，光纤芯径可取1mm，数值孔径可取0.5，所述的检测池33的容积小于与废液缓冲池34的容积；

[0057] 2）粘合剂的制备：由聚二甲基硅氧烷单体（PDMS）与固化剂按照体积比为20:1混合制成，静置到气泡消失为止，PDMS及固化剂为市购产品；PDMS可选用Dow Corning的Sylgard 184 silicone elastomer base，固化剂可选用Dow Corning的Sylgard 184 silicone elastomer curing agent。

[0058] 3）使用步骤2中制备的粘合剂涂覆各层之间的接触面，并将接口层1、透光层2、沟道层3、发光层4和固定层5由上到下叠放，在四角位置用紧固件6紧固，然后置于90℃烘箱中固化100分钟制成用于生物化学发光检测的微流控芯片。

[0059] 一种用于生物化学发光检测的微流控芯片的检测方法，所述的检测方法为以下步骤，

[0060] 1）将用于生物化学发光检测的微流控芯片接口层1上的四个进液孔11通过四根进液流路管与四台蠕动泵（型号LongerPump BT100-2J）连接，出液孔12与一根出液流路管连接、一根芯径1000um、数值孔径0.5的检测光纤，检测光纤一端插入光纤接孔13，另一端连接至光子计数器(IDQ id100-MMF50-ULN)，将光子计数器连接至计算机上；进液孔11与进液流路管、出液孔12与出液流路管连接、检测光纤与光纤接孔13分别使用粘合剂固化，粘合剂选自乙烯-醋酸乙烯热熔胶；

[0061] 2） 洗清流路，依次用1000uL 1mol/L NaOH溶液，1000uL 1mol/L HCl溶液，1000uL 1mol/L NaOH溶液，以10uL/s的流速冲洗微流控芯片的液体流路通道和溶液池，再用3000ul超纯水，以10uL/s的流速冲洗微流控芯片的液体流路通道和溶液池；

[0062] 3）以3uL/s的流速向四个进液流动通道11分别通入100uL荧光素酶发光检测液和100uL ATP样品液，即可测得生物发光反应的光子计数响应曲线（3-1）。

[0063] 比较例1

[0064] 参照实施例1~3制作的用于生物化学发光检测的微流控芯片，区别在于不含反光层。参照实施例1~3用于ATP生物发光检测，测得响应曲线(图3-2)。

[0065] 比较例2

[0066] 参照实施例1~3制作的用于生物化学发光检测的微流控芯片，区别在于沟道层上无微混合器，进液流动通道直接汇入检测池。参照实施例1~3用于ATP生物发光检测，测得响应曲线(图3-3)。

[0067] 比较例3

[0068] 参照实施例1~3制作的用于生物化学发光检测的微流控芯片，区别在于不含反光层，且沟道层上无微混合器，进液流动通道直接汇入检测池。参照实施例1~3用于ATP生物发光检测，测得响应曲线(图3-4)。

[0069] 上述实施例只是对本发明技术方案的说明而不是限制，本技术领域中普通技术人员在本技术方案的基础上所作的任何替代都在本发明技术方案的保护范围之内。